Tecnologia CRISPR/Cas9 nel ripristino dell'espressione della distrofina nei progenitori muscolari derivati da iPSC

Duchenne è una distrofia muscolare che causa l'esaurimento prematuro delle cellule progenitrici muscolari. È una delle distrofie muscolari più gravi. Per promuovere una rigenerazione muscolare funzionale, utilizziamo l'editing genico mediato CRISPR /Cas9 per ripristinare l'espressione di distrofica nelle cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte.

L'editing genico CRISPR-Cas9 ha il potenziale per ripristinare l'espressione genica della distrofica. Le cellule progenitrici muscolari derivate da iPSC autologhe possono reintegrare il poro delle cellule staminali, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. Diversi agenti delle cellule iPS nelle cellule progenitrici miogeniche hanno ridotto il rischio di re-genesi tumorale nelle cellule iPS.

Diverse terapie che combinano cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte autologhe con correzione genetica mediata da CRISPR-Cas9 sono promettenti strategie di trattamento della distrofia muscolare di Duchenne. Questa tecnologia può essere utilizzata per trattare molte malattie congenite modificando geneticamente le cellule staminali autologhe, tra cui cuore, cervello e malattie del sangue. Abbiamo dimostrato che questo approccio può fornire ai lettori esperienza nella gestione della riprogrammazione cellulare e dell'editing genico, che rimane una sfida.

Al microscopio rovesciato, esaminare le colonie di cellule staminali embrionali di topo infette. Segna le colonie nella parte inferiore del piatto con il marcatore dell'oggetto auto-inchiodamento. Applicare anelli di clonazione unti per coprire le colonie cellulari contrassegnate.

Aggiungere 100 microlitri dello 0,05%Trypsin-EDTA a ciascun anello di clonazione e posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, trasferire le celle digerite con punte di pipetta da 100 microlitri su piastre di coltura a 48 pozzi contenenti 250 millilitri di mezzo di crescita MES. Incubare le cellule nell'incubatore di 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica e l'85% di umidità.

Quando leggono il 70% di confluenza, selezionare i pozzi con cellule ben coltivate e aggiungere 250 millilitri di soluzione TVP da digerire per 30 minuti. Quindi, trasferire la coltura cellulare da ogni pozzo a un piatto di sei centimetri. Ripetere l'applicazione di anelli di clonazione e incubazione per diverse volte fino a ottenere cloni uniformi a forma di dormitorio.

Ora, digerisci gli IPSC del mouse preparati aggiungendo un millilitro di soluzione TVP. Trasferire la coltura cellulare in una piastra di 24 po 'rivestita con fibronectina e gelatina e incubare a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Dopo che le cellule hanno raggiunto il 50% di confluenza, passare a 500 microlitri di mezzo di coltura fresco contenenti otto microgrammi per millilitro Polibrene.

Quindi, aggiungere 100 microlitri della soluzione di particelle lentivirali agli IPSC del mouse. Incubare le cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Successivamente, determinare la concentrazione minima di Blasticidina e Igromicina B che è a metà tasso di uccisione entro 24 ore.

Aggiungere il supporto di 2,5 microgrammi per millilitro Blasticidina e 100 microgrammi per millilitro Igromicina B nelle cellule, attendere tre giorni e selezionare le cellule che rimangono aderenti come cellule infette di sterco. Digerire gli IPSC del mouse selezionati con 0,5 millilitri di soluzione TVP, ognuno in una nuova piastra da 24 po ', e incubare le cellule per 30 minuti a 37 gradi Celsius con 5%anidride carbonica. Quindi, pipettare gli iPSC in singole celle e contare le celle con una camera di conteggio delle celle.

Selezionare circa 150 singole cellule digerite e diluire con mezzo MES in piatto da 10 centimetri, coltura a 37 gradi Celsius con 5%anidride carbonica. Dopo circa 10 giorni, al microscopio invertito, utilizzare 10 punte di pipetta sterile a microlitro per raccogliere singole colonie e trasferire ogni colonia in 50 microlitri di soluzione TVP in una piastra da 96 pozzetti. Digerire a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Una raccolta manuale affidabile della clonazione è fondamentale per il successo della raccolta delle cellule staminali pluripotenti indotte modificate CRISPR/Cas9. Quindi, trasferire e dividere le cellule digerite da ogni pozzo in altre due piastre di coltura da 96 pozzi. Incubare a 37 gradi Celsius fino al 70% confluente.

Con le colonie cellulari al 70% di confluenza, rimuovere il mezzo nella piastra da 96 pozzi. Aggiungere 25 microlitri di reagente di lisi contenenti soluzione 1%Proteinasi K ad ogni pozzo e trasferire il lisato in un'altra piastra PCR da 96 porri. Sigillare la piastra PCR con guarnizioni adesive e incubare la piastra in un ciclore termico a 55 gradi Celsius per 30 minuti e quindi a 95 gradi Celsius per 45 minuti per lisciviare le cellule e denaturare la Proteinasi K.Quindi, in un tubo PCR, aggiungere due microlitri del litolato, 10 microlitri di 2x DNA Polymerasi Premix, 7 microlitri di acqua priva di DNasi , e un microlitro di primer DMD Exon23.

Avviare la reazione PCR in base al manoscritto. Quindi, caricare la reazione PCR fornita con 2,2 microlitri di buffer di carico su un gel di agarosio al 2%. Far funzionare il gel a 100-150 volt per 30 minuti e ispezionare il gel sotto la luce UV.

In questo protocollo sono state progettate due RNA guida che fiancheggiano il mutante Exon23. Dopo le pause a doppio filamento mediate da Cas9 e l'unione finale non omologa, il mutante Exon23 fu eliminato, consentendo la produzione troncata ma funzionale di distrofina. Per evitare la perdita della soluzione di tripina, dobbiamo applicare il grasso uniformemente sul fondo degli anelli.

La combinazione dell'editing del genoma CRISPR/Cas9 con un sistema di attivazione MyoD attaccato fornisce una strategia sicura, fattibile ed efficace per il trapianto autologo in pazienti con distrofia muscolare di Duchenne con cellule progenitrici basali di recupero genico.