Procedura operativa standard per la sorveglianza lyssavirus della popolazione bat a Taiwan

Il lyssavirus è un agente patogeno zoo-no-tic. Per valutare la presenza di Lyssavirus nelle popolazioni di pipistrelli taiwanesi, abbiamo avviato un programma di sorveglianza. E ha identificato con successo quattro Lyssavirus dal 2016 al 2018.

Questo protocollo è un'introduzione graduale alla sorveglianza vi-al lyssavirus a Taiwan. Speriamo che sarà utile per le ricerche che sono interessati alla sorveglianza vi-al Lyssavirus. È importante collegare il simbolo tac-keg corretto.

Un pipistrello morto o morente è più adatto di un pipistrello vivo per la sorveglianza del Lyssavirus. A seconda delle norme di biosicurezza del paese in cui si trova il laboratorio;eseguire le seguenti procedure in un laboratorio adeguato a livello di biosicurezza. E assicurarsi che i ricercatori siano attualmente qualificati e indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.

Dopo la raccolta di pipistrelli o carcasse deboli o malati, un ecologista pipistrello identifica le specie di pipistrelli in base alle caratteristiche morfologiche dell'esemplare. Presentare una scheda informativa al laboratorio, che includa il sito di raccolta, le specie, i segni clinici e altri dati pertinenti con ciascun campione di pipistrello. Prima di iniziare la necroscopia, esaminare tutti gli orifizi esterni e fotografare le caratteristiche esterne dei pipistrelli, in particolare la testa, le orecchie e le ali per la differenziazione delle specie.

Per raccogliere un campione di tampone orale posizionare il pipistrello in recumbency ventrale su una tavola di dissezione sterile e fissare la testa con una pinzetta. Utilizzare un bisturi per tagliare la pelle lungo la linea mediana dell'area del polpaccio;e tirare la pelle ai lati laterali, per fare un'incisione nel cranio lungo la linea mediana della zona del polpaccio. Aprire il cranio con una pinzetta per esporre il tessuto cerebrale e utilizzare le pinzette per separare delicatamente il tessuto cerebrale dal tessuto nervoso collegato.

Tagliare la sezione trasversale del cervello, incluso il tronco encefalico e il cervelletto, e toccare leggermente la superficie tagliata del tessuto cerebrale con diapositive di vetro per fare impressioni di striscio. Premere la diapositiva sul tessuto dell'obiettivo per rimuovere il tessuto in eccesso e fissare le diapositive di impronta di striscio in meno 20 gradi celsius acetone per 30 minuti. Quindi fissare un piccolo pezzo di tessuto cerebrale fresco, in formalina, per l'esame istopatologico.

E posizionare il resto del tessuto in emi-em 10 per l'estrazione di acido nucleico. Successivamente, incidere la pelle dalla varietà all'ano lungo la linea mediana del corpo e utilizzare le pinzette per sollevare e separare la pelle e sottolineare i tessuti muscolari;per consentire la raccolta delle ghiandole salivari, situate vicino all'osso mandibolare. Sollevando leggermente lo sterno con le pinzette, utilizzare il bisturi per tagliare lo sterno e la parete addominale lungo la linea mediana e tagliare le claviole.

Utilizzare aghi per fissare le gabbie toraciche sinistra e destra alla scheda di dissezione, per aprire la cavità toracica. E registra le legioni lorde e il grado di cambiamento post mortem. Quindi utilizzare le pinzette e il bisturi per rimuovere i tessuti viscerali a caso per l'analisi a valle pianificata.

Per eseguire un test diretto degli anticorpi fluorescenti al termine della fissazione, asciugare le diapositive di impronta di striscio e selezionare almeno due anticorpi antira rabbia coniugati a fluorescenza per l'analisi. Filtrare un anticorpo su ogni diapositiva attraverso un colino da 0,45 micrometri. E incubare le diapositive per 30 minuti a 37 gradi Celsius in una camera umida.

Al termine dell'incubazione, scolare il coniugato in eccesso e lavare gli scivoli con PBS. Quindi utilizzare un piccolo volume di 10%glicerolo per montare i coperchi sulle diapositive e immagini le diapositive mediante microscopia a fluorescenza. Quando il test degli anticorpi fluorescenti o l'analisi RT-PCR indicano positività, omogeneizzare il campione cerebrale nella sospensione del 10% nell'emi-en 10 e sedimentare i tessuti per centrifugazione.

Inoculare 200 microlitri del super-nat-en con tre volte 10 al 6° neuroblastoma del topo e un millilitro di emi-en 10 per un'ora a 37 gradi celsius e 1% di anidride carbonica. E trasferire la sospensione cerebrale a cellule omogenee in un pallone quadrato di 25 centimetri, contenente sei millilitri di emi-en fresco 10. A un millilitro di sospensione cerebrale a cellule omogenee in uno scivolo di vetro rivestito in Teflon a quattro pozzetti, con un diametro di sei millimetri e posizionare lo scivolo a 37 gradi celsius e 1% di anidride carbonica per tre o quattro giorni.

Dopo la fissazione con acetone al 100%, macchiare le diapositive con gli stessi due anticorpi antira rabbia coniugati a fluorescenza utilizzati per il test degli anticorpi a fluorescenza. E visualizzare le diapositive mediante microscopia fluorescente per determinare il numero di inclusioni intracida-plas-mic. Dopo aver tripistinato e sotto-coltivato la coltura cellulare inoculata secondo protocolli standard, restituire la coltura fredda all'incubatore di coltura cellulare per altri tre o quattro giorni con conteggio ripetuto del numero di cellule infette come appena dimostrato fino al raggiungere un'infettività del 100%.

Da gennaio 2014 a maggio 2017, sono state raccolte per la sorveglianza 332 carcasse di pipistrelli di 13 specie. In questa analisi rappresentativa di due casi di pipistrello positivi, l'impressione cerebrale è risultata negativa utilizzando il test degli anticorpi fluorescenti con uno degli anticorpi antira rabbia coniugati commerciali e adatti, mentre l'RT-PCR che impiega ciascuno dei due diversi set di primer ha dato risultati positivi. La sottosezione della sequenza ampli-con ottenuta all'esecuzione di query nel database della banca gen ha rivelato che la sequenza era simile ai lissavirus con identità inferiori al 79% che supportano l'identità dei lissavirus rilevati.

Due lissavirus sono stati successivamente isolati con successo dai due cervelli come confermato dal test e dal sequenziamento degli anticorpi a fluorescenza. Il passo chiave per determinare la positività del Lyssavirus sono il test degli anticorpi a fluorescenza e l'analisi RT-CPR. L'uso di due o più anticorpi anti-rabbia nei set di primer è altamente raccomandato.

Oltre al Lyssavirus altri agenti patogeni dei pipistrelli zoo-non-ical possono essere monitorati utilizzando metodi diagnostici chiusi. I dati possono quindi essere utilizzati per informare il pubblico sull'evitare il contatto con i pipistrelli. Più siamo in grado di studiare il bat Lyssavirus, più saremo in grado di comprenderne l'evoluzione e l'impatto sulla salute pubblica.