Name: Misurazione dei tassi di Mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Impara a misurare i tassi di errori di traduzione in Mycobacterium smegmatis utilizzando sistemi reporter di guadagno di funzione. Questi metodi consentono rilevamenti sensibili per studiare la resistenza agli antibiotici.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni della Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1109789), la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31570129), e i fondi di avviamento dalla Tsinghua University School of Medicine a BJ BJ è un Wellcome Trust Investigatore (207487/Z/17/Z).

1. Renilla-Firefly Dual-luciferase reporter
Nota: Per una rappresentazione visiva di questo metodo, vedere la Figura 2.
<ol><li>Inoculare ceppi di reporter micobatterico da-80 ° c in stock con 2 mL di 7H9 medium. Il tipo Wild-luciferasi, così come i ceppi mutati Renilla (reporter), deve essere utilizzato per consentire il calcolo dei tassi di mistranslazione (vedere il passo 1,7). Agitare a 37 ° c per 1 o 2 giorni fino a quando OD600 raggiunge la fase stazionaria (od &gt; 3).</li>
	<li>Aliquota e diluire a OD600nm intorno 0,1-0,5. Per gli esperimenti tipici, utilizzare tre colture biologiche replicati indipendenti. Anidrotetraciclina (ATC), un induttore analogico tetraciclina di espressione reporter (che è controllato da un promotore di tetraciclina-inducible) ad una concentrazione finale di 50 ng/mL.</li>
	<li>Per misurare gli effetti di kasugamicina sui tassi di mistranizzazione21, aggiungere diverse dosi di kasugamicina alla coltura (vedere la Figura 4 per le dosi indicate) allo stesso tempo (alle dosi testate, la kasugamicina non ha attività antimicrobica). Si noti che è importante includere almeno un controllo non indotto per ogni reporter. Culture inducono colture per 4-6 h a 37 ° c con agitazione.</li>
	<li>Trasferire le colture batteriche in un tubo da 2 mL, e centrifugare a 3.220 x g per 5 min a temperatura ambiente per pellet giù i batteri. Scartare il supernatante.</li>
	<li>Interrompere i batteri aggiungendo 40 μL di tampone di lisi passiva 1x (fornito da un kit dual-luciferasi), che è stato diluito (1:1) in acqua bidistillata. Trasferire il lisato batterico risospeso in una piastra bianca 96-well, un pozzo per campione, e agitare a temperatura ambiente per 20 minuti. Attenzione: Non sopra Incubare i batteri in tampone di lisi (per più di 30 min).</li>
	<li>Aggiungere 80 μL di substrato lucciola ad ogni pozzetto, agitare per 15 s e misurare la luminescenza per luminometro con 1.000 ms come tempo di integrazione. Utilizzare un iniettore automatico o una pipetta multicanale per evitare errori di pipettaggio.</li>
	<li>Aggiungere 80 μL di substrato di Renilla ad ogni pozzetto, agitare per 15 s e misurare la luminescenza per luminometro con 1.000 ms come tempo di integrazione.</li>
	<li>Sottrarre la luminescenza dello sfondo-misurata utilizzando il tipo selvaggio M. smegmatis (cioè, non contenente i giornalisti) o il lisato reporter non indotto-dai valori misurati. Utilizzare i valori corretti per calcolare le percentuali di traduzione errata di ogni condizione utilizzando la seguente equazione11,25, dove DN fa riferimento all'attività nel ceppo reporter mutato: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59453/59453eq1.jpg">
</li>
</ol>2. reporter nLuC/GFP
Nota: Per una rappresentazione visiva di questo metodo, vedere la Figura 3.
<ol><li>Inoculare il ceppo di reporter batterico da-80 ° c in stock con 2 mL di 7H9 medium. Agitare a 37 ° c per 1 o 2 giorni fino a quando OD600 raggiunge la fase stazionaria (od &gt; 3).</li>
	<li>Sottocultura a 50 mL di media 7H9 e crescere fino a600 od raggiunge la fase stazionaria tardiva (&gt; 4).</li>
	<li>Prima di aliquotare i batteri a una piastra 96 bene, aggiungere ATC ad una concentrazione finale di 50 ng/mL e mescolare bene. L'induzione della coltura bulk assicura che tutti i pozzi contengano la stessa quantità di induttore e che l'induzione del reporter sia sincronizzata. Aliquot i batteri ad una piastra 96-pozzo chiaro, a fondo rotondo, con 100 μL di volume in ogni pozzetto.</li>
	<li>Per lo schermo per piccole molecole che influenzano i tassi di traduzione errata, aggiungere il composto alla concentrazione indicata per selezionare pozzi. Ai fini del presente protocollo, usare kasugamicina (a dosi indicate nella Figura 5) come illustrazione. Aggiungere diverse dosi di kasugamicina per selezionare i pozzi (ogni gruppo sperimentale deve contenere almeno due replicati biologici).</li>
	<li>Agitare e indurre i campioni a 37 ° c per 16-20 h. Nota: È necessario sigillare la piastra con la pellicola. Inoltre, tutti i pozzi di bordo devono essere riempiti con almeno 200 μL di acqua sterile per limitare l'evaporazione dai pozzi di prova.</li>
	<li>Prelevare 80 μL da ogni pozzetto, utilizzando una pipetta multicanale, e trasferire i campioni su una piastra nera 96-pozzetto (che massimizza la misura del segnale di fluorescenza). Misurare il segnale GFP per luminometro con 20 ms come tempo di integrazione.</li>
	<li>Dopo aver misurato il segnale GFP, centrifugare la piastra a 3.220 x g per 10 min. trasferire 50 μl del supernatante a una piastra 96-well con fondo bianco (che massimizza la misura del segnale di luminescenza), aggiungere 50 μl di substrato di nLuC ad ogni pozzetto, mescolarli bene, e misurare la luminescenza per luminometro con 1.000 ms come tempo di integrazione.</li>
	<li>Determinare il rapporto nLuC/GFP dividendo i valori di luminescenza nLuC corretti per fluorescenza GFP: questa misura (in unità arbitrarie) è una misura relativa di aspartato per la mistranizzazione dell'asparagina.</li>
</ol>

<ol><li>Ribas de Pouplana, L., Santos, M. A., Zhu, J. H., Farabaugh, P. J., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+mistranslation%3A+friend+or+foe%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein mistranslation: friend or foe.</a> Trends in Biochemical Sciences. 39 (8), 355-362 (2014).</li>
<li>Leng, T., Pan, M., Xu, X., Javid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+misreading+in+Mycobacterium+smegmatis+increases+in+stationary+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinburgh%29%22%5BJournal%5D)">Translational misreading in Mycobacterium smegmatis increases in stationary phase.</a> Tuberculosis (Edinburgh). 95 (6), 678-681 (2015).</li>
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<li>Netzer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+and+chemically+triggered+oxidative+stress+modifies+translational+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Innate immune and chemically triggered oxidative stress modifies translational fidelity.</a> Nature. 462 (7272), 522-526 (2009).</li>
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<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+aminoacyl-tRNA+synthetases+editing-domain+mutations+that+cause+mistranslation+in+Mycoplasma+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring aminoacyl-tRNA synthetases editing-domain mutations that cause mistranslation in Mycoplasma parasites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9378-9383 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucyl-tRNA+synthetase+editing+domain+functions+as+a+molecular+rheostat+to+control+codon+ambiguity+in+Mycoplasma+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Leucyl-tRNA synthetase editing domain functions as a molecular rheostat to control codon ambiguity in Mycoplasma pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3817-3822 (2013).</li>
<li>Ling, J., Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+oxidative+stress+induces+protein+mistranslation+through+impairment+of+an+aminoacyl-tRNA+synthetase+editing+site%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Severe oxidative stress induces protein mistranslation through impairment of an aminoacyl-tRNA synthetase editing site.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4028-4033 (2010).</li>
<li>Raina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+amino+acid+specificity+of+mammalian+tyrosyl-tRNA+synthetase+is+associated+with+elevated+mistranslation+of+Tyr+codons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reduced amino acid specificity of mammalian tyrosyl-tRNA synthetase is associated with elevated mistranslation of Tyr codons.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2014).</li>
<li>Wu, J., Fan, Y., Ling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+oxidant-induced+mistranslation+by+threonyl-tRNA+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanism of oxidant-induced mistranslation by threonyl-tRNA synthetase.</a> Nucleic Acids Research. 42 (10), 6523-6531 (2014).</li>
<li>Kramer, E. B., Farabaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+frequency+of+translational+misreading+errors+in+E.+coli+is+largely+determined+by+tRNA+competition%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition.</a> RNA. 13 (1), 87-96 (2007).</li>
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<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Stop+Codon+Readthrough+in+Single+Bacterial+Cells+and+Implications+for+Population+Fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Stop Codon Readthrough in Single Bacterial Cells and Implications for Population Fitness.</a> Molecular Cell. 67 (5), 826-836 (2017).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+mistranslation+protects+bacteria+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Protein mistranslation protects bacteria against oxidative stress.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1740-1748 (2015).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto può essere adattato per la misurazione dei tassi di mistranslazione in un'ampia varietà di organismi. Ci sono una serie di considerazioni che dovrebbero essere tenute in mente quando si adatta il protocollo ad altri sistemi. In primo luogo, lo scopo della misurazione deve essere considerato. Per la misurazione accurata dei tassi di mistranslazione utilizzando i reporter di guadagno di funzione, ciò che è necessario è (a) un test di lettura robusto (ad esempio, funzione enzimatica [in questo caso, attività di luciferasi] con un ampio intervallo lineare). Inoltre, cercare (b) una perdita di mutazione di funzione in un residuo critico della proteina reporter che si traduce in una perdita di funzione molto significativa, al di sotto del tasso atteso di mistranslation. Ad esempio, se il tasso di mistranslazione atteso da misurare è di circa 10-3/Codon, la perdita della mutazione di funzione deve essere maggiore di 1.000 volte; in caso contrario, l'intervallo inferiore di eventi di traduzione errata non verrà rilevato in modo sensibile. Infine, per la misurazione accurata dei tassi di mistranizzazione utilizzando i giornalisti di guadagno di funzione, (c) è necessario un robusto reporter di benchmark — in questo caso, la luciferasi lucciola per la sezione 1 del protocollo. Idealmente, il reporter di riferimento dovrebbe essere fusa al reporter enzimatico mutato, garantendo (a tutti gli effetti) che sono entrambi espressi in rapporti equimolari. La lettura del benchmark (e del reporter primario) dovrebbe essere solida per perturbazioni in ambienti esposti. Ad esempio, la fluorescenza del GFP di tipo selvaggio è altamente suscettibile alla perturbazione da cambiamenti nel pH28, rendendolo inadatto come punto di riferimento per la misurazione dei tassi di mistranslazione nei micobatteri fagocitosi nei macrofagi, che risiedono in fagosomi inferiori a pH 729. D'altra parte, per applicazioni come lo screening delle piccole molecole, le considerazioni più importanti per uno schermo primario saranno la riproducibilità delle misurazioni (cioè precisione, al contrario della precisione), la minimizzazione della manipolazione manuale e le piccole volumi di coltura. Le misurazioni accurate dei tassi di mistranslazione sono meno importanti e possono essere eseguite come saggi secondari. Infine, va notato che i giornalisti descritti in questo protocollo, sulla base della funzione enzimatica degli enzimi luciferasi, misureranno solo i tassi di mistranslazione media di una popolazione batterica, ma non possono fornire informazioni sull'eterogeneità a singola cellula variazione dei tassi di mistranslazione. Data l'importanza della variabilità a cellule singole nei fenotipi adattativi30,31,32, i giornalisti fluorescenti per la misurazione degli eventi di mistranslazione sono stati sviluppati12,33 , anche per la misurazione della mistranslazione nei micobatteri5.
Avendo considerato i requisiti per la misurazione della mistranslazione, va notato che i reporter di guadagno di funzione genetica, come descritto in questo protocollo, possono misurare solo un tipo di traduzione errata (cioè una sostituzione di aminoacidi per un codone) per reporter. Pertanto, per la misurazione di diversi eventi di traduzione errata, sono necessari più reporter. Ad esempio, per la misurazione della mistranslazione mediante errori di decodifica ribosomiale di codoni near-cognate di Lysyl-tRNA in una posizione, sono necessari almeno 16 reporter2,3,11. La spettrometria di massa ad alta precisione e la bioinformatica consentono la potenziale identificazione di molti tipi diversi di eventi di mistranslazione simultaneamente18; Tuttavia, questi metodi vengono anche con avvertimenti. In generale, sono meno precisi dei reporter di guadagno di funzione. Inoltre, come indicato in precedenza, essi sono meno idonei per l'individuazione di alcuni tipi di mistranslation, vale a dire quelli che potrebbero essere combinati con deamidazione non enzimatica23. Infine, la spettrometria di massa non è idonea come lettura per lo screening a medio o alto rendimento.
Per l'adattamento di questi giornalisti e protocolli per la misurazione della traduzione errata in altri sistemi, ulteriori considerazioni includono una solida espressione del giornalista nel sistema modello desiderato. Inizialmente abbiamo tentato di utilizzare il sistema Dual-luciferase sviluppato da Farabaugh e colleghi nel nostro sistema micobatterico senza modifiche, ma non ha avuto successo, a causa della mancanza di espressione reporter. Ampia risoluzione dei problemi identificato che sia Codon-ottimizzazione e una modifica di sequenza minore dei giornalisti sono stati necessari per consentire l'espressione robusta25 (e vedere sopra). È concepibile che adattamenti simili dei giornalisti sarebbero necessari per l'uso in altri sistemi.
Infine, si deve considerare il tipo di evento di mistranslazione misurato. Ad esempio, se è necessario misurare la lettura di stop-codone (soppressione senza senso), la perdita di funzione della mutazione del codone deve essere introdotta all'interno di una regione non critica della proteina primaria del reporter34. In caso contrario, solo gli eventi specifici di soppressione delle sciocchezze che recupereranno i residui critici (e, quindi, la funzione reporter) saranno misurati dal saggio, il che potrebbe portare a una sottovalutazione sostanziale dei tassi di traduzione errata reali. C'è sempre più evidenza che l'errore traslazionale gioca un possibile ruolo adattativo in un gran numero di organismi1,12,13,35. Tuttavia, la misurazione degli eventi di mistranizzazione è ancora limitata a un numero piccolo, seppur crescente, di specie modello. L'adattamento dei metodi sensibili per misurare la mistranizzazione ha il potenziale per aumentare ulteriormente la comprensione da parte degli scienziati del ruolo dell'errore di traduzione nella fisiologia e nella patologia.

Il flusso di informazioni nella biologia molecolare richiede la traduzione di informazioni genetiche alle proteine funzionali. Come per tutti i sistemi biologici, la traduzione genica implica anche errori misurabili. Le stime dei tassi di errore nella traduzione sono tipicamente indicate come circa 1/10000 per codone (Recensito da Ribas de Pouplana et al.1). Tuttavia, i tassi di errore variano ampiamente, da meno di 10-5 a più di 0.05/Codon1,2,3,4,5. L'ampia gamma di tassi di errore, che coprono più di tre ordini di grandezza, è dovuta al fatto che gli errori possono derivare da più fasi del percorso di traduzione: dagli errori stocastici, mutazionali o indotti da stress nell'aminoacilazione6, 7 il , 8 il , 9 il , 10, misacilazione fisiologica di asparaginil-e glutaminil-tRNAs5, o errori di decodifica ribosomiale2,3,11. Tassi di errore misurabilmente elevati, che rappresentano oltre 0.01/Codon, hanno suggerito che gli errori traslazionali possono eseguire funzioni fisiologiche1,12 e che la mistranslazione può essere specifica del contesto13.
Noi e altri abbiamo dimostrato che gli errori naturali nella traduzione genica possono essere adattativi, soprattutto durante lo stress ambientale1,5,12,14,15,16 ,17,18. Nei micobatteri, gli errori generati dalla via di aminoacilazione indiretta a due fasi di glutammina/asparagina tRNA19,20 determinano una tolleranza notevolmente aumentata per l'antibiotico antitubercolosi di prima linea rifampicina 5. Pertanto, abbiamo ipotizzato che diminuire la mistranizzazione micobatterica con una piccola molecola può potenziare l'uccisione con rifampicina. Abbiamo esaminato e identificato la kasugamicina di aminoglicoside naturale come un composto che potrebbe diminuire la mistranslazione micobatterica, potenziare l'uccisione mediata da rifampicina di mycobatteri sia in vitro che in vivo21, e limitare la emersione della resistenza di rifampicina21, che minaccia il controllo globale della tubercolosi22 — il patogeno più letale del mondo.
Per studiare l'errore traslazionale, devono essere impiegati metodi per la misurazione della mistranslazione. Ci sono diversi metodi che sono stati sviluppati per la misurazione della mistranslation, ognuna con vantaggi e svantaggi. Brevemente, i metodi basati sulla spettrometria di massa di precisione hanno diversi vantaggi, il più importante dei quali è che con algoritmi più recenti per la rilevazione di più tipi di errore traslazionale, una misura relativamente imparziale della mistranslazione può essere eseguita18. Tuttavia, la spettrometria di massa non è molto adatta per la misurazione di eventi di mistranizzazione di deamidazione — precisamente il tipo di mistranslazione che si verifica nei micobatteri a causa della via di aminoacilazione tRNA indiretta soggetta a errori. Questo è a causa della deamidazione non enzimatica ad alta frequenza che si verifica nella lavorazione di campioni per la spettrometria di massa23, risultante in un segnale di fondo estremamente elevato. Pertanto, per la rilevazione di errori in questo percorso, i reporter di guadagno di funzione genetica offrono vantaggi distinti. In particolare, i giornalisti di guadagno di funzione idonei possono avere tassi di sfondo estremamente bassi, permettendo la misurazione di tassi di errore molto bassi11.
Dal momento che l'esecuzione di esperimenti con patogeni Mycobacterium tuberculosis richiede strutture specializzate e precauzioni extra, eseguiamo la maggior parte degli esperimenti nel Mycobacterium M. smegmatis non patogeno-e hanno mostrato in precedenza che i risultati tra le due specie sono ampiamente comparabili5,21. Per misurare i tassi di mistranizzazione nei micobatteri generati dalla via di aminoacilazione indiretta di tRNA, abbiamo modificato un sistema a doppia luciferasi Renilla-Firefly che era stato precedentemente sviluppato per misurare gli errori di decodifica ribosomiale in E. coli 11 per l'uso in micobatteri. Abbiamo apportato tre modifiche specifiche: il giornalista originale non ha espresso efficacemente in micobatteri, e quindi, la sequenza è stata ottimizzata codone, e il C-terminale tre aminoacidi della luciferasi lucciola, Serina-lisina-leucina, che è stata annotata come segnale di traffico in alcuni sistemi24, è stata modificata in isoleucina-alanina-valina25. Il giornalista originale aveva un residuo di lisina critica nella lucciola luciferasi mutata. Invece, abbiamo mutato un residuo di aspartato (D120) o glutammato (E144) criticamente conservato nella Renilla luciferasi in asparagina e Glutammina, rispettivamente25 (Figura 1). Il giornalista è stato subclonato nel plasmide di pUV-tetOR episomiale-tetraciclina-inducibile (vedere la tabella dei materiali). I reporter di guadagno di funzione mutano i residui funzionali conservati in modo critico negli enzimi/proteine fluorescenti che li rendono non funzionali11,26. Gli errori traslazionali (o teoricamente trascrizionali) che sintetizzare la variante funzionale della proteina si tradurrebbero in attività enzimatica misurabile in un sottoinsieme di proteine tradotte. Per correggere la variazione dell'abbondanza proteica, il reporter mutato è coespresso con una proteina funzionale che funge da benchmark e consente una quantificazione accurata del guadagno di funzione11. Mentre il reporter Renilla-Firefly Dual-luciferase ha permesso la misurazione accurata di specifici tassi di mistranslazione micobatterica5,25 (Figura 2 e sezione 1 del protocollo), abbiamo rapidamente si rese conto che non è adatto per lo screening medio/alto rendimento di molecole che altererebbero il tasso di mistranslazione. Ciò è dovuto principalmente a due motivi, cioè a) la relativa mancanza di potenza di Renilla luciferasi significava che un minimo di 1 ml di coltura/campione micobatterico era necessario per misurare i tassi di mistranslazione, e b) il requisito per la lisi delle cellule prima alla misurazione dell'attività enzimatica richiedeva una manipolazione manuale eccessiva: le cellule micobatteriche hanno una parete cellulare spessa e multistrato e una busta che è relativamente resistente alla lisi. Pertanto, abbiamo cercato di sviluppare un nuovo sistema reporter di guadagno di funzione che potrebbe essere utilizzato con piccoli volumi (ad esempio, in un sistema a piastre 96-well) e non ha richiesto la lisi cellulare per le misurazioni. Abbiamo usato la molto potente nLuC luciferasi e identificato un residuo di aspartato critico che, quando mutato a asparagina, ha provocato 2 log perdita di funzione (Figura 1). Inoltre, le piccole dimensioni di nLuC gli consentivano di avere un tag di segnale di secrezione N-terminale — dall'antigene 85A, un importante antigene secreto nei micobatteri27 — che consentirebbero a nLuC di essere secreto nella coltura surnatante ed eludere il requisito di lisi cellulare. La proteina di riferimento, GFP, è stata espressa dallo stesso promotore del nLuC mutato, ma da un vettore integrato (vedere la tabella dei materiali), e potrebbe essere misurata in cellule integre21 (Figura 3). Nonostante questi vantaggi, il reporter nLuC/GFP (sezione 2 del protocollo) ha anche svantaggi: la riduzione relativamente modesta dell'attività di nLuC (100 volte) con la mutazione D140N non consentirebbe la misurazione di tassi di mistranslazione estremamente bassi, rendendo il giornalista più adatto come strumento di screening che per le misurazioni accurate di errore traslazionale. Inoltre, nLuC non ha residui di glutammato critico; Pertanto, possono essere misurati solo i tassi di errore di asparagina-aspartato. I principi generali descritti in questo lavoro dovrebbero consentire ai ricercatori di utilizzare questi giornalisti come abbiamo fatto o modificare i giornalisti come appropriato per una misurazione accurata e/o facile di altri tassi di errore traslazionali specifici nel loro sistema modello di scelta.

<table><tbody><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Anidrotetraciclina</td><td>Cayman Chemical&nbsp;</td><td></td><td></td>10009542</tr><tr><td>Kasugamycin</td><td>sigma</td><td>K4013</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di analisi reporter a doppia luciferasi</td><td>promega</td><td>E1960</td><td></td></tr><tr><td>Saggio della luciferasi Nano-Glo</td><td>promega</td><td>N1120</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent FL luminometro</td><td>Piastra termo</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>saggistica, 96 pozzetti bianchi, fondo piatto ad alto legame, senza coperchio</td><td>Costar</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di analisi, 96 pozzetti neri, fondo piatto High Biding, senza coperchio</td><td>Costar</td><td>3925</td><td></td></tr><tr><td>Cluster di coltura cellulare a 96 pozzetti, fondo piatto con coperchio</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Reagenti non commerciali (plasmidi)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUV-TetOR-RenFF</td><td>NA NA</td><td></td><td>plasmide navetta episomiale che consente l'espressione inducibile dalla tetraciclina del reporter a doppia luciferasi wild-type</td></tr><tr><td>pUV-TetOR-Ren-D120N-FF</td><td></td><td></td><td>reporter a doppia luciferasi con Renilla mutata</td></tr><tr><td>pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N</td><td>NA</td><td>NA</td><td>plasmide navetta episomiale con una versione secretabile inducibile da tetraciclina di Nluc luciferasi</td></tr><tr><td>mutata pMC1S-GFP</td><td>NA</td><td>NA Vettore</td><td>integrato micobatterico (sito L5) per l'espressione di GFP inducibile da tetraciclina</td></tr></tbody></table>

misurazione dei tassi di mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

La traduzione dei geni in proteine è soggetta a errori. Sebbene il tasso medio di errore traslazionale nei sistemi modello sia stimato a 1/10000 per codone, i tassi di errore effettivi variano ampiamente, a seconda della specie, dell'ambiente e dei codoni studiati. In precedenza abbiamo dimostrato che i micobatteri utilizzano un percorso in due fasi per la generazione di glutammina e asparagina tRNA amminocilato e che questo è specificamente associato a tassi di errore relativamente elevati a causa della modulazione dei tassi di mistranslazione da parte di un componente essenziale della via, l'amidotransferasi GatCAB. Abbiamo modificato un sistema di doppia luciferasi Renilla-Firefly precedentemente impiegato che era stato utilizzato per misurare i tassi di traduzione errata in Escherichia coli per l'uso in micobatteri per misurare i tassi di mistranslazione specifici del glutammato a glutamina codoni e aspartato per codoni di asparagina. Anche se questo sistema reporter era adatto per la stima accurata di tassi di errore specifici, la mancanza di sensibilità e requisiti per passaggi di manipolazione eccessiva reso non adatto per applicazioni ad alto throughput. Pertanto, abbiamo sviluppato un secondo sistema reporter di guadagno di funzione, utilizzando nLuC luciferasi e proteina verde fluorescente (GFP), che è più suscettibile di impostazioni di media/alta velocità. Abbiamo usato questo sistema per identificare la kasugamicina come una piccola molecola che può diminuire la mistranslazione micobatterica. Anche se i giornalisti che descriviamo qui sono stati utilizzati per misurare specifici tipi di traduzione errata micobatterica, possono essere modificati per misurare altri tipi di traduzione errata in un certo numero di sistemi di modelli.

Un fumetto che illustra il contorno generale dei due sistemi reporter utilizzati in questo lavoro sono mostrati nella Figura 1. Una panoramica della sezione 1 del protocollo è illustrata nella Figura 2 e una panoramica della sezione 2 nella Figura 3. L'effetto di kasugamicina sulla mistranslazione micobatterica è mostrato nella Figura 4, misurata dal sistema reporter Renilla-Firefly. Per mostrare la specificità dell'azione di kasugamicina, il giornalista è stato anche espresso in un ceppo di M. smegmatis in cui KSGA è stato cancellato (∆ KSGA). KsgA è un rRNA dimetiltransferasi, e i ceppi eliminati da KSGAsono relativamente resistenti alla kasugamicina. L'azione di kasugamicina sulla mistranslazione è stata misurata anche utilizzando il reporter nLuC/GFP, come mostrato nella Figura 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig1.jpg"> Figura 1 : Cartone animato che illustra i due sistemi reporter di guadagno di funzione. (A) la Renilla-Firefly reporter System è composto da due enzimi luciferasi espressi come proteina di fusione e sotto il controllo di un promotore di tetraciclina-inducible. L'espressione del doppio enzima wild-type si traduce in un'elevata attività misurabile sia di Renilla che di luciferasi lucciola (in alto). La mutazione di un residuo di aspartato critico, D120, in Renilla a asparagina rende l'enzima RENILLA (D120N) inattivo, ma la luciferasi lucciola è ancora attiva. La mistranslazione dell'asparagina all'aspartato (in questo caso, da ASP-tRNAASN tRNA5,21fisiologicamente misacilata) provoca una piccola proporzione delle proteine di Renilla tradotte guadagnando attività, che possono essere misurati. Il confronto dell'attività Renilla/Firefly del reporter mutato rispetto al doppio enzima Wild-Type consente il calcolo dell'asparagina in un tasso di mistranslazione dell'aspartato. B) il sistema reporter nLuC/GFP opera su un principio analogo. Il gene mutato nLuC (D140N) ha un segnale di secrezione N-terminale derivato dall'antigene 85A, una proteina micobatterica principale secreto. Entrambi i geni nLuC e GFP sono espressi da promotori di tetraciclina-inducible identici, per consentire l'uso di GFP come riferimento di espressione relativa. Notate la mancanza di ceppo di controllo di tipo selvaggio nLuC: questo reporter è utilizzato principalmente nello screening, dove le misurazioni dei tassi di traduzione errata relativi sono sufficienti per lo schermo principale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig2.jpg"> Figura 2 : Schema di misurazione del tasso di mistranslazione utilizzando Renilla-reporter Firefly (sezione 1 del protocollo). Vengono coltivate colture fresche di M. smegmatis, trasformate con un plasmide che esprime i giornalisti dual-luciferasi. L'espressione reporter è indotta, e sono testati composti o condizioni sperimentali. Dopo 4-6 h di espressione reporter, le colture sono pellettate e lisate e i lisati sono testati per l'attività della doppia luciferasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig3.jpg"> Figura 3 : Schema di misurazione del tasso di mistranslazione nLuC-GFP reporter (sezione 2 del protocollo). Una nuova cultura di M. smegmatis, trasformata con i giornalisti nLuC e GFP, è cresciuta fino a un volume sufficiente per tutte le piastre da testare (assumendo ~ 10 ml/96-pozzetto piatto). Immediatamente prima di pipettare la coltura batterica in ogni pozzo, indurre l'espressione dei giornalisti con ATC aggiunto alla coltura di massa. Incubare i pozzi scuotendoli durante la notte. Per misurare i tassi di mistranslazione relativi, trasferire le colture a una piastra nera (per aumentare la sensibilità del rilevamento della fluorescenza), misurare la fluorescenza GFP, e poi, girare le piastre verso il basso per pellet i batteri. Trasferire il supernatante su una piastra bianca per la misurazione dell'attività nLuC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig4.jpg"> Figura 4 : Risultato rappresentativo dell'uso di Renilla-Firefly reporter che misura il tasso di mistranslazione in presenza di kasugamicina in diversi ceppi. I tassi di mistranslazione dell'aspartato per l'asparagina in (a) Wild-Type M. smegmatis e (B) un ceppo eliminato per KSGA (∆ KSGA) dopo il trattamento con kasugamicina (KSG) come misurato dal Renilla-Firefly Dual Reporter. Le colture sono state trattate con kasugamicina a dosi indicate (in microgrammi/millilitro) per 6 ore prima della lisi e delle misurazioni delle cellule. I rapporti Ren/FF corretti (assi y) sono indicativi dell'aspartato per i tassi di mistranslazione dell'asparagina. La soppressione dei risultati di KSGA in un tasso di traduzione errata basale più elevato, che è più resistente alla modulazione da kasugamicina. Le barre indicano i valori medi, con deviazione standard come errore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59453/59453fig5.jpg"> Figura 5 : Risultato rappresentativo dell'uso del reporter nLuC-GFP che misura il tasso di mistranslazione in presenza di kasugamicina. Tassi di traduzione errata relativi di aspartato per asparagina in tipo selvaggio M. smegmatis misurata dal reporter nLuC/GFP, dopo il trattamento con kasugamicina (KSG) durante la notte (16 h). Le barre indicano i valori medi, con deviazione standard come errore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59453/59453fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>

In questo articolo, presentiamo due metodi complementari per misurare i tassi specifici di errore traslazionale e la traduzione errata nel modello Mycobacterium, mycobacterium smegmatis, utilizzando sistemi reporter di guadagno di funzione. I metodi possono essere impiegati per misurare i tassi di errore accurati in bassa velocità effettiva o tassi di errore relativi in un'impostazione di throughput più elevato.

Misurazione dei tassi di Mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

La sintesi proteica è soggetta a errori. Tuttavia, gli errori possono essere adattivi sotto stress fisiologico. In precedenza abbiamo dimostrato che errori di traduzione specifici nel micobatterio sono fattori che contribuivano alla tolleranza agli antibiotici.Essere in grado di misurare tassi di errore specifici ci consente di indirizzare questo meccanismo adattivo ai batteri. I principali vantaggi di queste tecniche sono che i giornalisti a guadagno di funzione possono essere squisitamente sensibili nel misurare piccoli tassi di errore che non sono facili da rilevare con la spettrometria di massa. Il test Nluc/GFP consente lo screening della produttività media poiché evita un'eccessiva manipolazione e llisi dei batteri.A dimostrare la procedura sarà lo studente di dottorato Yue-Meng Chen. Oggi dimostreremo la procedura di utilizzo di questi due giornalisti attraverso questo video. Per cominciare, inoculare due millilitri di mezzo 7H9 con ceppi di reporter micobatterici di tipo selvaggio e mutato.Agitare a 37 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria. Aliquota e diluire per ottenere un OD a 600 nanometri intorno a 0,5 a 1. Quindi, aggiungere ATC a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro.Aggiungere immediatamente diverse dosi di ksg alla coltura in base al manoscritto per misurarne gli effetti sui tassi di traduzione errata. Incubare a 37 gradi Celsius con scuotimento per quattro o sei ore. Successivamente, trasferire le colture batteriche in un tubo da due millilitri.E centrifugare a 3.220 volte g a temperatura ambiente per cinque minuti per pellettare i batteri. Dopo la fase di centrifugazione, scartare il supernatante e interrompere i batteri aggiungendo 40 microlitri di tampone di lisi passiva 1x. Trasferire il lysate batterico rimsorsi su una piastra bianca da 96 po ', un pozzo per campione, e agitare a temperatura ambiente per 20 minuti.Aggiungere 80 microlitri di substrato di lucciola ad ogni pozzo. Agitare per 15 secondi e misurare la luminescenza di un luminometro. Quindi, aggiungere 80 microlitri di substrato di Renilla ad ogni pozzo.Agitare per 15 secondi e misurare la luminescenza dal luminometro. Utilizzare i valori corretti per calcolare i tassi di traduzione errata di ogni condizione. Per iniziare, inoculare due millilitri di mezzo 7H9 con il ceppo reporter batterico.Agitare a 37 gradi Celsius per uno o due giorni o fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria. Quindi, la sottocoltura in 50 millilitri di mezzo 7H9 e crescere fino a quando l'OD a 600 nanometri raggiunge la fase stazionaria tardiva. Prima di aliquotare i batteri su una piastra da 96 pozzetti, aggiungere ATC a una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro e mescolare bene.Aggiungere 100 microlitri per pozzo a una piastra chiara a fondo rotondo da 96 po'. Successivamente, aggiungere diverse dosi di ksg ai pozzi selezionati per schermarne gli effetti sui tassi di traduzione errata. Aggiungere 200 microlitri di acqua sterile ai pozzi di bordo della piastra per limitare l'evaporazione dai pozzi del campione.Sigillare la piastra, agitare e indurre i campioni a 37 gradi Celsius per 16-20 ore. Utilizzare una pipetta multicanale per prescivole 80 microlitri da ogni pozzo. Trasferire i campioni su una piastra a 96 po' dal fondo nero e misurare il segnale GFP dal luminometro.Dopo aver misurato il segnale GFP, centrifugare la piastra a 3.220 volte g per 10 minuti. Quindi, trasferire 50 microlitri del supernatante su una piastra bianca da 96 porri. Quindi, aggiungere 50 microlitri di substrato Nluc ad ogni pozzo.Mescolare bene e misurare la luminescenza dal luminometro. Infine, determinare il rapporto Nluc/GFP dividendo il valore corretto della luminescenza di Nluc per la fluorescenza GFP. In questo lavoro, il sistema di reporter di lucciola Renilla è stato utilizzato per misurare il tasso di traduzione errata in presenza di kasugamicina in tipo selvaggio e in un ceppo di S.Smegmatis che ksgA è stato eliminato.I risultati hanno mostrato un chiaro modo dose-dipendente di ksg diminuendo il tasso di traduzione errata mentre nel ceppo di cancellazione ksgA, ksg era meno potente e la linea di base del tasso di traduzione errata era più alta a causa della resistenza alla modulazione da kasugamicina. L'azione della kasugamicina sulla traduzione errata è stata misurata anche utilizzando il reporter Nluc/GFP. Sia renilla lucciola che giornalista Nluc/GFP comportano la misurazione dell'attività della luciferasi.Piccoli errori di pipettazione potrebbero causare grandi fluttuazioni nelle letture. Per cominciare, ti consigliamo di aumentare il numero di ogni replica per ridurre al minimo la possibilità di ottenere letture inaffidabili.

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Qui descriviamo un robusto test biologico per quantificare il tasso relativo di proteolisi da parte del sistema ubiquitina-proteasoma. La lettura del saggio è il tasso di crescita del lievito in coltura liquida, che dipende dai livelli cellulari di una proteina reporter che comprende un segnale di degradazione fuso con un marcatore metabolico essenziale.

Saggio di crescita a base Reporter, per l&#39;analisi sistematica di proteine ​​degradazione

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo avanzato per sintetizzare alte rese di proteine ricombinanti da un sistema di trascrizione senza cellule streptomyces venezuelae (TX-TL).

Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Impara a misurare i tassi di errori di traduzione in Mycobacterium smegmatis utilizzando sistemi reporter di guadagno di funzione. Questi metodi consentono rilevamenti sensibili per studiare la resistenza agli antibiotici.

Misurazione dei tassi di Mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione

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