Name: Migliorare linnesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dalluomo attraverso uninibizione transitoria dellattività di Rho Kinase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Scopri come migliorare l'innesto dei cardiomiociti derivati da hiPSC attraverso l'inibizione transitoria della Rho-kinasi con Y-27632. Questo metodo aumenta l'adesione cellulare e la sopravvivenza nel modello murino di infarto miocardico.

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Gli autori ringraziano il Dr. Joseph C. Wu (Stanford University) per aver gentilmente fornito il costrutto Fluc-GFP e il Dr. Yanwen Liu per un'eccellente assistenza tecnica. Questo studio è sostenuto dal National Institutes of Health RO1 concede HL95077, HL114120, HL131017, HL138023, UO1 HL134764 (per J.) e HL121206A1 (a Los Angeles) e una sovvenzione R56 HL142627 (per W.) 16SDG30410018, e l'Università dell'Alabama a Birmingham Faculty Development Grant (a W. .

Tutte le procedure sugli animali in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università dell'Alabama a Birmingham e si basavano sulle Linee guida per la cura e l'uso degli animali da parte del National Institutes of Health Laboratory (No- 85-23).
1. Preparazione dei mezzi di coltura e delle piastre culturali
<ol><li>
Preparazione media
	<ol>
<li>Per il mezzo hiPSC, mescolare 400 mL di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) mezzo basale (Tabella dei materiali 1) e 100 mL di supplemento hPSC 5x; Conservare il composto a 4 gradi centigradi.</li>
		<li>Per RPMI 1640/B27 meno insulina (RB-) medio, mescolare 500 mL di RPMI 1640 e 10 mL di B27 supplemento meno insulina.</li>
		<li>Per il mezzo RPMI 1640/B27 (RB) , mescolare 500 mL di RPMI 1640, 10 mL di supplemento B27 e 5 mL di penicillina-streptomicina (pen-streptop) antibiotico.</li>
		<li>Per il mezzo di purificazione16, mescolare 500 mL di RPMI 1640, 10 mL di supplemento B27, 5 mL di antibiotico pen-strep e 1.000 l di soluzione di sodio DL-lattato (a una concentrazione finale di 4 mM).</li>
		<li>Per una soluzione neutralizzante, mescolare 200 mL di RPMI 1640, 50 mL di siero bovino fetale (FBS), 2,5 mL di antibiotico pen-strep e 50 di Y-27632 (a una concentrazione finale di 10 M).</li>
		<li>Per il mezzo di congelamento, mescolare 9 mL di FBS, 1 mL di solforo dimetilo (DMSO) e 10 -L di Y-27632 (ad una concentrazione finale di 10 M).</li>
		<li>Per la soluzione a matrice extracellulare (EMS), scongelare la matrice extracellulare concentrata (Tabella dei materiali 1) a 4 gradi centigradi fino a quando non ha raggiunto uno stato liquido uniformemente coerente. Precool pipette punte e tubi prima di fare matrici di 350 -L ciascuno su ghiaccio, e conservare l'aliquota a -20 gradi centigradi. Prima di rivestire le piastre, diluire una aliquota scongelata in 24 mL di mezzo DMEM/F12 ghiacciato (EMS); mantenere l'EMS in 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane. NOT:</</c5> Eseguire tutte le fasi di rivestimento sul ghiaccio per evitare la solidificazione della matrice della membrana del seminterrato.</li>
		<li>Per la soluzione di Tyrode, prendere il 90% del volume finale richiesto di acqua di grado di coltura dei tessuti, aggiungere la quantità appropriata dei seguenti reagenti e mescolare fino a dissoluzione. Quindi, utilizzare 1 N NaOH per regolare il pH a 7.4. Aggiungere acqua extra a una concentrazione finale di 140 mmol/L di cloruro di sodio, 1 mmol/L di cloruro di magnesio, 10 mmol/L HEPES, 5 mmol/L di cloruro di potassio, 10 mmol/L glucosio e 1,8 mmol/cloruro di calcio. Sterilizzare per filtrazione, utilizzando una membrana di 0,22 m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rivestimento piastra di coltura cellulare
	<ol>
<li>Per le piastre di coltura hiPSC, applicare 1 mL di EMS su ciascun pozzo di una piastra a 6 pozzetti e incubare la piastra per almeno 1 h a 37 gradi centigradi. Aspirare la soluzione DMEM/F12 prima di seminare le cellule.</li>
		<li>Per il rivestimento della gelatina, sciogliere 0,2 g di polvere di gelatina in acqua di grado di tessuto per fare una soluzione dello 0,2% (w/v). Sterilizzare autoclaving a 121 gradi centigradi, 15 psi per 30 min. Prima di passare le cellule, aspirare la soluzione e lasciare asciugare la piastra per almeno 1 h a temperatura ambiente all'interno della cappa di coltura dei tessuti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Manutenzione hiPSC e Ddifferenziazione Cardiomiocita
<ol><li>Coltura gli hiPSC in supporto hiPSC (vedere il passaggio 1.1.1) con un cambiamento medio giornaliero fino a quando le cellule raggiungono 80%-90% confluenza per pozzo. NOT:</</c0> Per scopi di manutenzione, hiPSCs sono generalmente pronti per il passaggio ogni 4 giorni.</li>
	<li>Per passare hiPSCs, aspirare il mezzo e lavare il pozzo 1x con 1x salina tampone fosfato (PBS). Aggiungere a ciascun pozzo 0,5 mL di soluzione per il distacco delle cellule staminali (Tabella dei materiali )e incubare a 37 gradi centigradi per 5-7 min. NOT:</</c2> Il tempo di incubazione dipende dalla densità delle cellule e dal tasso di dissociazione, che può essere osservato al microscopio.</li>
	<li>Neutralizzare la soluzione di distacco delle cellule staminali con 1 mL di mezzo hiPSC integrato con 5 .M Y-27632. Raccogliere la miscela in un tubo di centrifuga di 15 mL. Centrifugare il tubo per 5 min a 200 x g, aspirare il super-atterrante senza disturbare il pellet cellulare, quindi risospendere le cellule in 1 mL di mezzo hiPSC contenente 5 .M Y-27632.</li>
	<li>Semina gli hiPSC su una nuova piastra a 6 pozzetti rivestita EMS con un rapporto compreso tra 1:6 e 1:18. Modificare il mezzo medio in hiPSC senza Y27632 dopo 24 h.</li>
	<li>Per congelare le cellule, risospendere gli hiPSC dissociati nel mezzo di congelamento ad una concentrazione di 0,5-1 milioni/500 l, posizionare la sospensione nei crioviali e conservarle in un congelatore a -80 gradi centigradi. Trasferire le fiale congelate in azoto liquido dopo 24 ore.</li>
	<li>Per differenziarsi, sostituire il mezzo hiPSC con 2 mL di RB- medio integrato con 10 M GSK-3 , inibitore CHIR99021 (CHIR) all'80%-90% di confluenza cellulare. Sostituire il mezzo con 3 mL di RB- medio dopo 24 h e incubare per ulteriori 48 h (giorno 3).</li>
	<li>Il giorno 3, sostituire il mezzo a 3 mL di RB- medio con 10 M Wnt inibitore IWR1 per 48 h (giorno 5), quindi sostituire il mezzo con 3 mL di RB- medio e mantenere per 48 h (giorno 7).</li>
	<li>Il giorno 7, sostituire il supporto con 3 mL di RB medium e cambiare il mezzo ogni 3 giorni in futuro. Il battito spontaneo degli hiPSC-CMs deve essere osservato tra i giorni da 7 a 10.</li>
</ol>3. Depurazione hiPSC-CMs e pretrattamento delle piccole molecole
 NOT:</</c0> Per dissociare gli hiPSC-CM, sono stati utilizzati enzimi altamente purificati e ricombinanti di dissociazione cellulare (Tabelladei materiali1).
<ol><li>Il giorno 21 dopo la differenziazione hiPSC-CM, aspirare il mezzo e lavare le cellule 1x con PBS sterile. Incubare le cellule con 0,5 mL di enzimi di dissociazione cellulare per bene per 5-7 min a 37 gradi centigradi. Ripetutamente pipette la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da 1 mL al fine di dissociare accuratamente le cellule.</li>
	<li>Dopo che le cellule sono dissociate, aggiungere 1 mL di soluzione neutralizzante ad ogni pozzo, raccogliere la miscela di cellule in un tubo di centrifugazione da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 3 min.</li>
	<li>Ripiantare le cellule su lastre di 6 pozzetti rivestiti di gelatina ad una densità di 2 milioni di cellule per pozzo.</li>
	<li>Dopo 24-48 h, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di purificazione per 3-5 giorni. NOT:</</c1> La purificazione è completa quando più del 90% delle cellule in ogni campo visivo al microscopio batte. Per evitare ulteriori danni ai cardiomiociti, non estendere la durata della purificazione oltre 5 giorni. Se il primo round non produce la purezza necessaria, sostituire il supporto di purificazione con il supporto RB per 1 giorno, quindi completare un secondo ciclo di purificazione.</li>
	<li>Prima del trapianto, le cellule del gruppo di trattamento vengono coltivate per 12 h nel mezzo RBs, integrate con 10 .M Y-27632. Allo stesso modo, eseguire il trattamento in verapamil sulle cellule del mezzo RB , con 1 : M verapamil per 12 h (hiPSC-CMs- VER).</li>
	<li>Dopo il trattamento, lavare l'hiPSC-CMs 1x con PBS e incubare le cellule con 0,5 mL di enzimi di dissociazione cellulare per pozzo per un massimo di 2 min. Ripetutamente pipette la sospensione cellulare, utilizzando una pipetta da 1 mL, per dissociare accuratamente le cellule. Neutralizzare le cellule con soluzione di neutralizzazione, raccogliere la miscela di cellule in un tubo di centrifuga di 15 mL e centrifugare a 200 x g per 3 min. Risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione di 0,1 milioni di cellule/5L in preparazione per l'iniezione.</li>
</ol>4. Infarto miocardico e trapianto di cellule
 NOT:</</c0> Tutti gli strumenti chirurgici sono presterilizzati con autoclave e sono mantenuti in condizioni asettiche durante più interventi chirurgici tramite uno sterilizzatore di perline caldo (Tabella dei Materiali 2).
<ol><li>Anestetizza noD/scid topi (Tabella dei materiali 2) con isoflurane inalato (1,5%-2%). Monitorare i livelli di anestesia dalle risposte dei topi a un pizzico di dita dei dei dei diici. Posizionare l'unguento ottico veterinario sugli occhi per evitare che si annidano durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Fornire 0,1 mg/kg di buprenorfine sottocutanea mente per la gestione del dolore prima dell'intervento chirurgico.</li>
	<li>Posizionare e fissare il mouse in una posizione supina su un tavolo operatorio riscaldato, rimuovere i capelli dalla regione del collo ventrale e il torace sinistro utilizzando una crema depilatoria, esporre la pelle e disinfettarla con il 70% di alcol.</li>
	<li>Tagliare un'incisione di 0,5 cm al centro del collo utilizzando forbici chirurgiche, separare il grasso sottocutaneo con pinze sterili ed esporre la trachea. Introdurre per via orale la cannula dell'intubazione nella trachea, collegare la cannula a un piccolo ventilatore animale e regolare le impostazioni di ventilazione (impostare il volume di marea a 100–150 - l e la frequenza respiratoria a 100x–150x per min).</li>
	<li>Dopo che il mouse si stabilizza, tagliare un'incisione di 0,5 cm al centro della pelle sinistra del torace. Utilizzare pinze per separare senza mezzi termini lo strato muscolare e fare una piccola incisione nel quinto spazio intercostale per esporre la cavità toracica. Posizionare il retrattore nell'incisione per aprire la cavità toracica e individuare l'arteria coronaria discendente sinistra (LAD). Sotto un microscopio chirurgico sezionato, silegi il LAD con un sutura non assorbibile.</li>
	<li>Immediatamente dopo l'induzione di MI, iniettare 5 - L di hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs-RI, hiPSC-CMs-VER, hiPSC-CMs , o un volume uguale di PBS nel miocardio del mouse in ogni sito (3 x 105 celle/animale, 1 x 105 celle/sito), una nell'area infarto e due nelle aree intorno all'infarto. NOT:</</c7> Dal momento che 5 l è molto piccolo volume, non è facile controllare con precisione il volume succhiandolo direttamente con una siringa. Il coperchio di una parabola Petri sterile può essere capovolto, e 5 -L delle cellule possono essere prima depositati sul coperchio con una pipetta. A causa della tensione superficiale, non si diffonderà ma si condensa in una piccola massa liquida. Questo può essere facilmente assorbito e iniettato nel miocardio del mouse.</li>
	<li>Eliminare l'aria residua nella cavità toracica riempiendola con soluzione salina isotonica calda. Stitch le costole, muscoli, e la pelle in sequenza con una sutura assorbibile 6-0. Spegnere l'iniezione di anestesia isoflurana. Tenere gli animali chirurgici sul pad di riscaldamento e osservarli da vicino mentre riacquistano piena consapevolezza. Quindi, posizionare gli animali in una gabbia pulita. Non restituire gli animali alla compagnia di altri animali fino a quando non sono completamente recuperati.</li>
	<li>Dopo l'intervento chirurgico, iniettare i topi intraperitonealmente con buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 12 h per 3 giorni consecutivi e iniettare loro ibuprofene (5 mg/kg) ogni 12 h per un giorno. Eseguire studi di analisi successivi in punti temporali specificati. NOT:</</c8> Segui le linee guida del tuo comitato locale per la cura degli animali per l'analgesia.</li>
</ol>5. Calcio Transitorio e Contrattiglio Registrazione
<ol><li>Autoclave 15 mm-diametrocoverslips (Tavolo dei materiali 2) e pinzette in un piccolo bicchiere di vetro a 121 gradi centigradi, 15 psi per 15 min. Precool i copricoproeni e pinzette a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Utilizzando le pinzette, posizionare il coperchio in una piastra da 12 pozzetti e una pipetta 300 -L di matrice extracellulare su ogni coverslip. NOT:</</c1> Non lasciare che la matrice superi il bordo della coverslip per evitare di ridurre la quantità di rivestimento a matrice. Incubare la piastra da 12 pozze in un'incubatrice a coltura cellulare a 37 gradi centigradi per 1 h.</li>
	<li>Aspirare il mezzo nella piastra a 6 pozzetti rivestita di gelatina con hiPSC-CMs purificate, lavarlo 1x con PBS, quindi digerirlo con 0,5 mL di enzimi di dissociazione cellulare per 1,5 min. e centrifugare la miscela a 200 x g per 3 min.</li>
	<li>Aspirare la matrice extracellulare rivestita dai copricapi. Contare il numero di cellulare e sospendere nuovamente le celle nella soluzione di neutralizzazione fino a una concentrazione di 40.000/300 l, quindi aggiungere 300 l della sospensione cellulare su ogni coverll. Cultura la piastra in un'incubatrice di 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Dopo 24 h, aspirare delicatamente la soluzione neutralizzata, aggiungere 500 L di mezzo RB a ogni pozzetto della piastra, e continuare a coltura per 2 giorni.</li>
	<li>Aggiungere Y-27632 (10 m), Rho kinase activator (RA, 100 nM), verapamil (1 M), o un volume uguale di PBS nel mezzo di coltura degli hiPSC-CMs, 12 h prima del rilevamento transitorio e di contrattilità. NOT:</</c3> Oltre al rilevamento del transitorio di calcio e della contrattilità delle cellule dopo 12 h di trattamento chimico, il rilevamento di questi parametri è stato testato anche a 12, 24, 48 e 72 h dopo il ritiro chimico.</li>
	<li>Estrarre la piastra, scartare il mezzo e lavare la piastra 1x con PBS. Modificare il mezzo in un DMEM senza fenoliglio contenente lo 0,02% (w/v) di pololosto surfactant (Tabella dei materiali 1), indicatore di calcio di 5 M ( Tabella dei materiali1) e il corrispondente Y-27632 (10 M), RA (100 nM), verapam verail (1 M), o un volume uguale PBS, e incubare la piastra per 30 min a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Scartare il supernatante, lavare le cellule 3x con il mezzo DMEM senza coloranti e lasciare riposare il mezzo per 30 min per disidratare il colorante di mappatura.</li>
	<li>Collocare il coperchio dei semi cellulari in una camera da bagno aperta e inserire la camera in un sistema di microincubazione con 37 gradi con un regolatore di temperatura automatico (Tabella dei materiali2), perfuso con la soluzione di Tyrode e Inibitore della chinasi Rho (RI), RA o PBS alla soluzione perfusione.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita (Tabella dei materiali 2) e una testa di scansione laser ( Tabella dei materiali 2 ) per registrare il transitorio spontaneodelcalcio impiegando una scansione line-t x-t, utilizzando un laser argon 488 nm per l'eccitazione del colorante e un barriera per raccogliere la luce di emissione. Registrare la contrazione spontanea di hiPSC-CMs utilizzando la funzionalità Differential Interference Contrast del microscopio confocale (Tabella dei materiali 2). NOT:</</c10> Le registrazioni transitorie di calcio sono state elaborate e analizzate utilizzando il software MATLAB R2016A (Tabella dei materiali 4). I saggi di cambiamento di contrazione cellulare sono stati eseguiti utilizzando il software ImageJ (Tabella dei materiali 4).</li>
</ol>

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<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+cell+motility+by+carbon+ion+irradiation+via+the+Rho+signaling+pathway+and+its+inhibition+by+the+ROCK+inhibitor+Y-27632+in+lung+adenocarcinoma+A549+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Increase in cell motility by carbon ion irradiation via the Rho signaling pathway and its inhibition by the ROCK inhibitor Y-27632 in lung adenocarcinoma A549 cells.</a> Journal of Radiation Research. 55 (4), 658-664 (2014).</li>
<li>Srivastava, K., Shao, B., Bayraktutan, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-beta+exacerbates+in+vitro+brain+barrier+damage+in+hyperglycemic+settings+via+regulation+of+RhoA%2FRho-kinase%2FMLC2+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">PKC-beta exacerbates in vitro brain barrier damage in hyperglycemic settings via regulation of RhoA/Rho-kinase/MLC2 pathway.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1928-1936 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi chiave di questo studio includono l'ottenimento di hiPSC-CMs puri, il miglioramento dell'attività di hiPSC-CMs attraverso il pretrattamento Y-27632 e, infine, il trapianto di una quantità precisa di hiPSC-CMs in un modello di MI del topo.
Le questioni chiave affrontate qui sono state che, in primo luogo, abbiamo ottimizzato i metodi di purificazione senza glucosio19 e stabilito un nuovo sistema di purificazione efficiente. La procedura di sistema ha incluso l...

Le terapie basate sulle cellule staminali hanno mostrato un notevole potenziale come trattamento per danni cardiaci causati da MI1. L'uso di hiPSC differenziati fornisce una fonte inesauribile di hiPSC-CMs2 e apre le porte al rapido sviluppo di trattamenti innovativi. Tuttavia, rimangono molte limitazioni alla traduzione terapeutica, tra cui la sfida del tasso di innesto gravemente basso delle cellule impiantate.
Dissociando le cellule con trypsin avvia anoikis3, che viene accelerato solo una volta che queste cellule vengono iniettate in ambienti duri come il miocardio ischemico, dove l'ambiente ipossico accelera il percorso verso la morte cellulare. Delle cellule rimanenti, gran parte viene sbiadita dal sito di impianto nel flusso sanguigno e si diffonde in tutta la periferia. Uno dei percorsi apoptotici chiave è il percorso RhoA/ROCK4. Sulla base di ricerche precedenti, il percorso RhoA/ROCK regola l'organizzazione actin cytoskeletal5,6, che è responsabile della disfunzione cellulare7,8. L'inibitore ROCK Y-27632 è ampiamente utilizzato durante la dissociazione e il passaggio delle cellule somatiche e staminali, per aumentare l'adesione cellulare e ridurre l'apoptosi cellulare9,10,11. In questo studio, Y-27632 viene utilizzato per trattare hiPSC-CMs prima del trapianto nel tentativo di aumentare il tasso di innesto cellulare.
Sono stati stabiliti diversi metodi volti a migliorare il tasso di innesto cellulare, come lo shock termico e il rivestimento a matrice della membrana del seminterrato12. Oltre a questi metodi, la tecnologia genetica può anche promuovere la proliferazione cardiomiocita13 o invertire le cellule non miocardiche in cardiomiociti14. Dal punto di vista della bioingegneria, i cardiomiociti vengono seminato su uno scaffold biomateriale per migliorare l'efficienza dei trapianti15. Purtroppo, la maggior parte di questi metodi sono complicati e costosi. Al contrario, il metodo qui proposto è semplice, conveniente ed efficace, e può essere utilizzato come trattamento basale prima del trapianto, così come in coniugazione con altre tecnologie.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase (soluzione per il distacco delle cellule staminali)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07920</td><td></td></tr><tr><td>B27 meno insulina</td><td>Fisher Scientific</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di B27</td><td>Fisher Scientific Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x), alto glucosio, HEPES, senza rosso fenolo</td><td>Thermofisher</td><td>20163029</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM (indicatore di calcio)</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Senza glucosio RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11879020</td><td></td></tr><tr><td>IWR1</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72562</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (matrice extracellulare)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR (terreno di cellule staminali pluripotenti umane)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Pen-strep antibiotic</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (tensioattivo poliolo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Rho activator II</td><td>Citoscheletro</td><td>CN03</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>DL-lattato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (enzimi di dissociazione cellulare)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-010</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Attrezzature e forniture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III Bioluminescence Instruments</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>15 mm Vetrini coprioggetti</td><td>Warner</td><td>CS-15R15</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>NX50</td><td></td></tr><tr><td>Doppio regolatore di temperatura automatico</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore per elettroforesi</td><td>BIO-RAD</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera ad alta velocità</td><td>pco</td><td>1200 s</td><td></td></tr><tr><td>Testa di scansione laser</td><td>Olympus</td><td>FV-1000</td><td></td></tr><tr><td>Camera da bagno aperta a basso profilo (si monta nel sistema di microincubazione sopra)</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-42LP</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microincubazione</td><td>Warner Instruments</td><td>DH-40iL</td><td></td></tr><tr><td>Minivent Ventilatore per topi</td><td>Harvard Apparatus</td><td>845</td><td></td></tr><tr><td>topi NOD/SCID</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>001303</td><td></td></tr><tr><td>Gel proteici prefabbricati</td> Confezioni di trasferimento <td>BIO-RAD</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Sistema</td><td>BIO-RAD</td><td>1704156</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>Trans-Blot Turbo</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore a perline calde</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td> Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-human Nucleolin (Alexa Fluor 647)</td><td>Abcam</td><td>ab198580</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardiaca T R</td><td>& D Systems</td><td>MAB1874</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardiaca C</td><td>Abcam</td><td>ab137130</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardiaca I</td><td>Abcam</td><td>ab47003</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-asino anti-topo</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>715-175-150</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-asino anti-coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratory</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Fitc-asino anti-topo</td><td>Jackson Laboratorio di immunoricerca</td><td>715-095-150</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab22555</td><td></td></tr><tr><td>Troponina cardiaca umana</td><td>T Abcam</td><td>ab91605</td><td></td></tr><tr><td>Integrina e beta; 1</td><td>Abcam</td><td>ab24693</td><td></td></tr><tr><td>Ki67</td><td>EMD Millipore</td><td>ab9260</td><td></td></tr><tr><td>N-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab18203</td><td></td></tr><tr><td>Catena leggera fosfo-miosina</td> 2 <td>Cell Signaling Technology</td><td>3671s</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>R2016A</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>1.52g</td><td></td></tr></tbody></table>

migliorare l'innesto dei cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di rho kinase

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

Un fattore cruciale per migliorare l'efficacia della terapia cellulare per la rigenerazione miocardiale è quello di aumentare in modo sicuro ed efficiente il tasso di innesto cellulare. Y-27632 è un inibitore altamente potente della proteina chinasi (RhoA/ROCK) associata al Rho, associata a Bobina, e viene utilizzata per prevenire l'apoptosi cellulare indotta dalla dissociazione (anoikis). Dimostriamo che il pretrattamento di Y-27632 per cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotti dall'uomo (hiPSC-CMs-RI) prima dell'impianto risultati in un miglioramento del tasso di innesto cellulare in un modello murino di infarzione miocardiale acuta (MI). Qui, descriviamo una procedura completa di differenziazione hiPSC-CMs, purificazione e pretrattamento cellulare con Y-27632, così come la contrazione cellulare risultante, le misurazioni transitorie del calcio e il trapianto in modelli MI murini. Il metodo proposto fornisce un metodo semplice, sicuro, efficace e a basso costo che aumenta significativamente il tasso di innesto cellulare. Questo metodo non può essere utilizzato solo in combinazione con altri metodi per migliorare ulteriormente l'efficienza del trapianto di cellule, ma fornisce anche una base favorevole per lo studio dei meccanismi di altre malattie cardiache.

Gli hiPSC-CM utilizzati in questo studio sono stati derivati dall'origine umana con il gene del reporter luciferasi; pertanto, il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate in vivo è stato rilevato dalla bioluminescenza imaging (BLI)17 (Figura 1A, B). Per le sezioni itologiche cardiache, la troponina cardiaca T (hcTnT) specifica dell'uomo e l'antigene nucleare umano (HNA) le cellule doppio-positive sono state cla...

In questo protocollo, dimostriamo ed elaboriamo su come utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per la differenziazione e la purificazione cardiomiocitati, e ulteriormente, su come migliorare la sua efficienza di trapianto con inibitore della chinasi proteica associata a Rho pretrattamento in un modello di infarzione miocardico del topo.

Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

I nostri dati dimostrano che l'inibizione transitoria dell'attività della Rho-chinasi migliora l'adesione, la sopravvivenza e l'innesto dei cardiomiociti derivati dall'hiPSC dopo essere stati trapiantati nei cuori degli animali infarsi. Forniamo un metodo semplice, a basso costo, mentre altamente efficiente per aumentare l'innesto di cardiomiociti trapiantati derivati dall'hiPSC nei cuori degli animali feriti. Poiché questa tecnica può migliorare i tassi di innesto cellulare in modo sicuro ed efficiente nell'infarto cardiaco acuto e nell'insufficienza cardiaca, contribuisce ai miglioramenti risultanti nella funzione cardiaca, nelle vascolari e nell'apoptosi.Sebbene abbiamo testato i nostri protocolli solo in iPSC, questi metodi possono essere applicati ad altri tipi di cellule, come le cellule staminali embrionali, le cellule staminali mesenchimali, eccetera. La dose e la durata del trattamento Y-27632 sono fondamentali. La dimostrazione visiva può dimostrare in dettaglio tutti i passaggi chiave del protocollo, il che è vantaggioso per qualcuno che non ha mai eseguito questa tecnica prima.Il giorno 21 dopo la differenziazione hiPSC-CM, aspirare il mezzo e lavare le cellule con PBS sterile una volta. Incubare le cellule con 0,5 millilitri di enzimi di dissociazione cellulare per pozzo a 37 gradi Celsius per cinque o sette minuti. Dopo il tempo di incubazione, pipettare ripetutamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da un millilitro per dissociare accuratamente le cellule.Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione neutralizzante ad ogni pozzo, raccogliere la miscela cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g per tre minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare le cellule nella soluzione neutralizzante. Quindi, ripiantare le cellule su piastre rivestite di gelatina e sei po 'ad una densità di due milioni di cellule per pozzo.Dopo 24-48 ore, sostituire il mezzo di coltura con il mezzo di purificazione per tre o cinque giorni. Prima del trapianto, coltura le cellule nel gruppo di trattamento per 12 ore in mezzo RB-plus integrato con 10 micromolare Y-27632. Allo stesso modo, eseguire il trattamento con verapamil sulle cellule nel mezzo RB-plus con un micromolo di verapamil per 12 ore.Dopo il trattamento, lavare l'hiPSC-CRM con PBS una volta e incubare le cellule con 0,5 microlitri di enzimi di dissociazione cellulare per pozzo per un massimo di due minuti. Pipettare ripetutamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da un millilitro per dissociare accuratamente le cellule. Successivamente, neutralizzare le cellule con soluzione neutralizzante, raccogliere la miscela cellulare in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 200 volte g per tre minuti.Dopo la centrifugazione, resuspend le cellule in PBS ad una concentrazione di 0,1 milioni di cellule per cinque microlitri in preparazione all'iniezione. Immediatamente dopo l'induzione dell'infarto del miocardio, iniettare cinque microlitri di hiPSC-CRM di controllo, Y-27632-cms hiPSC pretrattati, hiPSC-CRM trattati con verapamil o un volume uguale di PBS nel miocardio del mouse in ogni sito, uno nell'area infarto e due nelle aree intorno all'infarto. 12 ore prima di eseguire il rilevamento del transitore di calcio e della contrattilità, aggiungere 10 micromolare Y-27632, RA 100 nanomolare, verapamil un micromolare o un volume uguale di PBS nel mezzo di coltura di hiPSC-CRM.Quindi, scartare il mezzo e lavare la piastra con PBS una volta. Cambiare il mezzo in un DMEM privo di fenolo rosso contenente 0,02 peso per volume per percentuale di poliolo tensioattivi, indicatore di calcio a cinque micromolari e il corrispondente Y-27632, RA, verapamil o un volume uguale di PBS e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, scartare il supernatante, lavare le cellule con il DMEM privo di coloranti tre volte e lasciare riposare il mezzo per 30 minuti per de-esterificare il colorante di mappatura.Posizionare il coperchio semi di cella in una camera da bagno aperta e inserire la camera in un sistema di microincubazione equilibrato a 37 gradi Celsius con un regolatore automatico di temperatura. Perfonderlo con la soluzione di Tyrode e aggiungere continuamente RI, RA o PBS alla soluzione di perfusione. Utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita e una testa di scansione laser per registrare il transitore spontaneo di calcio utilizzando una scansione della linea x-t.Registrare la contrazione spontanea delle macchine hiPSC-CRM utilizzando la funzionalità di contrasto di interferenza differenziale del microscopio confocale. Il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate è stato confermato dall'aumento dell'attività della luciferasi. L'aumento della troponina cardiaca umana T e dell'espressione dell'antigene nucleare umano mostrò che il pretrattamento dell'Y-27632 poteva migliorare significativamente il tasso di innesto cellulare.Le cellule pretrattate Y-27632 presentavano una struttura citoscheletricha a forma di asta più grande e definita. Inoltre, il pretrattamento Y-27632 ha diminuito le cellule positive tunel, indicando l'apoptosi hiPSC-CM trapiantata ridotta in vivo. Western blot suggerì che il pretrattamento di Y-27632 aumentava l'espressione di integrina beta-1 e N-cadherina e diminuiva l'espressione della catena luminosa fosfo-miosina 2.Questo cambiamento è stato normalizzato 72 ore dopo il ritiro Y-27632. Esperimenti di attacco cellulare HL-1 del topo in vitro hanno indicato che il pretrattamento Y-27632 ha aumentato significativamente l'aderenza hiPSC-CM rispetto all'HL-1. Il pretrattamento Y-27632 ridusse la forza contrattile, il picco della fluorescenza transitoria del calcio e la durata transitoria del calcio.La contrazione dei cardiomiociti regolata dal pretrattamento Y-27632 riduce significativamente l'espressione di cTnI e cTnT. Simile all'Y-27632, il pretrattamento di verapamil aumentò l'attività della luciferasi e il numero di cellule doppiamente positive hcTnT/HNA. Il passo più importante è quello di coltura delle cellule nel gruppo di trattamento per 12 ore in mezzo Rb-plus integrato con 10 micromolare Y-27632.Sulla base di questo metodo, il lento rilascio di Y-27632 per aumentare ulteriormente il tasso di innesto cellulare è una strategia promettente. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per studiare la fisiologia e la funzione dell'hiPSC delle macchine virtuali in vivo. La piccola molecola CHIR99021 utilizzata per la differenziazione dei cardiomiociti è pericolosa, il che può causare irritazione respiratoria.Si prega di non aspirare o inalare in alcun modo.

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Migliorare l'innesto dei Cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo attraverso un'inibizione transitoria dell'attività di Rho Kinase

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