Name: Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Scopri la procedura operativa standard per la sorveglianza del Lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan. Questo metodo diagnostico aiuta i ricercatori a identificare patogeni zoonotici e a monitorare la salute della fauna selvatica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai e Ya-Lan Li per la loro assistenza durante questo studio. Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione n. 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) del Bureau of Animal and Plant Health Inspection and Quarantine, Council of Agriculture, Executive Yuan, Taiwan.

1. Precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei lyssavirus
<ol><li>Assicurarsi che tutti i lavoratori di laboratorio che gestiscono campioni di pipistrelli ricevano la profilassi di pre-esposizione sulla pilma17. Monitorare i livelli di anticorpi della rabbia dei lavoratori in anticipo e riesaminarli ogni 6 mesi17. La vaccinazione antirabbica di follow-up è necessaria per coloro i cui livelli di anticorpi sono inferiori a 0,5 IU/mL17.</li>
	<li>A seconda delle norme sulla biosicurezza del paese in cui si trova il laboratorio, assicurarsi che le seguenti procedure siano eseguite in laboratori adeguati per il livello di biosicurezza (ad esempio, laboratori BSL-2 nei laboratori di Taiwan e BSL-3 in Australia) e che lavoratori sono attualmente qualificati e indossano adeguate attrezzature di protezione personale18. NOTA: La vaccinazione antirabbica fornisce poca o nessuna protezione dai lissavirus appartenenti ai filogruppi II e III18. I lavoratori devono essere informati che diversi patogeni zoonotici sono stati identificati nei pipistrelli19 e devono gestire campioni in condizioni di laboratorio adeguate a livello di biosicurezza con adeguate attrezzature di protezione personale.</li>
</ol>2. Raccolta di campioni
<ol><li>Uso trovato pipistrelli deboli o malati o carcasse. NOTA: i pipistrelli deboli o malati vengono consegnati alla Bat Conservation Society di Taipei per cure veterinarie o ricerche, mentre le carcasse vengono presentate direttamente all'Animal Health Research Institute. Nessun pipistrelli sani è stato eutanasia in questo programma di sorveglianza.</li>
	<li>Chiedi a un ecologista pipistrello di identificare le specie di pipistrelli attraverso le caratteristiche morfologiche20.</li>
	<li>Eseguire il codice a barre del DNA delle specie di pipistrelli quando viene diagnosticato il virus lyssavirus, utilizzando procedure precedentemente pubblicate21.</li>
	<li>Invia una scheda informativa di ogni carcassa di pipistrello (sito di raccolta, specie, segni clinici, ecc.).</li>
</ol>3. Necropria di campioni di pipistrelli
<ol><li>Preparare i materiali.<ol>
<li>Preparare una tavola di dissezione pulita e posizionare un cuscinetto assorbente sterile per la necropsia.</li>
		<li>Preparare i tubi di raccolta per la raccolta di organi di pipistrello.</li>
		<li>Preparare pinzette e bisturi usa e getta monouso per necropsia. Cambia gli strumenti tra la necropsia di ogni pipistrello. Preparare i batuffoli di cotone inumiditi con il 70% di etanolo per la pulizia di pinzette e bisturi durante il campionamento.</li>
		<li>Preparare due vetrini al microscopio per il FAT. Raccogliere campioni freschi e fissarli in forma per l'esame istopatologico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esaminare tutti gli orifizi esterni prima della necropsia. Fotografa le caratteristiche esterne del pipistrello, in particolare la testa, le orecchie e le ali, per differenziare le specie.</li>
	<li>Raccogliere un campione di tampone orale. Posizionare il pipistrello in recumbency ventrale sulla scheda e fissare la testa del pipistrello con una pinzetta. Tagliare la pelle lungo la linea mediana della calvaria con un bisturi e tirare la pelle ai lati laterali. Tagliare il cranio lungo la linea mediana della calvaria con un bisturi e aprirlo con una pinzetta per esporre il tessuto cerebrale.</li>
	<li>Rimuovere il tessuto cerebrale dal cranio e posizionarlo su un depressore sterile della lingua, e fare macchie di impressione dal tessuto cerebrale (vedere passo 4.2). Raccogliere un piccolo pezzo di tessuto cerebrale fresco e fissarlo in formalina per l'esame istopatologico. Contengono il tessuto cerebrale rimanente in un tubo per l'estrazione dell'acido nucleico.</li>
	<li>Pulire le pinzette e il bisturi con le sfere di cotone inumidite con 70% di etanolo per rimuovere i tessuti conservati tra la raccolta dei campioni.</li>
	<li>Posizionare il pipistrello sulla tavola in recumbency dorsale e fissarlo sulla scheda con aghi su entrambi i lati dell'ascellazione e tallone coda.</li>
	<li>Incise la pelle lungo la linea mediana del corpo dalla mandibola all'ano. Sollevare e separare la pelle e i tessuti muscolari sottostanti con una pinzetta. Raccogliere le ghiandole salivari, che sono vicino all'osso mandibolare.</li>
	<li>Sollevare leggermente lo sterno con una pinzetta e tagliare lo sterno e la parete addominale lungo la linea mediana con un bisturi. Tagliare le clavidi con un bisturi. Fissare le gabbie toraciche sinistra e destra sulla tavola con aghi per aprire la cavità toracica.</li>
	<li>Registrare le lesioni lorde e il grado di cambiamento post-mortem.</li>
	<li>Rimuovere i tessuti viscerali (ad esempio, cuore, polmoni, fegato, reni, intestini) dalla carcassa utilizzando una pinzetta e un bisturi. Raccogliere gli esemplari viscerali come necessario per la ricerca futura. NOTA: si consiglia la raccolta di campioni duplicati. Uno dovrebbe essere raccolto per la diagnosi molecolare, e l'altro dovrebbe essere congelato a -80 gradi centigradi con o senza mezzo di trasporto virale per la coltura virale22.</li>
</ol>4. Test anticorpale fluorescente diretto (FAT)
<ol><li>Fare impressione strisci del tessuto cerebrale per il FAT. Eseguire il FAT come descritto in precedenza18,23 con le seguenti modifiche.</li>
	<li>Separare delicatamente il tessuto cerebrale dal tessuto nervoso collegato con una pinzetta e trasferire il tessuto cerebrale a un depressore sterile della lingua. Tagliare la sezione trasversale del cervello, compreso il tronco encefalico e il cervelletto18,23. Fai impressione di strisci del tessuto cerebrale toccando leggermente la superficie di taglio del tessuto cerebrale e premi la diapositiva sul tessuto della lente per rimuovere il tessuto in eccesso.</li>
	<li>Fissare i vetrini con acetone a -20 gradi centigradi per 30 min. Asciugare i vetrini testati e i controlli positivi e negativi prima di colorare con coniugato.</li>
	<li>L'utilizzo di ciascuno dei due anticorpi anti-rabsia concordati FITC disponibili in commercio per l'antigene lissavirus colorazione è altamente raccomandato23. Determinare la concentrazione di lavoro del coniugato commerciale prima della prima colorazione. Far cadere i coniugati diluiti attraverso un filtro di siringa 0,45 M sui vetrini e incubare i vetrini a 37 gradi centigradi per 30 min all'interno di una camera bagnata.</li>
	<li>Scolare il coniugato in eccesso dai vetrini e lavare i vetrini con salina con buffer fosfato (PBS) dopo l'incubazione.</li>
	<li>Lasciare cadere una piccola quantità di 10% glicerolo sui vetrini e coprire con vetrini di copertura.</li>
	<li>Esaminare i vetrini con un microscopio fluorescente.</li>
</ol>5. Estrazione di acido nucleico
<ol><li>Aggiungere il volume corretto di MEM-10 (mezzo minimo essenziale integrato con 10% siero bovino fetale) al tessuto cerebrale (10% w/v).</li>
	<li>Omogenea del tessuto cerebrale con una perla d'acciaio da 5 mm in uno strumento omogenizzante e centrifuga a 825 x g per 10 min.</li>
	<li>Estrarre l'acido nucleico, il cui volume finale è di 50 gradi centigradi, entro 200 gradi del super-natante utilizzando il kit di estrazione dell'acido nucleico totale disponibile in commercio con lo strumento.</li>
</ol>6. Analisi RT-PCR e filogenetica
NOTA: Sono stati pubblicati diversi set di primer per rilevare tutti i lissavirus noti o specifici lissavirus. Il protocollo qui descritto è un esempio che il nostro laboratorio utilizza e potrebbe non soddisfare tutte le esigenze sperimentali. Selezionare i primer adatti in base alle esigenze di laboratorio.
<ol><li>Preparare il reagente RT-PCR in un solo passaggio come segue: aggiungere 5 ld di acido nucleico estratto alla miscela di reazione contenente 2,5 l di 10x buffer di reazione, 0,5 l di primer in avanti e indietro (10 M ciascuno), 4 L di 1,25 m dNTP, 0,3 l dell'inibitore di RNase (40 U/L) , 0,3 l di trascrizione inversa (10 U/L), 0,4 l di polimerasi di DNA (5 U/L) e 11,5 l di acqua trattata con DEPC. NOTA: il set di primer utilizzato in questo protocollo è JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') e N165-146 (5'-GCAGGAYTTTACTCATA-3')24. Modificare la preparazione dei reagenti e le condizioni di ciclismo in base ai set di primer utilizzati.</li>
	<li>Eseguire il ciclismo nelle seguenti condizioni: incubazione a 42 gradi centigradi per 40 min; denaturazione iniziale a 94 gradi centigradi per 10 min; 35 cicli di 94 gradi centigradi per 30 s, 55 gradi centigradi per 30 s e 72 gradi centigradi per 30 s; e, infine, un'ulteriore estensione a 72 gradi centigradi per 10 min.</li>
	<li>Utilizzare un altro o più set di primer per aumentare la sensibilità diagnostica.<ol>
<li>Utilizzare N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') e N304R (5'TTGACGAGAAGATTGCTCAT-3')25,26 per preparare il reagente RT-PCR in un solo passaggio come segue: aggiungere 5 l di acido nucleico estratto a una miscela di reazione contenente 5 primer in avanti e in senso inverso (4 m di ciascuno), 5 luna di 1,25 m dNTP, 0,5 l di inibitore di RNase (40 U/L), 0,2 l di trascrizione inversa (10 U/L), 1 l of DNA polymerase (5 U/L) e 23,3 l di acqua trattata con DEPC.</li>
		<li>Eseguire il ciclismo nelle seguenti condizioni: incubazione a 42 gradi centigradi per 40 min; denaturazione iniziale a 95 gradi centigradi per 5 min; 35 cicli di 95 gradi centigradi per 1 min, 55 gradi centigradi per 1 min e 20 s, e 72 gradi centigradi per 1 min; e, infine, un'ulteriore estensione a 72 gradi centigradi per 10 min. NOTA: A seconda delle esigenze di laboratorio, scegliere i primer adatti per la diagnosi. N113F è stato originariamente progettato per l'amplificazione del virus della rabbia, ma potrebbe non funzionare bene per altri lissavirus. Il set di N113F e N304R funziona bene per il virus della rabbia (variante di tasso di furetto di Taiwan) e il lissavirus del pipistrello di Taiwan. Sarà più facile ottenere intere sequenze di nucleoproteine utilizzando l'insieme di primer JW12 e N304R se il lissavirus viene amplificato da entrambi i due set di primer di cui sopra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizzare il prodotto PCR sul 2% di elettroforesi gel agarose e visualizzare con illuminazione della luce UV.</li>
	<li>Sequenziare il prodotto PCR per servizio di sequenziamento commerciale.</li>
	<li>Immettere o caricare la sequenza nella pagina Web dello strumento di ricerca allineamento locale di base Nucleotide (BLAST). Selezionare il database "altri (nr ecc.)" ed entrare nell'organismo come Lyssavirus. Selezionare l'algoritmo MegaBlast ed eseguire il BLAST.</li>
</ol>7. Isolamento dei virus
NOTA: Eseguire l'isolamento del virus quando 1) il FAT o 2) il RT-PCR indica positività.
<ol><li>Omogeneizzare il campione cerebrale in una sospensione del 10% (w/v) in MEM-10. Centrifuga a 825 x g per 10 min.</li>
	<li>Inoculare 200 -L di supernatant con una sospensione di 3 x 106 MNA (neuroblastoma murino) in 1 mL di MEM-10 per 1 h a 37 gradi centigradi con 1% di CO2. Trasferire la sospensione cervello omogenate-cell a un pallone da 25 cm2 e aggiungere 6 mL di MEM-10.</li>
	<li>Coltivare 1 mL di sospensione cervello a cellule omogenee in un vetrino in vetro rivestito in Teflon 4 pozzo con 6 mm di diametro allo stesso tempo.</li>
	<li>Dopo 3-4 giorni di incubazione a 37gradi centigradi con 1% di CO 2, fissare le cellule sul 4 bene scivolare con 100% acetone (v/v).</li>
	<li>Macchiare i vetrini con due anticorpi anti-rabbia coniugati FITC dopo i passi 4.4–4.7. Le cellule vengono infettate quando vengono studiate le inclusioni intracitole. Registrare la percentuale di cellule infette.</li>
	<li>Eseguire la propsinizzazione e la sottocultura della coltura cellulare inoculata quando i vetrini sono macchiati come negativi:<ol>
<li>Rimuovere il mezzo e sciacquare il pallone con 5 mL di PBS.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di ciuffo alla fiaschetta e colpire saldamente il fondo del pallone.</li>
		<li>Aggiungere 6 mL di MEM-10 e sospendere nuovamente le celle.</li>
		<li>Mettere la sospensione cellulare in un nuovo fiaschetta di tessuto (6 mL) e su un 4 pozzetto (1 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 7,4 a 7,6 fino a raggiungere l'infettività al 100%.</li>
	<li>Raccogliere il supernatante dopo 24 h di incubazione.</li>
</ol>

<ol><li>Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuzmin%2C+IV+%22Current+laboratory+techniques+in+rabies+diagnosis%2C+research%2C+and+prevention%2C+volume+1%22">Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1</a>. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).</li>
<li>Aréchiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lyssavirus+in+bat%2C+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li>
<li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes%2C+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+bats%3A+emergence+and+zoonotic+threat%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li>
<li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat%2C+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh%2C+Northern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li>
<li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384(1967).</li>
<li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses+%28Aravan+and+Khujand%29+from+Central+Asia%3A+phylogenetic+relationships+according+to+N%2C+P+and+G+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li>
<li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats%2C+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li>
<li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+for+bat+lyssaviruses%2C+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+surveillance+in+bats%2C+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li>
<li>Reynes, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats%2C+Cambodia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses%2C+northern+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).</li>
<li>Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaplan%2C+MM+%22Laboratory+Techniques+in+Rabies%2C+4th+Ed%22">Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf</a> (2019).</li>
<li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bats+and+their+virome%3A+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorbet%2C+GB+%22The+mammals+of+the+Indomalayan+region%3A+a+systematic+review%22">The mammals of the Indomalayan region: a systematic review</a>. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).</li>
<li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+diversity+in+European+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li>
<li>Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEpstein%2C+JH+%22Bats+and+viruses%3A+a+new+frontier+of+emerging+infectious+diseases%22">Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases</a>. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019).</li>
<li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+%28Pipistrellus+hesperus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li>
<li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrimarchi%2C+CV+%22Rabies%2C+1st+ed%22">Rabies, 1st ed</a>. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).</li>
<li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+%28EBLV-2%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).</li>
<li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li>
<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Questa procedura operativa standard di laboratorio (SOP) fornisce un processo seriale per testare campioni di pipistrelli per la presenza di antigeni lyssavirus a Taiwan. I passaggi chiave includono l'impiego di FAT e RT-PCR. Anche la selezione di campioni adatti e l'isolamento di successo del virus sono importanti. Inoltre, alcuni problemi è stata condotta durante il monitoraggio dei lissavirus pipistrello. La differenza principale era l'animale bersaglio. Inizialmente (2008-2009), gli animali bersaglio della sorveglian...

I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici. Ci sono almeno sette specie di lyssavirus associate a casi umani1. Oltre alle 16 specie di questo genere1,2,3, Taiwan pipistrello lyssavirus (TWBLV)4 e Kotalahti pipistrello lyssavirus5 sono stati recentemente identificati in pipistrelli, ma i loro stati tassonomici devono ancora essere determinato.
I pipistrelli sono i padroni naturali della maggior parte dei lissavirus, con l'eccezione di Mokola lyssavirus e Ikoma lyssavirus, che non sono ancora stati identificati in alcun pipistrelli1,2,3,6. Le informazioni sui lyssavirus nei pipistrelli asiatici sono ancora limitate. Due lissavirus non caratterizzati in pipistrelli asiatici (uno in India e l'altro in Thailandia)7,8 sono stati segnalati. Un caso di rabbia umana associato a un morso di pipistrello in Cina è stato segnalato nel 2002, ma la diagnosi è stata fatta solo dall'osservazione clinica9. In Asia centrale, Aravan lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dalle ere di topo minore (Myotis blythi) in Kirghizistan nel 1991, e Khujand lyssavirus è stato identificato nel pipistrello baffi (Myotis mystacinus) in Tagikistan nel 200110. In Asia meridionale, Gannoruwa pipistrello lyssavirus è stato identificato nella volpe volante indiana (Pteropus medius) in Sri Lanka nel 20153. Nel sud-est asiatico, diversi studi sierologici sui pipistrelli nelle Filippine, Thailandia, Bangladesh, Cambogia e Vietnam hanno mostrato una sieroprevalence variabile11,12,13,14, 15. Anche se Irkut lyssavirus è stato identificato nel pipistrello dal muso tubolare maggiore (Murina leucogaster) nella provincia di Jilin, Cina nel 201216, le specie e le posizioni esatte dei lissavirus nelle popolazioni di pipistrelli dell'Asia orientale rimangono sconosciute.
Per valutare la presenza di lyssavirus nelle popolazioni taiwanesi di pipistrelli, è stato avviato un programma di sorveglianza che impiega sia il FAT diretto che il RT-PCR. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan è stato identificato in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus)4 nel 2016-2017. Nel presente articolo, viene introdotta una procedura operativa standard di laboratorio per la sorveglianza del virus lissavirus della popolazione di pipistrelli a Taiwan. Il diagramma di flusso della diagnosi di bat lyssavirus nel nostro laboratorio è presentato in Figura 1.

<table><tbody><tr><td>2,5% Tripsina (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Tripsina</td></tr><tr><td>25 cm2 pallone</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio I</td><td>VWR Life Science</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Alcool</td><td>NIHON SHIYAKU REAGENTE</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV Trascrittasi inversa</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Blade</td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di chemiluminanza</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M Provetta</td><td></td></tr><tr><td>di raccolta</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Provetta di raccolta</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino di copertura</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di DNA</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Anti-rabbia Globulina monoclonale</td><td>Fujirebio Diagnostic Inc.</td><td>800-092</td><td>Anticorpi antirabbici coniugati FITC: reagente B</td></tr><tr><td>Vetrino in vetro con rivestimento in teflon a quattro pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi su gel</td><td>Major Science</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Incubatore Gibco</td><td>14175095</td><td>tripsina</td></tr><tr><td></td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>LIGHT DIAGNOSTICS Reagente per la rabbia Reagente per grassi</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>Anticorpi antirabbici coniugati FITC: reagente A</td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact Instrument</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Pure Compact NA Isolation Kit 1</td><td></td><td>Roche 03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM soluzione vitaminica</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Ago</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Sintesi del primer</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasina ribonucleasi</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Servizio di sequenziamento</td><td>Mission Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Perline in acciaio inossidabile</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Tampone assorbente sterile</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimerasi</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore</td><td>Applied Biosystems</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Abbassalingua</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Pinzetta</td><td>Tennyson strumento medico in via di sviluppo CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Tartrato di Tilosina</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a taiwan

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

I virus all'interno del genere Lyssavirus sono patogeni zoonotici, e almeno sette specie di lyssavirus sono associati a casi umani. Poiché i pipistrelli sono serbatoi naturali della maggior parte dei lissavirus, un programma di sorveglianza del lyssavirus di pipistrelli è stato condotto a Taiwan dal 2008 per capire l'ecologia di questi virus nei pipistrelli. In questo programma, organizzazioni non governative di conservazione dei pipistrelli e centri locali di controllo delle malattie animali hanno collaborato per raccogliere pipistrelli morti o pipistrelli che muoiono di debolezza o malattia. I tessuti cerebrali dei pipistrelli sono stati ottenuti attraverso necroscopia e sottoposti a test anticorpali fluorescenti diretti (FAT) e reazione a catena di trascrizione inversa (RT-PCR) per il rilevamento di antigeni lissavirus e acidi nucleici. Per il FAT, si raccomandano almeno due diverse diagnosi di rabbia. Per la RT-PCR, due serie di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) vengono utilizzati per amplificare una sequenza parziale del gene della nucleovirusproteina della lissa. Questo programma di sorveglianza monitora i lyssavirus e altri agenti zoonotici nei pipistrelli. Il lissavirus pipistreavirus di Taiwan si trova in due casi di pipistrelle giapponese (Pipistrellus abramus) nel 2016-2017. Questi risultati dovrebbero informare il pubblico, gli operatori sanitari e gli scienziati sui potenziali rischi di contattare pipistrelli e altri animali selvatici.

Dal 2014 al maggio 2017 sono state raccolte 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie per la sorveglianza. Due sono risultati positivi. Nel primo caso di pipistrello, l'impronta cerebrale è risultata negativa utilizzando ilFAT con uno degli anticorpi commerciali anti-rabies coniugati FITC (Figura 2), mentre gli RT-PCR che impiegano ciascuno dei due set di primer (JW12/N165-146, N113F/N304R) hanno risultati positivi (Figura 3). È stata ottenuta una sequenza di amp...

Questo protocollo introduce una procedura operativa di laboratorio standard per il test diagnostico degli antigeni lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan.

Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Il lyssavirus è un agente patogeno zoo-no-tic. Per valutare la presenza di Lyssavirus nelle popolazioni di pipistrelli taiwanesi, abbiamo avviato un programma di sorveglianza. E ha identificato con successo quattro Lyssavirus dal 2016 al 2018.Questo protocollo è un'introduzione graduale alla sorveglianza vi-al lyssavirus a Taiwan. Speriamo che sarà utile per le ricerche che sono interessati alla sorveglianza vi-al Lyssavirus. È importante collegare il simbolo tac-keg corretto.Un pipistrello morto o morente è più adatto di un pipistrello vivo per la sorveglianza del Lyssavirus. A seconda delle norme di biosicurezza del paese in cui si trova il laboratorio;eseguire le seguenti procedure in un laboratorio adeguato a livello di biosicurezza. E assicurarsi che i ricercatori siano attualmente qualificati e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.Dopo la raccolta di pipistrelli o carcasse deboli o malati, un ecologista pipistrello identifica le specie di pipistrelli in base alle caratteristiche morfologiche dell'esemplare. Presentare una scheda informativa al laboratorio, che includa il sito di raccolta, le specie, i segni clinici e altri dati pertinenti con ciascun campione di pipistrello. Prima di iniziare la necroscopia, esaminare tutti gli orifizi esterni e fotografare le caratteristiche esterne dei pipistrelli, in particolare la testa, le orecchie e le ali per la differenziazione delle specie.Per raccogliere un campione di tampone orale posizionare il pipistrello in recumbency ventrale su una tavola di dissezione sterile e fissare la testa con una pinzetta. Utilizzare un bisturi per tagliare la pelle lungo la linea mediana dell'area del polpaccio;e tirare la pelle ai lati laterali, per fare un'incisione nel cranio lungo la linea mediana della zona del polpaccio. Aprire il cranio con una pinzetta per esporre il tessuto cerebrale e utilizzare le pinzette per separare delicatamente il tessuto cerebrale dal tessuto nervoso collegato.Tagliare la sezione trasversale del cervello, incluso il tronco encefalico e il cervelletto, e toccare leggermente la superficie tagliata del tessuto cerebrale con diapositive di vetro per fare impressioni di striscio. Premere la diapositiva sul tessuto dell'obiettivo per rimuovere il tessuto in eccesso e fissare le diapositive di impronta di striscio in meno 20 gradi celsius acetone per 30 minuti. Quindi fissare un piccolo pezzo di tessuto cerebrale fresco, in formalina, per l'esame istopatologico.E posizionare il resto del tessuto in emi-em 10 per l'estrazione di acido nucleico. Successivamente, incidere la pelle dalla varietà all'ano lungo la linea mediana del corpo e utilizzare le pinzette per sollevare e separare la pelle e sottolineare i tessuti muscolari;per consentire la raccolta delle ghiandole salivari, situate vicino all'osso mandibolare. Sollevando leggermente lo sterno con le pinzette, utilizzare il bisturi per tagliare lo sterno e la parete addominale lungo la linea mediana e tagliare le claviole.Utilizzare aghi per fissare le gabbie toraciche sinistra e destra alla scheda di dissezione, per aprire la cavità toracica. E registra le legioni lorde e il grado di cambiamento post mortem. Quindi utilizzare le pinzette e il bisturi per rimuovere i tessuti viscerali a caso per l'analisi a valle pianificata.Per eseguire un test diretto degli anticorpi fluorescenti al termine della fissazione, asciugare le diapositive di impronta di striscio e selezionare almeno due anticorpi antira rabbia coniugati a fluorescenza per l'analisi. Filtrare un anticorpo su ogni diapositiva attraverso un colino da 0,45 micrometri. E incubare le diapositive per 30 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umida.Al termine dell'incubazione, scolare il coniugato in eccesso e lavare gli scivoli con PBS. Quindi utilizzare un piccolo volume di 10%glicerolo per montare i coperchi sulle diapositive e immagini le diapositive mediante microscopia a fluorescenza. Quando il test degli anticorpi fluorescenti o l'analisi RT-PCR indicano positività, omogeneizzare il campione cerebrale nella sospensione del 10% nell'emi-en 10 e sedimentare i tessuti per centrifugazione.Inoculare 200 microlitri del super-nat-en con tre volte 10 al 6° neuroblastoma del topo e un millilitro di emi-en 10 per un'ora a 37 gradi celsius e 1% di anidride carbonica. E trasferire la sospensione cerebrale a cellule omogenee in un pallone quadrato di 25 centimetri, contenente sei millilitri di emi-en fresco 10. A un millilitro di sospensione cerebrale a cellule omogenee in uno scivolo di vetro rivestito in Teflon a quattro pozzetti, con un diametro di sei millimetri e posizionare lo scivolo a 37 gradi celsius e 1% di anidride carbonica per tre o quattro giorni.Dopo la fissazione con acetone al 100%, macchiare le diapositive con gli stessi due anticorpi antira rabbia coniugati a fluorescenza utilizzati per il test degli anticorpi a fluorescenza. E visualizzare le diapositive mediante microscopia fluorescente per determinare il numero di inclusioni intracida-plas-mic. Dopo aver tripistinato e sotto-coltivato la coltura cellulare inoculata secondo protocolli standard, restituire la coltura fredda all'incubatore di coltura cellulare per altri tre o quattro giorni con conteggio ripetuto del numero di cellule infette come appena dimostrato fino al raggiungere un'infettività del 100%.Da gennaio 2014 a maggio 2017, sono state raccolte per la sorveglianza 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie. In questa analisi rappresentativa di due casi di pipistrello positivi, l'impressione cerebrale è risultata negativa utilizzando il test degli anticorpi fluorescenti con uno degli anticorpi antira rabbia coniugati commerciali e adatti, mentre l'RT-PCR che impiega ciascuno dei due diversi set di primer ha dato risultati positivi. La sottosezione della sequenza ampli-con ottenuta all'esecuzione di query nel database della banca gen ha rivelato che la sequenza era simile ai lissavirus con identità inferiori al 79% che supportano l'identità dei lissavirus rilevati.Due lissavirus sono stati successivamente isolati con successo dai due cervelli come confermato dal test e dal sequenziamento degli anticorpi a fluorescenza. Il passo chiave per determinare la positività del Lyssavirus sono il test degli anticorpi a fluorescenza e l'analisi RT-CPR. L'uso di due o più anticorpi anti-rabbia nei set di primer è altamente raccomandato.Oltre al Lyssavirus altri agenti patogeni dei pipistrelli zoo-non-ical possono essere monitorati utilizzando metodi diagnostici chiusi. I dati possono quindi essere utilizzati per informare il pubblico sull'evitare il contatto con i pipistrelli. Più siamo in grado di studiare il bat Lyssavirus, più saremo in grado di comprenderne l'evoluzione e l'impatto sulla salute pubblica.

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

Infezioni da arbovirus come strumenti di Screening per l'identificazione di fattori virali immunomodulatori e Host antivirale

È stata sviluppata una reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa nidificata di Pan-Lyssavirus per rilevare in modo specifico tutti i Lyssaviruses conosciuti. La validazione utilizzando campioni di cervello di rabbia di diverse specie animali ha mostrato che questo metodo ha una sensibilità e una specificità equivalenti al test anticorpale fluorescente standard oro e potrebbe essere utilizzato per la diagnosi di rabbia di routine.

Valutazione di una reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa nidificata universale per la rilevazione di Lyssaviruses

Questo è un protocollo per la preparazione ottimale dei tessuti per analisi genomiche, trascrittomiche e proteomiche di pipistrelli catturati in natura. Esso comprende protocolli per la cattura pipistrello e la dissezione, la conservazione dei tessuti, e la coltura cellulare del tessuto pipistrello.

Raccolta di tessuti di pipistrelli per -Omics Analyses e Primary Cell Culture

Questo RT-PCR in tempo reale utilizzando dsDNA tintura intercalating è adatto per diagnosticare le infezioni da lyssavirus. Il metodo inizia con l'RNA estratto dalla rabbia sospetti campioni ante mortem o post-mortem, dettagliando la preparazione del mix master, l'aggiunta di RNA, l'impostazione della macchina in tempo reale e la corretta interpretazione dei risultati.

Pan-lyssavirus in tempo reale RT-PCR per la diagnosi di rabbia

Presentiamo un protocollo completo per la diagnosi post-mortem della rabbia animale in condizioni di campo utilizzando un rapido test diagnostico immunocromatico (RIDT), dal campionamento della biopsia cerebrale all'interpretazione finale. Descriviamo anche ulteriori applicazioni utilizzando il dispositivo per l'analisi molecolare e la genotipizzazione virale.

Test diagnostico immunocromatico rapido sulla rabbia sul campo per impostazioni limitate alle risorse con ulteriori applicazioni molecolari

Questo protocollo dimostra il test della reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) in tempo reale della trascrizione inversa del pan-lyssavirus LN34 dalla raccolta dei tessuti all'interpretazione dei risultati, compresi gli aggiornamenti alle sequenze e alle formulazioni dei primer per migliorare le prestazioni del test per alcuni lissavirus e lagomorfi non antirabbici. Dimostriamo anche la configurazione del saggio per un formato multiplex LN34 a pozzetto singolo (LN34M).

Diagnosi post-mortem della rabbia negli animali mediante il test di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale LN34 aggiornato e multiplexato

È stato sviluppato un approccio per identificare le condizioni ottimali di concentrazione virale per campioni d'acqua di piccolo volume utilizzando punte di adenovirus umano. Le tecniche qui descritte sono utilizzate per identificare i parametri di concentrazione per altri bersagli virali e applicate alla sperimentazione della concentrazione virale su larga scala.

A Procedura piccolo volume per concentrazione virale da Water

È necessaria un'attenzione particolare utilizzando "tecniche pulite" per raccogliere ed elaborare correttamente campioni d'acqua per studi di metalli in tracce in ambienti acquatici. Viene presentato un protocollo per il campionamento, l'elaborazione e le procedure analitiche con l'obiettivo di ottenere dati di monitoraggio ambientale affidabili e risultati con elevata sensibilità per studi dettagliati sui metalli in tracce.

Pulire campionamento e analisi del fiume e di estuario Acque per Trace Studi di metallo

Plancton e particelle in sospensione giocano un ruolo importante nei cicli biogeochimici nell'oceano. Qui, forniamo un metodo ultra-pulito, basso sforzo per la raccolta di varie dimensioni delle particelle e plancton in mare con la capacità di gestire grandi volumi di acqua di mare.

Un apparato multistrato ultra-pulito per la raccolta di plancton marino dimensioni frazionato e particelle in sospensione

Vi presentiamo un protocollo per la sintesi degli zuccheri C5 (xilosio e arabinosio) da un rinnovabile biomassa lignocellulosica non commestibili (cioè, iuta) con la presenza di Brønsted Acidi liquidi ionici (balle) come il catalizzatore in acqua. Il catalizzatore BAILs ha esibito prestazioni migliori catalitica di catalizzatori acidi minerali convenzionali (H2SO4 e HCl).

Un nuovo metodo per l'analisi di pentosano presente nella biomassa di iuta e la relativa conversione in monomeri di zucchero utilizzando acido liquido ionico

Scopri la procedura operativa standard per la sorveglianza del Lyssavirus nei pipistrelli a Taiwan. Questo metodo diagnostico aiuta i ricercatori a identificare patogeni zoonotici e a monitorare la salute della fauna selvatica.

Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

Esplora altri video