Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase

I nostri dati dimostrano che l'inibizione transitoria dell'attività della Rho-chinasi migliora l'adesione, la sopravvivenza e l'innesto dei cardiomiociti derivati dall'hiPSC dopo essere stati trapiantati nei cuori degli animali infarsi. Forniamo un metodo semplice, a basso costo, mentre altamente efficiente per aumentare l'innesto di cardiomiociti trapiantati derivati dall'hiPSC nei cuori degli animali feriti. Poiché questa tecnica può migliorare i tassi di innesto cellulare in modo sicuro ed efficiente nell'infarto cardiaco acuto e nell'insufficienza cardiaca, contribuisce ai miglioramenti risultanti nella funzione cardiaca, nelle vascolari e nell'apoptosi.

Sebbene abbiamo testato i nostri protocolli solo in iPSC, questi metodi possono essere applicati ad altri tipi di cellule, come le cellule staminali embrionali, le cellule staminali mesenchimali, eccetera. La dose e la durata del trattamento Y-27632 sono fondamentali. La dimostrazione visiva può dimostrare in dettaglio tutti i passaggi chiave del protocollo, il che è vantaggioso per qualcuno che non ha mai eseguito questa tecnica prima.

Il giorno 21 dopo la differenziazione hiPSC-CM, aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS sterile una volta. Incubare le cellule con 0,5 millilitri di enzimi di dissociazione cellulare per pozzo a 37 gradi Celsius per cinque o sette minuti. Dopo il tempo di incubazione, pipettare ripetutamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da un millilitro per dissociare accuratamente le cellule.

Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione neutralizzante ad ogni pozzo, raccogliere la miscela cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare le cellule nella soluzione neutralizzante. Quindi, ripiantare le cellule su piastre rivestite di gelatina e sei po 'ad una densità di due milioni di cellule per pozzo.

Dopo 24-48 ore, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di purificazione per tre o cinque giorni. Prima del trapianto, coltura le cellule nel gruppo di trattamento per 12 ore in mezzo RB-plus integrato con 10 micromolare Y-27632. Allo stesso modo, eseguire il trattamento con verapamil sulle cellule nel mezzo RB-plus con un micromolo di verapamil per 12 ore.

Dopo il trattamento, lavare l'hiPSC-CRM con PBS una volta e incubare le cellule con 0,5 microlitri di enzimi di dissociazione cellulare per pozzo per un massimo di due minuti. Pipettare ripetutamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da un millilitro per dissociare accuratamente le cellule. Successivamente, neutralizzare le cellule con soluzione neutralizzante, raccogliere la miscela cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g per tre minuti.

Dopo la centrifugazione, resuspend le cellule in PBS ad una concentrazione di 0,1 milioni di cellule per cinque microlitri in preparazione all'iniezione. Immediatamente dopo l'induzione dell'infarto del miocardio, iniettare cinque microlitri di hiPSC-CRM di controllo, Y-27632-cms hiPSC pretrattati, hiPSC-CRM trattati con verapamil o un volume uguale di PBS nel miocardio del mouse in ogni sito, uno nell'area infarto e due nelle aree intorno all'infarto. 12 ore prima di eseguire il rilevamento del transitore di calcio e della contrattilità, aggiungere 10 micromolare Y-27632, RA 100 nanomolare, verapamil un micromolare o un volume uguale di PBS nel mezzo di coltura di hiPSC-CRM.

Quindi, scartare il mezzo e lavare la piastra con PBS una volta. Cambiare il mezzo in un DMEM privo di fenolo rosso contenente 0,02 peso per volume per percentuale di poliolo tensioattivi, indicatore di calcio a cinque micromolari e il corrispondente Y-27632, RA, verapamil o un volume uguale di PBS e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, scartare il supernatante, lavare le cellule con il DMEM privo di coloranti tre volte e lasciare riposare il mezzo per 30 minuti per de-esterificare il colorante di mappatura.

Posizionare il coperchio semi di cella in una camera da bagno aperta e inserire la camera in un sistema di microincubazione equilibrato a 37 gradi Celsius con un regolatore automatico di temperatura. Perfonderlo con la soluzione di Tyrode e aggiungere continuamente RI, RA o PBS alla soluzione di perfusione. Utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita e una testa di scansione laser per registrare il transitore spontaneo di calcio utilizzando una scansione della linea x-t.

Registrare la contrazione spontanea delle macchine hiPSC-CRM utilizzando la funzionalità di contrasto di interferenza differenziale del microscopio confocale. Il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate è stato confermato dall'aumento dell'attività della luciferasi. L'aumento della troponina cardiaca umana T e dell'espressione dell'antigene nucleare umano mostrò che il pretrattamento dell'Y-27632 poteva migliorare significativamente il tasso di innesto cellulare.

Le cellule pretrattate Y-27632 presentavano una struttura citoscheletricha a forma di asta più grande e definita. Inoltre, il pretrattamento Y-27632 ha diminuito le cellule positive tunel, indicando l'apoptosi hiPSC-CM trapiantata ridotta in vivo. Western blot suggerì che il pretrattamento di Y-27632 aumentava l'espressione di integrina beta-1 e N-cadherina e diminuiva l'espressione della catena luminosa fosfo-miosina 2.

Questo cambiamento è stato normalizzato 72 ore dopo il ritiro Y-27632. Esperimenti di attacco cellulare HL-1 del topo in vitro hanno indicato che il pretrattamento Y-27632 ha aumentato significativamente l'aderenza hiPSC-CM rispetto all'HL-1. Il pretrattamento Y-27632 ridusse la forza contrattile, il picco della fluorescenza transitoria del calcio e la durata transitoria del calcio.

La contrazione dei cardiomiociti regolata dal pretrattamento Y-27632 riduce significativamente l'espressione di cTnI e cTnT. Simile all'Y-27632, il pretrattamento di verapamil aumentò l'attività della luciferasi e il numero di cellule doppiamente positive hcTnT/HNA. Il passo più importante è quello di coltura delle cellule nel gruppo di trattamento per 12 ore in mezzo Rb-plus integrato con 10 micromolare Y-27632.

Sulla base di questo metodo, il lento rilascio di Y-27632 per aumentare ulteriormente il tasso di innesto cellulare è una strategia promettente. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare la fisiologia e la funzione dell'hiPSC delle macchine virtuali in vivo. La piccola molecola CHIR99021 utilizzata per la differenziazione dei cardiomiociti è pericolosa, il che può causare irritazione respiratoria.

Si prega di non aspirare o inalare in alcun modo.