Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4^- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

L'HIV è incurabile a causa della sua persistenza nei serbatoi cellulari e anatomici. Questo metodo consente una valutazione del serbatoio dell'HIV delle cellule immunitarie isolate dai polmoni. Questa tecnica consente l'isolamento delle cellule T mucose polmonari e dei macrofagi alveolari dal fluido BAL per un'ulteriore valutazione fenotipica o virologica come serbatoi cellulari di HIV.

Comprendere la biologia dei macrofagi alveolari e delle cellule T cd4-positive e il loro contributo al serbatoio dell'HIV potrebbe portare a importanti approfondimenti sulle sfide che una cura per l'HIV deve affrontare. L'isolamento dei macrofagi primari dal BAL può essere applicato a varie altre aree di ricerca, tra cui malattie polmonari infiammatorie o infettive come asma e tubercolosi. Dopo aver ottenuto il fluido BAL da un paziente umano secondo protocolli standard, vortice il fluido nel tubo di raccolta originale prima di trasferire il campione in un tubo da 50 millilitri all'interno di un armadio di biosicurezza.

Se il fluido appare molto torbido o contaminato da tessuto filamentoso, filtrare il campione attraverso un filtro a rete di nylon da 70 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, trasferire il supernatante su un nuovo tubo da 50 millilitri e utilizzare una punta di pipetta per rompere delicatamente il pellet contenente tutte le celle BAL. Rimescolare il pellet in un millilitro di RPMI 1640 medium e aggiungere un millilitro del supernatante riservato di ciascuno dei tubi microcentrifuge da 10 1,5 millilitri.

Aggiungere aliquote da 10 millilitri del supernatante rimanente in tubi conici da 15 millilitri e posizionare tutti i campioni supernatanti nello stoccaggio di meno 80 gradi Celsius. Diluire la sospensione della cella a pellet in 10 millilitri di mezzo per ogni 25 millilitri di campione originale e raccogliere le cellule BAL per centrifugazione. Quindi resuspend il pellet in un millilitro di mezzo integrato con siero bovino fetale al 10%, o FBS, per il conteggio.

Per lo smistamento di bal intero e di cellule mononucleari del sangue periferico, aggiungere cinque volte 10 alle cinque cellule a ciascuno dei due tubi di polistirolo a fondo rotondo da cinque millilitri per sottoinsieme per i controlli di compensazione non macchiati e macchiati di vitalità e aggiungere il resto di ciascun campione di sottoinsieme in un tubo a cinque millilitri per campione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimorsizzare i pellet di controllo in 100 microlitri di PBS per tubo sul ghiaccio fino a quando non vengono utilizzati. Risostimato i pellet delle cellule per lo smistamento in 250 microlitri di una diluizione su 20 del tampone di blocco del recettore Fc per un'ora a quattro gradi Celsius per bloccare qualsiasi legame non specifico.

Alla fine dell'incubazione di blocco, aggiungere il cocktail anticorpale appropriato di interesse per un'incubazione aggiuntiva di un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione dell'anticorpo primario, aggiungere un millilitro di PBS a ciascun tubo per la centrifugazione e risospendare i pellet in 250 microlitri di tampone di cernita su ghiaccio protetto dalla luce fino allo smistamento. Per preparare i controlli di compensazione, aggiungere tre gocce ciascuna delle perle di compensazione kappa di immunoglobulina anti-topo e le perline di compensazione del controllo negativo per un millilitro di PBS a un tubo di microcentrifugo e trasferire 100 microlitri della soluzione di perline in ciascun campione da utilizzare per la compensazione.

Aggiungere un microlitro di ciascun anticorpo nel cocktail a ciascun tubo separato contenente perline e aggiungere un microlitro di macchia di vitalità a ciascun tubo di controllo della compensazione della macchia di vitalità. Dopo 20 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce, lavare i campioni con un millilitro di PBS per tubo e rimorsi i pellet in 250 microlitri di PBS fresco per tubo. Caricare il campione di controllo non contaminato della cella BAL intera sul citometro di flusso e impostare la matrice di compensazione.

Quindi caricare il tubo campione e ordinare le celle a bassa pressione, gating per escludere il rumore, includere celle live e CD45-positive ed escludere i farsa. All'interno della più grande popolazione mieloide, ordinare le cellule doppio-positive CD206 e CD169 come macrofagi alveolari. All'interno della più piccola popolazione di linfociti, isolare le cellule positive del CD3 e ordinare le popolazioni mono-positive CD4 e CD8.

Per ordinare il campione di cellule mononucleari del sangue periferico, gate per escludere il rumore e i farsa e includere le cellule positive del CD45 in diretta come dimostrato. Dopo aver gating su CD3, gate le cellule CD3-negative, CD14-positive per ordinare i monociti single-positivi e gate le cellule CD3-positive, CD4 e CD8-positive per ordinare entrambe le popolazioni mono-positive. Quando si conta l'intero campione di BAL, è possibile visualizzare diversi tipi di cellule, tra cui macrofagi più grandi e rotondi e linfociti più piccoli e rotondi.

I macrofagi sono il tipo di cellula più abbondante nel fluido BAL, rappresentando circa l'85% delle cellule nei polmoni non fumatori. Queste cellule sono arricchite nei fumatori al punto da sembrare quasi esclusive e tendono ad essere ingrandite di circa il 40% rispetto ai macrofagi osservati nei non fumatori. I marcatori utilizzati per lo smistamento dei macrofagi alveolari da campioni di liquido BAL sono stati scelti sulla base di fenotipi precedentemente descritti di macrofagi alveolari, come il recettore del mannosio CD206 che è presente sulle cellule fagocitiche e il recettore della sialoadessina CD169.

Dopo il loro isolamento, i macrofagi alveolari e altri tipi di cellule possono essere utilizzati per l'immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso, test funzionali immunologici o quantificazione del serbatoio da parte della PCR ultrasensibile. Questa tecnica consente l'accesso a macrofagi altamente puri residenti nei tessuti, che storicamente sono stati difficili da raggiungere, consentendo l'esame precedentemente irraggiungibile della significativa popolazione di cellule immunitarie.