Un metodo privo di enzimi per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali mesenchimale derivate dall'Adipo
16 dicembre 2019
Questo protocollo fornisce un metodo privo di enzimi per isolare le cellule staminali mesenchymal da campioni di abdominoplastica e lipoaspirati utilizzando un metodo explant. L'assenza di enzimi duri o passaggi di centrifugazione prevede cellule staminali clinicamente rilevanti che possono essere utilizzate per studi in vitro o trasferite di nuovo alla clinica.
Questo protocollo fornisce un modo semplice ed economico per isolare gli ASC senza l'uso di enzimi aspre o passaggi di centrifugazione, che possono alterare il fenotipo e il comportamento delle cellule. La mancanza di passaggi duri produce cellule meno manipolate di quelle isolate usando enzimi e centrifugazione, riducendo al minimo le domande sul fatto che le osservazioni sperimentali siano un artefatto del metodo di isolamento. Questo metodo di espianto può generare ASC clinici rilevanti da introdurre in un paziente per trattare una varietà di malattie o espandersi nella vita permettersi applicazioni di ricerca.
È difficile spiegare appieno il metodo di tritacarne a parole. La dimostrazione visiva può servire ad altri scienziati il fastidio di imparare a spezzare il tessuto stesso. Metodi di espianto simili possono essere utilizzati per isolare altre popolazioni di MSC, come quelle dei tessuti ombelicali.
Per tritare i campioni di tessuto addominoplastica, prima trasferire il tessuto sul coperchio di una piastra sterile da 100 millimetri. Quindi utilizzare un ago sterile per tenere un pezzo di tessuto in posizione e utilizzare un bisturi sterile per tagliare il tessuto in meno di un millimetro. Trasferire il tessuto su un tubo fresco e invertire o scuotere il campione da cinque a sei volte per garantire la miscelazione di tutti gli strati.
Quindi, con una spatola sterile, trasferire da 2,5 a cinque millilitri di tessuto in una piastra di coltura tissutale trattata con plasma sotto vuoto da 100 millimetri. Misurare il volume del campione versando in un tubo di centrifuga fresco. Quindi, aggiungere un volume equivalente di mezzi di coltura tissutale alla piastra e ruotare delicatamente la piastra per mescolare il contenuto.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al cinque per cento fino a quando un numero sufficiente di cellule non viene visto sulla base della piastra. Una volta notato un numero sufficiente di cellule sulla piastra o dopo sette giorni, a seconda di quale sia prima, rimuovere tutti i restanti pezzi di tessuto. Successivamente, coltura le ASC nei mezzi di coltura tissutale fino a raggiungere il 70% di confluenza o fino a quando i cluster diventano densi a quel punto le cellule devono essere passaggio.
Risciacquare delicatamente la piastra con 1X soluzione salina tamponata con fosfato. Per tripinare le cellule aderenti, aspirare la salina tamponata dal fosfato, aggiungere un millilitro di tripsina integrato con 0,25%EDTA ad ogni piastra e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere una piccola quantità di supporto alla piastra per disattivare la tripina.
Quindi pipettare delicatamente la tripina media dalla parte superiore della piastra verso il basso, persi tutte le cellule debolmente attaccate dalla piastra. Per seminare le cellule, aggiungere prima il supporto alla piastra. Quindi, aggiungere le celle in modo dropwise e quindi ruotare la piastra per garantire una distribuzione uniforme attraverso la piastra.
Dopo tre passaggi, procedere ai test di citometria e differenziazione del flusso. Dopo tre passaggi, asc isolati da campioni di lipoaspirato e addominoplastica hanno una morfologia e fenotipo MSC, simili alle ASC isolate a seguito di una digestione enzimatica. Come altri MSC, gli ASC isolati di explant sono negativi per CD45 e positivi per CD73, CD90 e CD105.
Quando si trita il tessuto, la superficie di ogni pezzo deve essere sufficientemente grande da far migrare gli ASC dal tessuto. Si tratta di cellule staminali fondamentali che possono essere utilizzate per un'ampia gamma di applicazioni. Gli ASC isolati possono essere utilizzati per qualsiasi applicazione a valle, in vivo o in vitro.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo senza enzimi per l'isolamento di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ASCs) da campioni di addominoplastica e lipoaspirato, utilizzando una tecnica ad espianto. Questo approccio riduce al minimo la manipolazione cellulare, garantendo cellule staminali clinicamente rilevanti e adatte a diverse applicazioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Medicina rigenerativa
- Tecniche di isolamento cellulare
Sfondo
- I metodi tradizionali per l'isolamento delle ASC spesso prevedono l'uso di enzimi aggressivi e la centrifugazione.
- Questi metodi possono alterare il fenotipo e il comportamento cellulare.
- Il metodo dell'espianto offre un'alternativa più delicata.
- Le dimostrazioni visive possono facilitare la comprensione del processo di trinciatura del tessuto.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo semplice ed economico per l'isolamento delle ASC.
- Ridurre il rischio di artefatti nelle osservazioni sperimentali causati da tecniche di isolamento invasive.
- Generare ASC clinicamente rilevanti per applicazioni terapeutiche.
Metodi Utilizzati
- Il tessuto di addominoplastica tritato viene coltivato in una piastra per colture cellulari.
- Le cellule vengono incubate a 37°C in un ambiente con CO2.
- Dopo una crescita cellulare sufficiente, i frammenti di tessuto residui vengono rimossi.
- Le cellule vengono sottoposte a passaggio e caratterizzate per la presenza di marcatori delle cellule staminali.
Risultati principali
- Gli ASC isolati mostrano una morfologia e un fenotipo simili a quelli ottenuti mediante digestione enzimatica.
- Gli ASC isolati tramite explant sono negativi per CD45 e positivi per CD73, CD90 e CD105.
- Il metodo fornisce cellule meno manipolate, aumentando l'affidabilità sperimentale.
- Gli ASC possono essere utilizzati per diverse applicazioni successive, sia in vivo che in vitro.
Conclusioni
- Il metodo di espianto è un'alternativa valida per l'isolamento degli ASC.
- Questa tecnica preserva meglio le caratteristiche cellulari rispetto ai metodi tradizionali.
- Gli ASC isolati hanno un ampio potenziale per applicazioni nella ricerca e in ambito clinico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo metodo di isolamento senza enzimi affronta una sfida fondamentale nella medicina rigenerativa: ottenere cellule staminali mesenchimali clinicamente rilevanti senza introdurre artefatti derivanti da processi enzimatici o meccanici aggressivi. Preservando il fenotipo e la funzione cellulari nativi, l'approccio aumenta l'affidabilità predittiva nelle applicazioni successive, come la modellizzazione delle malattie e lo screening terapeutico. Il metodo sostiene i flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui la riduzione del rischio biologico e la validazione degli obiettivi dipendono da fonti cellulari affidabili e sottoposte a manipolazione minima.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante cellule staminali derivate dal tessuto adiposo con multipotenza e profili di marcatori di superficie preservati.
- Valore operativo: Riduce la variabilità dei risultati sperimentali eliminando le alterazioni fenotipiche indotte dagli enzimi.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione del rischio biologico generando cellule meno manipolate per saggi di validazione dell'obiettivo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Produce cellule staminali derivate dal tessuto adiposo adatte a saggi in vitro standardizzati che richiedono fenotipi mesenchimali costanti.
- Valore operativo: Favorisce la pronta disponibilità delle cellule per saggi mediante espansione basata su espianti, che mantiene la positività per CD73, CD90 e CD105.
- Scalabilità: Consente una produzione riproducibile di cellule per lo screening di composti e studi meccanicistici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce una fonte cellulare clinicamente rilevante, allineata alle applicazioni della medicina rigenerativa.
- Modello preclinico: Permette la generazione di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo per sistemi pertinenti alle malattie, senza esposizione a enzimi xenogeni.
- De-risking meccanicistico: Riduce le preoccupazioni riguardo agli artefatti di isolamento che potrebbero influenzare le valutazioni della differenziazione o della funzione immunomodulatrice.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'isolamento iniziale delle cellule staminali alla validazione preclinica, sostenendo flussi di lavoro in cui l'integrità della fonte cellulare influisce sull'affidabilità dei dati e sulle decisioni di avanzamento o interruzione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo cellule staminali derivate dal tessuto adiposo con morfologia e fenotipo simili a quelli nativi.
- Screening: Fornisce cellule standardizzate e pronte per l'espansione, adatte a piattaforme saggio che richiedono caratteristiche di cellule stromali mesenchimali.
- Analisi: Permette l'uso della citometria a flusso e di saggi di differenziamento dopo tre passaggi per confermare l'identità delle cellule staminali.
- Ricerca traslazionale: Collega l'isolamento al potenziale terapeutico attraverso la conservazione di proprietà cellulari clinicamente rilevanti.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile e priva di enzimi per la produzione di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo gli artefatti indotti dall'isolamento negli esperimenti sulle cellule staminali.
- Valore operativo: Offre un protocollo semplice ed economico, senza dipendenza da enzimi costosi o centrifugazione.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione grazie a una maggiore fiducia nei risultati dei saggi cellulari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta l'avanzamento con adeguata valutazione del rischio fornendo cellule staminali mesenchimali affidabili per la valutazione preclinica.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede una tecnica asettica e attrezzature di base per colture cellulari per il trinciamento meccanico e la coltura di espianti.
- Richiede strumenti sterili, tra cui bisturi, aghi e spatole, per la preparazione del tessuto.
- Necessita di condizioni standardizzate di incubazione a 37°C con 5% di CO2 per una crescita cellulare ottimale.
- Comporta il passaggio manuale in base alla confluenza o alla densità degli aggregati dopo la rimozione iniziale del tessuto.
- Si basa sulla citometria a flusso e sui saggi di differenziamento per la conferma fenotipica dopo l'isolamento.
