Utilizzo dell'ossido di deuterio come strumento non invasivo e non letale per valutare la composizione corporea e il consumo di acqua nei mammiferi

Utilizzando questo protocollo, l'ossido di deuterio, o D2O, un isotopo non radioattivo e stabile dell'acqua, può essere utilizzato per stimare la composizione corporea e il consumo di acqua. Questa tecnica non è invasiva e quindi può essere utilizzata per valutare la composizione corporea nelle specie in via di estinzione, così come nell'uomo e nelle specie domestiche. Un'applicazione unica della tecnica di diluizione dell'ossido di deuterio è la capacità di misurare il consumo di acqua della fauna selvatica a libera gamma con alti tassi di ricattura o di animali ospitati socialmente.

Sebbene l'anestesia non sia richiesta, potrebbe essere più facile per coloro che non hanno familiarità con l'iniezioni sottocutanee sedare gli animali prima di consegnare l'ossido di deuterio. A dimostrare la procedura con Me e Sarah Hooper ci saranno Amanda Eshelman e Ashley Cowan, studentesse veterinarie, e Alicia Roistacher, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per fare una soluzione stock di 50 millilitri di nove grammi per litro di ossido di deuterio salinato, prima pesare 450 milligrammi di cloruro di sodio di grado farmaceutico e registrare la quantità esatta a quattro cifre decimali.

Trasferire tutto il sale in un becher sterilizzato da 100 millilitri e misurare 50 grammi di ossido di deuterio maggiore o uguale al 99,8% in un cilindro sterile e graduato. Registrare l'esatta quantità di ossido di deuterio in quattro cifre decimali e trasferire l'ossido di deuterio al becher sterile del cloruro di sodio. Successivamente, attaccare un ago calibro 20 a un filtro a disco sterile non crirogenico con pori submicronico dotati di una canna da siringa da 10 millilitri e inserire l'ago nel setto di una fiala sterile, vuota, da 100 millilitri.

Attaccare un tubo sottovuoto a un ago calibro 22 e inserire l'ago nel setto della fiala da 100 millilitri. Quindi caricare 10 millilitri di cloruro di sodio di forza isosmotica nella canna della siringa e accendere lentamente il vuoto fino a quando la soluzione di ossido di deuterio inizia a filtrare lentamente nel flaconcino. Continuare a versare la soluzione di ossido di deuterio nella canna della siringa fino a quando l'intero volume di 50 millilitri non è stato filtrato.

Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi in un pipistrello anestetizzato, utilizzare un tampone di preparazione alcolica per pulire l'uropatagium sulla vena interfemorale e lasciare asciugare la membrana della coda disinfettata. Applicare un sottile strato di vaselina sulla vena interfemorale e utilizzare un ago calibro 29 per forare la porzione dorsale della vena interfemorale. Quindi utilizzare tubi capillari di eparina di sodio di plastica per raccogliere 100 microlitri di sangue.

Per garantire un'adeguata miscelazione del sangue intero con l'eparina di sodio, arrotolare delicatamente ogni tubo dopo la raccolta del sangue prima dell'etichettatura. Dopo aver determinato la massa di ossido di deuterio in grammi da iniettare, caricare una siringa per insulina dotata di un ago calibro 29 con il volume appropriato di ossido di deuterio. Pesare la siringa e l'ago di insulina caricati dal deuterio, registrando il peso a quattro cifre decimali, e iniettare l'intero volume di ossido di deuterio per via sottocutanea sulla regione dorsale dell'anetitizzato.

Si consiglia di utilizzare una bilancia di precisione con uno scudo antistatico e di assicurarsi di tirare indietro sullo stantuffo per garantire una pressione negativa prima dell'iniezione. Immediatamente dopo l'iniezione, pesare la siringa e l'ago di insulina ora vuoti e registrare il peso a quattro cifre decimali. Entro 30 minuti dalla raccolta post-sangue, utilizzare una centrifuga ematocrit per far girare ogni tubo capillare a 10.000 volte g per cinque minuti.

Utilizzando forbici affilate, tagliare il tubo capillare di plastica tra tutto il sangue e il plasma e utilizzare una pipetta da 200 microliter per espellere il plasma direttamente in un tubo di stoccaggio etichettato da 500 microliter. Dopo il periodo di equilibrazione, raccogliere e conservare altri 100 microlitri di sangue dalla vena interfemorale come appena dimostrato. Per l'analisi della spettrofotometria FTIR, impostare la temperatura di un bagno di sabbia a 60 gradi Celsius per facilitare la distillazione e aggiungere 50 microlitri di ogni campione di plasma e standard in singoli tappi microcentrifuge conici da 1,5 millilitri.

Tenendo il tappo microcentrifugo capovolto, avvitare il tubo microcentrifugo conico da 1,5 millilitri sul cappuccio e posizionare il tubo invertito a contatto con la sabbia nel bagno di sabbia per un minimo di 12 ore. La mattina seguente, posizionare un nuovo cappuccio pulito su ogni tubo e pulsare i tubi di microcentrifugo per 10 secondi in un microcentrifugo. Installare una cella di trasmissione liquida nello spettrometro FTIR e riempire la cella di metanolo.

Collegare la porta di iniezione e riempire lentamente la cella con acqua di fondo rimuovendo accuratamente la siringa a metanolo per ridurre il rischio di bolle d'aria. Collegare i tubi alla porta di uscita per consentire la rimozione dei campioni dopo l'analisi e aprire il software dello spettrometro FTIR. Impostare i parametri in base alla tabella e raccogliere un campione di sfondo utilizzando l'acqua distillata filtrata filtrata da 0,22 micrometri.

Iniettare 40 microlitri di zero parti per milione di ossido di deuterio standard e registrare e salvare gli spettri come file di valori separati da virgole. Dopo aver iniettato e salvato gli spettri di tutti gli standard per creare una curva standard, iniettare 40 microlitri di ogni campione distillato nella cella di trasmissione del liquido e salvare gli spettri. Con un tempo di equilibrazione noto, è possibile determinare l'acqua corporea totale, la massa corporea magra e la massa grassa corporea per i grandi pipistrelli marroni catturati allo stato selvatico e i grandi pipistrelli marroni in cattività.

Una massa grassa corporea negativa può essere calcolata a causa di uno o più dei seguenti motivi:non ricevere l'intera dose di ossido di deuterio, diventare torpido durante la fase di equilibrazione, avere masse grasse anormalmente grandi e masse magre minime, o avere meno del tre-5% di grasso corporeo come determinato dalla doppia absorptiometria a raggi X. Qui, viene mostrata una percentuale rappresentativa di grasso corporeo determinata dalla tecnica di diluizione dell'ossido di deuterio rispetto alla doppia absorptiometria a raggi X. Le due tecniche sono ben correlate, con la massa grassa corporea che mostra forti correlazioni tra il grasso corporeo e il peso corporeo e con la tecnica di diluizione dell'ossido di deuterio non costantemente sopra o sottovalutando la massa grassa corporea.

Il metodo di diluizione dell'ossido di deuterio è stato precedentemente convalidato nei gatti e la tecnica è stata adattata per consentire la misurazione del consumo giornaliero di acqua dei gatti ospitati socialmente durante ogni blocco dietetico dell'esperimento. Ricorda che questa tecnica dovrebbe essere eseguita solo su animali sani e che dovresti pesare, registrare e consegnare accuratamente la dose completa di ossido di deuterio a ogni animale. Un metodo secondario per determinare la composizione corporea, come l'analisi completa della carcassa o LASSA, può essere completato per convalidare la tecnica dell'ossido di deuterio.

Questa tecnica ci ha permesso di identificare un gatto socialmente ospitato che consumava quantità di acqua anormalmente elevate senza separare ogni gatto per misurare il loro consumo di acqua.