Multi-locus Numero variabile Tandem-ripetizione Analisi del batterio patogeno del pesce Yersinia ruckeri di Multiplex PCR e elettroforesi capillare

Questo protocollo di genotipizzazione della MLB ha notevolmente aumentato la nostra comprensione dell'epidemiologia e della struttura della popolazione globale di Yersinia ruckeri, un batterio patogeno dei pesci di importanza internazionale. Rispetto agli schemi di tipizzazione Yersinia ruckeri precedentemente stabiliti, offre una risoluzione di deformazione molto elevata. La procedura è semplice, economica e assegna risultati portatili che possono essere facilmente confrontati tra i laboratori.

La tecnica migliora notevolmente la specificità diagnostica e consente il tracciamento delle infezioni. Ad esempio, ora possiamo spesso distinguere i cloni virulenti di Yersinia ruckeri esistenti sullo sfondo di ceppi ambientali non virulenti. A dimostrare la procedura sarà Saima Nasrin Mohammad, un tecnico del nostro laboratorio.

Per iniziare, utilizzare anelli di inoculazione sterili per seminare colture pure yersinia ruckeri su qualsiasi tipo di agar adatto sulle piastre di Petri. Incubare a 22 gradi Celsius per uno o due giorni o 15 gradi Celsius per tre o quattro giorni. Successivamente, utilizzando anelli di inoculazione, raccogliere una singola colonia rappresentativa da ogni piastra di Petri e trasferirli in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri, contenenti 50 microlitri di acqua ultra purificata da risospendire.

Vortice brevemente e incubare per sette minuti su un blocco riscaldante a 100 gradi Celsius. Quindi, centrifugare a 16.000 g per tre minuti e utilizzare una pipetta per trasferire con cura il DNA del modello supernatante in tubi di centrifuga vuoti da 1,5 millilitri. Procedere al passaggio successivo o conservare il DNA a 20 gradi Celsius.

Per preparare le miscele master, calcolare prima i volumi di reagenti in base al numero di campioni batterici da analizzare, rappresentando anche un controllo negativo e uno positivo e un volume finale del 10% in eccesso, come dettagliato nel manoscritto. Si noti che vengono utilizzate diverse concentrazioni di primer. In due tubi di centrifuga separati, uno per test PCR, aggiungere PCR multiplex più mix master, primer e acqua priva di RNasi.

Vortex il master preparato si mescola delicatamente a bassa velocità e quindi distribuisce 22 microlitri di ogni master mix separatamente in singoli pozzi su strisce o piastre PCR. Quindi, aggiungere tre microlitri del modello di DNA preparato a ciascun mix master ben contenente;due pozzi per campione di batteri, uno per ogni saggio. Usa il DNA di un ceppo Yersinia ruckeri verificato per un controllo positivo e l'acqua ultra purificata per un controllo negativo.

Sigillare e centrifugare brevemente. Caricare le reazioni preparate su un termociclore PCR e impostare il programma in base al manoscritto. Il programma verrà completato in meno di tre ore.

Secondo le raccomandazioni del produttore, aggiungere la polvere di gel di agarosio in un tampone TBE una volta per raggiungere l'1,5 peso / volume per cento e il calore per dissolversi. Prima della fusione, raffreddare brevemente la soluzione di gel disciolto sotto l'acqua corrente, aggiungere 5 microlitri di colorante acido nucleico fluorescente per 50 microlitri di soluzione di gel e mescolare. Assemblare e livellare il vassoio di colata.

Aggiungere coni in base al numero di campioni. Versare la soluzione di gel nel cast e attendere che si solidifichi. Successivamente, immergere il getto contenente il gel in un tampone TBE una t volte in un sistema di elettroforesi in gel.

Mescolare cinque microlitri dei prodotti PCR insieme a due microlitri di colorante di carico in nuove strisce PCR. Trasferire cinque microlitri delle miscele nei pozzi del gel. Salvare almeno un pozzo vuoto.

Aggiungere cinque microlitri di scala del DNA nel pozzo vuoto come riferimento. Collegare gli elettrodi ed eseguire il gel a 110 volt per 15 centimetri per circa un'ora. Utilizzare un sistema di imaging gel basato su UV per verificare la presenza di più bande che rappresentano gli ampliconi RPC.

A seguito della conferma delle ampliconi PCR, utilizzare nuove strisce o piastre PCR per diluire i prodotti PCR da uno a 10 in acqua purificata. Vortice e centrifuga brevemente. Mentre si lavora in un armadio fumi, preparare un mix master in un tubo di centrifuga costituito da formamide e soluzione standard di dimensioni di riferimento.

In base al numero di prodotti PCR da analizzare, utilizzare volumi di reagenti come descritto nel manoscritto. Consentire un volume in eccesso del 10%. Vortice brevemente e distribuire 9,5 microlitri in singoli pozzi su una piastra PCR appropriata per il sistema di elettroforesi capillare disponibile.

Quindi, aggiungere 0,5 microlitri di prodotto PCR diluito. Sigillare e centrifugare brevemente. Quindi, caricare la piastra contenente i campioni in un termociclore PCR e denaturare i campioni a 95 gradi Celsius per tre minuti prima di raffreddarsi a quattro gradi Celsius indefinitamente.

Centrifugare a 1000 g per un minuto, rimuovere con cura la guarnizione e caricare la piastra su un sistema di elettroforesi capillare calibrato secondo le istruzioni del produttore. Eseguire l'elettroforesi capillare di analisi dei frammenti, utilizzando reagenti appropriati per l'apparato di scelta, e regolare le condizioni di esecuzione in base alla descrizione nel manoscritto. Per le chiamate di dimensione dell'elettroforesi capillare Yersinia ruckeri VNTR, importare prima i file dei risultati dell'elettroforesi capillare nel software Gene Mapper 5.

Impostare il metodo di analisi su Microsatellite Default, selezionare la scelta appropriata del prodotto in base allo standard di dimensione, quindi premere il pulsante Analizza. Attraverso l'editor di corrispondenza delle dimensioni, verificare la corretta identificazione dei frammenti standard di dimensioni e correggere eventuali allocazioni visibilmente errate. Selezionare quindi l'esempio da leggere, premere il pulsante Visualizza plottaggio e premere Ctrl A per abilitare la visualizzazione della tabella di ridimensionamento.

Mentre sei nel pannello superiore, tieni premuto Ctrl, mentre fai clic sui cinque picchi che rappresentano gli ampliconi VNTR. Premere Ctrl G per filtrare la tabella di ridimensionamento, mostrando solo le caratteristiche dei cinque picchi evidenziati, e registrare le chiamate di dimensione per ogni locus VNTR per l'applicazione downstream. Al fine di tenere conto dei modelli di mobilità dell'amplicone distorto durante l'elettroforesi capillare, calcolare conteggi accurati delle ripetizioni VNTR impiegando le chiamate di dimensione acquisite in combinazione con le variabili specifiche del locus.

La formula può essere implementata in un modello di foglio di calcolo per l'automazione. Nel foglio di calcolo, la ripetizione VNRT calcolata di arrotondamento viene conteggiata all'intero più vicino prima dell'analisi downstream. Nel software BioNumerics, creare un nuovo database e scegliere di attivare il plug-in MLVA.

Nel pannello tipo di esperimento, premete Crea nuovo tipo di esperimento, scegliete Tipo carattere e usate le impostazioni predefinite quando richiesto. Quindi selezionare il nuovo esperimento e aggiungere nuovi caratteri per ciascuno dei loci 10 VNTR, utilizzando da zero a 100 come intervallo di valori. Di nuovo nel pannello principale, importare i conteggi delle ripetizioni VNTR yersinia ruckeri e i dati del metodo selezionando campi e caratteri di importazione.

Individuare il file in cui è archiviato ed effettuare selezioni nella colonna Tipo di destinazione. Per i VNTR, ciò significa selezionare il valore del carattere appropriato, mentre i metadati vari vengono classificati come campi delle informazioni di immissione. Le scelte effettuate possono essere memorizzate come modello al fine di facilitare il processo per un secondo momento.

Selezionate campioni importati destinati all'analisi del cluster MST, quindi fate clic sul pulsante Crea nuovo confronto nel pannello Confronti. Se lo si desidera per la presentazione visiva dell'MST, allocare i campioni a gruppi colorati, ad esempio in base a una particolare funzionalità di metadati. Selezionare Quindi Analisi cluster avanzata e MST per i dati categorici per generare un diagramma MST basato sugli esempi scelti.

Modificare ulteriormente la presentazione visiva dell'MST aggiungendo parametri di partizione, lunghezze trasversali, etichettatura del ramo del nodo, ecc. Se necessario, esportare l'MST finalizzato nel formato desiderato utilizzando la selezione Esporta immagine. Seguendo la PCR multiplex, l'immagine di elettroforesi in gel verifica la presenza di ampliconi multipli in tutte le 12 corsie contenenti campioni, con la prima corsia che rappresenta la scala del DNA utilizzata.

Negli elettroferogrammi risultanti dall'elettroforesi capillare, i diversi loci VNTR possono essere identificati in base a una combinazione di dimensioni ed etichettatura del colorante. I picchi arancioni rappresentano lo standard di dimensione impiegato. Viene mostrato un esempio di albero di spanning minimo, basato sui profili MLVA degli isolati Yersinia Ruckeri recuperati dal salmone atlantico in cinque diverse fattorie norvegesi.

Si osserva una chiara tendenza al raggruppamento legata all'origine dell'azienda. L'identificazione da parte del MLVA di diversi cloni di Yersinia ruckeri che dominano, ad esempio, in particolari regioni geografiche di specie ittiche, è già stata sfruttata per migliorare le strategie di vaccinazione contro questo agente patogeno.