Name: Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Impara a valutare la molteplicità sinaptica nei neuroni utilizzando l'elettrofisiologia patch-clamp su fette cerebrali acute. Questo metodo permette di stimare i contatti sinaptici multipli in diverse specie e aree cerebrali.

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J.S. ricevuto Ontario Graduate Scholarship. W.I. ha ricevuto un nuovo investigatore Fellowship dal Canada di ricerca sulla salute mentale. Questo lavoro è supportato da sovvenzioni di funzionamento a w. i da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada (06106-2015 RGPIN) e il Canadian Institute for Health Research (PJT 148707).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato di cura di animale della University of Western Ontario in conformità con il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali (AUP n. 2014-031).
1. soluzioni
<ol><li>
Soluzione per affettare
	<ol>
<li>Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della soluzione per affettare.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
		<li>Per soluzione 1x per affettare, sciogliere NaHCO3, glucosio e saccarosio in ddH2O e aggiungere il brodo di 20x. Garantire che l'osmolarità è tra 315-320 mOsm e conservare la soluzione per non più di 1 settimana a 4 ° C.</li>
		<li>Riempire due becher con 100 mL di soluzione di affettare e coprirli con parafilm. Raffreddare la soluzione in un congelatore fino a quando la soluzione diventa parzialmente congelata (circa 20 min in congelatore a-80 ° C). Utilizzando un tubo di dispersione di gas, bubble entrambi beakers affettare soluzione con 95% O25% CO2 per 20 minuti sul ghiaccio.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="5">Concentrazioni di soluzione (mM)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Affettare</td>
			<td>ACSF normale</td>
			<td>Basso Ca2 + aCSF</td>
			<td>ACSF SR+</td>
			<td>Pipetta/interno</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>87</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>126</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>0,5</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>SrCl2
</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>7</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.5</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>1.25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>25</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glucosio</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Saccarosio</td>
			<td>75</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>K-gluconato</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>116</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na-gluconato</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2-EGTA</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2ATP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na3GTP</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Composizione di varie soluzioni.
<ol start="2"><li>
aCSF (per fetta recupero e manutenzione)
	<ol>
<li>Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della aCSF.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
		<li>Per 1 x aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere il brodo di 20x. Garantire che l'osmolarità è tra 298-300 mOsm. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (basso Ca2 + per la registrazione)
	<ol>
<li>Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione del basso Ca2 + aCSF.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
		<li>Per 1 x basso Ca2 + aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere 20 (CaCl2 e MgCl2 gratis) stock e CaCl2 MgCl2 a specificato concentrazioni. Garantire che l'osmolarità è tra 298-300. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
aCSF (Sr2 + per la registrazione)
	<ol>
<li>Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione di Sr2 + aCSF.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock 20x in anticipo e conservare a 4 ° C per 1 mese.</li>
		<li>Per 1 x Sr2 + aCSF, sciogliere NaHCO3 e glucosio in ddH2O e aggiungere 20 (CaCl2 e MgCl2 gratis) stock, SrCl2 e MgCl2 a specificato concentrazioni. Garantire che l'osmolarità è tra 298-300. Utilizzare la soluzione entro 1 giorno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Soluzione interna
	<ol>
<li>Fare riferimento alla tabella 1 per la composizione della soluzione interna K-gluconato basato.</li>
		<li>Per rendere 20 mL di soluzione interna, aggiungere 15 mL di acqua di grado di biologia molecolare per un tubo da 50 mL. Eseguire i passaggi successivi sul ghiaccio.</li>
		<li>Preparare le seguenti soluzioni prima del tempo per 1m stock concentrazioni nella biologia molecolare acqua di grado. Aggiungere (in mL): 2,32 K-gluconato, 0.24 Na-gluconato, 0,20 HEPES, 0.16 KCl, 0,05 K2-EGTA, 0.04 MgCl2 per il tubo da 50 mL.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di 0,3 M Na3GTP.</li>
		<li>Pesare 44,08 mg di K2ATP in un tubo del microcentrifuge 2 mL e aggiungere 1 mL di acqua di grado di biologia molecolare, quindi aggiungere alla provetta da 50 mL.</li>
		<li>Regolare il pH a 7,2-7,4 con 1 M di KOH. Garantire che l'osmolarità è tra 283-289 mOsm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fetta preparazione
<ol><li>
Preparare strumenti
	<ol>
<li>Aggiungere 200 mL di aCSF alla camera di recupero (costruita da un becher da 250 mL con 4 pozzi e reticolato) e posizionare la camera di recupero in un bagno d'acqua (35 ° C).</li>
		<li>Coprire la camera con un film di paraffina e costantemente bolla il aCSF con 95% O25% CO2 utilizzando un tubo di dispersione di vetro per almeno 20 min.</li>
		<li>Preparare per la dissezione impostando gli strumenti (bisturi, forbici bene angolate, forcipe, pennello fine, cucchiaio di plastica).</li>
		<li>Riempire una siringa da 60 mL con circa 15 mL di soluzione per affettare ghiacciata dal punto 1.1.4.</li>
		<li>Preparare la piattaforma di dissezione inserendo un filtro di carta sul coperchio di una piastra ben.</li>
		<li>Preparare la camera per affettare collocandolo nel vassoio di ghiaccio e riempire il vassoio con ghiaccio.</li>
		<li>Impostare il vibratome fissando una lametta monouso del portalama.</li>
		<li>Rendere una pipetta di trasferimento rompendo la punta di una pipetta di Pasteur e posizionando un bulbo di gomma sopra l'estremità rotta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sezionare il cervello del topo
	<ol>
<li>Anestetizzare l'animale in una camera saturata di 4% isoflurane, fino a quando i riflessi spinali sono assenti.</li>
		<li>Decapitare l'animale utilizzando una ghigliottina e rimuovere rapidamente il cervello.<ol>
<li>Fare un'incisione del midline con una lama per bisturi n ° 22 da rostral alla caudale.</li>
			<li>Lateralmente e sbucciare il cuoio capelluto su ciascun lato della testa.</li>
			<li>Uso di forbice per tagliare il cranio su un lato da caudale rostrale (inclusi il lato delle ossa frontali), prestando attenzione a non per danneggiare il cervello.</li>
			<li>Uso forcipe per sollevare il pezzo di cranio off il cervello e raffreddare rapidamente il cervello con 15 mL di soluzione per affettare ghiacciata usando la siringa dal punto 2.1.4.</li>
			<li>Sollevare il cervello dal cranio.</li>
			<li>Posto il cervello in uno dei bicchieri riempiti con soluzione ghiacciata per affettare (dal punto 1.1.4), gorgogliare con 95% O25% CO2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparare fette dell'ipotalamo del mouse
	<ol>
<li>Bloccare il cervello per l'area del cervello desiderata e angolo di taglio (ad es., per le fette ipotalamiche coronale, tagliare il tessuto rostrale del chiasma e caudale al ponte con una lama e garantire il blocco caudale ha una superficie piana perpendicolare alla base del cervello).</li>
		<li>Utilizzando un pezzo di carta da filtro, pick up il cervello dal lato anteriore e lato posteriore alla lamiera di supporto utilizzando colla istantanea per colla.</li>
		<li>Rapidamente posizionare la piastra nella camera di affettare e riempire la camera con affettare soluzione da secondo Becher al punto 1.1.4.</li>
		<li>Fissare il vassoio camera e ghiaccio per affettare il del vibratome.</li>
		<li>Definire l'area per affettare (anteriore e posteriore al cervello) e iniziare affettare 250 µm fette di spessore della corona. Parametri consigliati: 0.10 mm/s, ampiezza di velocità 2 mm.</li>
		<li>Tagliare le fette la dimensione desiderata per l'area del cervello desiderata.</li>
		<li>Recuperare le fette a 35 ° C per 30-45 min. Quindi, rimuovere la camera di recupero dal bagno riscaldamento e consentire le fette di recuperare a temperatura ambiente per un minimo di 30 ulteriori fette di mantenere a temperatura ambiente per il resto della giornata e continua a propagarsi il bagno costantemente con 95% O25% CO2 .</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cellule intere Patch ClampRecording
<ol><li>
Tirare le pipette di patch
	<ol>
<li>Utilizzando i parametri suggeriti per la registrazione da manuale di puller pipetta della intero-cellula, tirare pipette patch da vetro murata spessore per una resistenza di pipetta di 3-5 MΩ.</li>
		<li>Con una microsiringa (commerciale o fatti in casa), riempire un puntale filtrato soluzione interna. Per rendere una microsiringa, bruciare la punta di una siringa da 1 mL e permettere che la punta a cadere creando una multa lunga suggerimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ottenere la configurazione di cellule intere
	<ol>
<li>Inserire la pipetta di registrazione appena sopra la pipetta fetta e offset corrente in modalità tensione morsetto. Applicare una leggera pressione positiva per la pipetta e bloccare il rubinetto.</li>
		<li>Selezionare una cellula sana con una membrana intatta e avvicinarsi alla cella con la pipetta. La pressione positiva dovrebbe causare una leggera dispersione nel tessuto (cioè un'onda lenta nel tessuto entrando).</li>
		<li>Lentamente continuare a portare la pipetta più vicino alla cella tramite un movimento diagonale fino a quando la pipetta forma una fossetta sulla superficie delle cellule.</li>
		<li>Rilasciare il blocco di pressione positiva. La cella inizierà a formare un sigillo e la resistenza aumenta sopra 1 GΩ. Nel morsetto di tensione, tenere la cella a -68 mV.</li>
		<li>Tirare leggermente dalla cella diagonale per rimuovere l'eccesso di pressione dalla cella.</li>
		<li>Compensare la capacitanza pipetta veloce e lento.</li>
		<li>Applicare una breve aspirazione attraverso il tubo collegato al titolare della pipetta di rompere attraverso la cella e ottenere la configurazione di cellule intere.</li>
		<li>Passare alla modalità di cella sulla membrana prova finestra in un elettrofisiologia acquisizione dati e software di analisi (ad esempio, Clampex).</li>
		<li>Prima di ogni morsetto di tensione registrazione, eseguire un test di membrana utilizzando lo stesso software e registrare i parametri pertinenti in un libro di laboratorio (resistenza di membrana, accesso resistenza e capacità).</li>
		<li>Mantenere la temperatura del bagno registrazione a 27 – 30 ° C e la portata a 1,5 – 2,0 mL/min per esperimenti successivi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. molteplicità esperimenti
<ol><li>
Esperimento 1: stima molteplicità utilizzando 4-AP
	<ol>
<li>Nel morsetto di tensione, tenere la cella a -68 mV. Utilizzando lo stesso software, registrare il sEPSC mentre che irrora il bagno con basso Ca2 + aCSF. Record per almeno 5 minuti dopo l'inizio della configurazione di cellule intere per garantire una registrazione della linea di base stabile come l'attività sinaptica può essere elevato poco dopo lo sfondamento della membrana.</li>
		<li>Usando una micropipetta, aggiungere 4-AP per il aCSF e vasca applicare 30 µM 4-AP Record sEPSC per almeno 10 minuti ottenere l'effetto della droga completo.</li>
		<li>Aggiungere 0,5 µM TTX e 10 µM Cd2 + aCSF con AP-4 e registrare il mIPSCs per almeno 10 min.</li>
		<li>Per l'analisi offline, è necessario utilizzare l'ultimo min 1 della linea di base immediatamente prima dell'applicazione della 4-AP (in basso Ca2 + aCSF), il 10 di applicazione AP-4 e il 10 min di applicazione TTX.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esperimento 2: desincronizzarsi rilascio vescicola mediante Sr2 +
	<ol>
<li>Mentre che irrora il bagno con normale Ca2 + aCSF (lo stesso il bagno aCSF) record sEPSC per almeno 5 min.</li>
		<li>Passare dal Ca2 + aCSF normale e iniziare che irrora Sr2 + aCSF (dal punto 1.4) e record sEPSC.</li>
		<li>Per l'analisi offline, per determinare se il sEPSC di grande ampiezza sono a causa del rilascio sincrono delle vescicole, confrontare l'ultimo min 1 della linea di base (in normale aCSF) per il 10° minuto di applicazione Sr2 + aCSF.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esperimento 3: test per rilascio multivesicular utilizzando Γ- DGG
	<ol>
<li>In basso Ca2 + aCSF record sEPSC per almeno 5 min.</li>
		<li>Aggiungere 30 µM 4-AP aCSF attraverso il sistema di perfusione. SEPSC record per almeno 10 min.</li>
		<li>Aggiungere 200 µM γ-DGG aCSF con AP-4 e registrare il sEPSC per almeno 10 min.</li>
		<li>Come un esperimento di controllo in una cella separata, eseguire i passaggi 1-3 ma applicare una bassa concentrazione (125 nM) di DNQX invece di γ-DGG.</li>
		<li>Per l'analisi offline, analizzare gli ultimi minuti di ogni applicazione della droga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esperimento 4: Stimolare afferenti ingressi per aumentare il potenziale di azione infornamento.
	<ol>
<li>Record sEPSC in Ca2 + aCSF normale.</li>
		<li>Stimolare le afferenze utilizzando un elettrodo monopolare vetro riempito con aCSF a una frequenza di 20 Hz per 2 s e ripetere 10 volte con un intervallo Inter-raffica di 20 sec.</li>
		<li>Per l'analisi, utilizzare il ms 5.000 prima il primo stimolo come base di riferimento e confrontare con il 10-300 ms dopo lo stimolo finale e poi prendere la variazione di ampiezza e frequenza media oltre 10 prove.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analisi
<ol><li>Analizzare sEPSC e mIPSCs utilizzando un programma che rileva e analizza delle correnti sinaptiche (ad es., software di analisi di Mini).<ol>
<li>Usando questo software, utilizzare i parametri di rilevamento suggerito per la rilevazione EPSC recettore AMPA (o EPSC di recettore GABA in caso di registrazione correnti inibitorie).</li>
		<li>Utilizzare la funzione di analisi senza scali per rilevare EPSC nella registrazione.</li>
		<li>Manualmente la scansione di ogni registrazione per garantire che il programma è rilevare con precisione ogni evento (ad esempio, garantire eventi non vengono perse o contato due volte).</li>
		<li>Esportare i dati di evento copiarlo negli Appunti e incollarlo in un software di gestione dati (ad esempio, Excel)</li>
		<li>Calcolare la frequenza media e/o ampiezza per ogni trattamento farmacologico ed eseguire analisi statistiche pertinenti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare

Un importante requisito per un esperimento di successo patch clamp Elettrofisiologia è ottenere fette/cellule sane. Il nostro protocollo descritto è ottimizzato per fette ipotalamici che contengono neuroni PVN. Altre aree potrebbero richiedere di cervello per volta soluzioni e affettare metodi21,22,23,24. Per la registrazione, è fondamentale per accettare solo registrazioni stabile monitorando ...

Trasmissione sinaptica è un meccanismo fondamentale per la comunicazione tra neuroni e quindi, funzione cerebrale. Trasmissione sinaptica anche è labile e può cambiare la sua efficacia in maniera dipendente di attività anche come in risposta a segnali modulatoria1. Così, esaminando funzione sinaptica è stato dei principali obiettivi di ricerca in neuroscienza. Elettrofisiologia di cellule intere patch clamp è una tecnica versatile che permette di comprendere, di elaborare disegni sperimentali e analisi dei dati, approfondite meccanismi biofisici e molecolari della trasmissione sinaptica. Un approccio comunemente utilizzato, forse a causa della semplicità del concetto e tecnica, è la misura delle correnti postsinaptico eccitatorio/inibitorio in miniatura (mE / IPSCs) nell'ambito della tensione morsetto configurazione2,3, 4 , 5 , 6. mPSCs individuali rappresentano il flusso di ioni attraverso recettori ionotropici postsinaptici (ad es. recettori AMPA e GABAA ) in risposta all'associazione dei loro rispettivi neurotrasmettitori rilasciati dal terminale presinaptico 7 . Perché la registrazione si ottiene in presenza della tensione-gated Na+ canale bloccanti della tetrodotossina (TTX), l'uscita è indipendente dal potenziale d'azione e prevede normalmente una singolo delle vescicole sinaptiche che contiene del neurotrasmettitore. Basato su questo presupposto, l'ampiezza media di mPSCs è ampiamente usato come una stima grezza per la dimensione quantal, che rappresenta il numero e la funzionalità dei recettori postsinaptici opposte di un singolo sito. D'altra parte, la frequenza di mPSCs è considerata di rappresentare una combinazione del numero totale delle sinapsi che chiude sulla cellula postsinaptica e loro probabilità di rilascio medio. Tuttavia, questi parametri non misurare un'altra variabile-multiplicativity di sinapsi, o molteplicità sinaptica — che è importante per l'efficacia della trasmissione sinaptica.
Basato sulla teoria quantal della trasmissione sinaptica7,8,9, la forza di una determinata connessione tra una coppia di neuroni è dipendente da tre fattori: il numero delle sinapsi funzionali (N), il risposta postsinaptica al rilascio di una singola vescicola sinaptica (quantal dimensione; Q) e la probabilità di rilascio di neurotrasmettitore (Pr). Sinaptica molteplicità equivale a N. Lo sviluppo di molteplicità sinaptica o la potatura delle sinapsi moltiplicative è plastica nel corso dello sviluppo e nella malattia diversi stati3,4,6,10. Per questo motivo, che caratterizzano la molteplicità sinaptica ha implicazioni importanti per comprendere l'efficacia della trasmissione sinaptica nella salute e nella malattia. Tecniche, come il microscopio elettronico possono identificare prove strutturali di molteplicità sinaptica rilevando più contatti sinaptici provenienti dall'assone stesso sulla stesso neurone postsinaptico11,12, 13,14. Tuttavia, questi multisynapses strutturalmente identificati possono essere funzionalmente silenzioso15,16. Esame preciso funzionale di N richiede tecnicamente impegnativi approcci elettrofisiologici, come accoppiati registrazioni della intero-cellula che possono identificare se una determinata connessione dispone di più siti di rilascio funzionale e minimale approcci di stimolazione che mirano a reclutare un singolo assone putativo.
In questo protocollo, descriviamo un metodo semplice per stimare la molteplicità sinaptica adottando un metodo sviluppato originariamente da Hsia et al2. Questa tecnica prevede la misura di spontanea PSC (sPSCs) e mPSCs usando cellule intere patch clamp ed elettrofisiologia, che ci permette di stimare il grado di molteplicità sinaptica attraverso tutti gli ingressi ad un dato neurone.  Come definito in precedenza, sinaptica molteplicità riflette il numero di sinapsi tra un dato neurone pre- e postsinaptico. Se più sinapsi sono reclutate in sincronia di un potenziale di azione, ci sarà un'alta probabilità di temporale sommatoria di singoli sportelli unici (cioè quantali), generando una maggior ampiezza PSC.  Nelle registrazioni mPSC (in cui i potenziali di azione sono bloccati da TTX), la probabilità di temporale sommatoria di singoli mPSCs (asincrono) è bassa. Utilizzando questa logica, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l'ampiezza sPSC (con rilascio di potenziale di azione-dipendente) per l'ampiezza di mPSC.
Per esaminare l'esistenza di molteplicità Descriviamo quattro esperimenti e loro analisi utilizzando glutamatergic EPSC come esempio. Tuttavia, lo stesso approccio può essere utilizzato per la veloce trasmissione GABAergica/glycinergic (IPSCs). Una breve spiegazione razionale per ogni esperimento è descritto di seguito. In primo luogo, come spiegato sopra, molteplicità sinaptica può essere stimata confrontando l'ampiezza del sEPSC a mIPSCs. Ci sono due requisiti per questo approccio; 1) presinaptici assoni devono sparare un numero sufficiente di potenziali d'azione durante la registrazione, e 2) Pr deve essere alta in modo che le sinapsi più rilasciare neurotrasmettitore dopo l'arrivo del potenziale d'azione. Per soddisfare questi requisiti, sEPSC sono per la prima volta in basso Ca2 + artificiale del liquido cerebrospinale (aCSF) e poi registrato in presenza di una bassa concentrazione dell'antagonista canale K+ , 4-aminopiridina (4-AP) per aumentare l'azione infornamento potenziale e Pr. Quindi di infornamento del potenziale di azione è bloccato da TTX e Pr sono diminuite di una tensione-gated Ca2 + antagonista Cd2 +. L'ampiezza del sEPSC (con 4AP) è paragonato a quello di mEPSC (con 4AP, TTX e Cd2 +). Nel secondo esperimento, Ca2 + è sostituito da equimolare Sr2 + in aCSF a desincronizzarsi rilascio vescicola. Come Ca2 + è necessario per il rilascio sincrono delle vescicole, sostituzione con Sr2 + dovrebbe eliminare il sEPSC di grande ampiezza che sono indicativi di molteplicità. In terzo luogo, meccanicistico, molteplicità può derivare da entrambi più contatti sinaptici alla stesso neurone postsinaptico o multivesicular rilascio (cioè più vescicole rilasciate all'interno di un singolo contatto sinaptico)17,18. Per differenziare tra i due tipi di molteplicità, il terzo esperimento utilizza una bassa affinità, veloce dissociazione antagonista competitivo dei recettori AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 per determinare se grande sEPSC sono il risultato della somma temporale di sinapsi indipendente o multivesicular rilascio che agisce su una popolazione di sovrapposizione dei recettori postsinaptici. Se gli eventi di grande ampiezza derivano dalla release multivesicular, γ-DGG sarà meno efficace ad inibire più grande sEPSC rispetto ai più piccoli, mentre grandi sEPSC che derivano dalla sommatoria temporale dei contatti sinaptici multipli allo stesso modo saranno interessati da Γ-DGG. Nel quarto esperimento, un metodo più fisiologico viene utilizzato per migliorare il potenziale di azione sparando, vale a dire afferente stimolazione sinaptica. Scoppi di attività sinaptica possono transitoriamente aumento/facilitare la probabilità di infornamento e rilascio di potenziale di azione spontanea delle afferenze stimolata. Questo approccio permette quindi di molteplicità di manifestare in maniera più fisiologica.
Il seguente protocollo descrive il metodo per lo svolgimento di questi esperimenti nel tessuto ipotalamico del mouse. In particolare, corticotropina liberantesi ormone (CRH) neuroni del nucleo paraventricolare dell'ipotalamo (PVN) sono utilizzati. Descriviamo le procedure per lo svolgimento di elettrofisiologia di cellule intere patch clamp e spiegare gli esperimenti specifici per testare per molteplicità sinaptica.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 lame</td><td>Fisher Scientific/altri</td><td>35698</td><td></td></tr><tr><td>22 lame</td><td>VWR/altri</td><td>21909-626</td><td></td></tr><tr><td>22 &mu; Filtri per siringhe M</td><td>Milipore</td><td>09-719-000</td><td></td></tr><tr><td>Adson foreceps</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8547</td><td></td></tr><tr><td>Forbici affilate angolate</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8437</td><td></td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices</td><td>pClamp 10</td><td></td></tr><tr><td>Lama a doppio taglio</td><td>VWR</td><td>74-0002</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Sigma/altri</td><td>1001090</td><td></td></tr><tr><td>Pennello fine</td><td>Fisher / vari</td><td>15-183-35 / vari</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di dispersione di gas</td><td>VWR</td><td>LG-8680-120</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi / altri</td><td>M60303</td><td></td></tr><tr><td>Krazy colla</td><td>vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>vari Mini analisi</td><td>Synaptosoft</td><td>MiniAnalysis 6</td><td></td></tr><tr><td>Osmomoter</td><td>Wescor Inc</td><td>Modello 5600</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>ph meter</td><td>Mettler Toledo</td><td>FE20-ATC</td><td></td></tr><tr><td>Bulbo in gomma</td><td>VWR</td><td>82024-550</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi n. 3</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8350</td><td></td></tr><tr><td>Manico per bisturi n. 4</td><td>Harvard Instruments</td><td>72-8356</td><td></td></tr><tr><td>Lama a filo singolo</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Affettatrice a vibratomo</td><td>Sistema</td><td></td> di purificazione dell'acqua Leica VT1200S <td></td></tr><tr><td></td><td>Millipore</td><td>Milli-Q Academic A10</td><td></td></tr><tr><td>Coperchio della piastra a pozzetti</td><td>Fisher/vari</td><td>07-201-590/various</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals/reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-AP</td><td>Sigma</td><td>275875</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>sonde molecolari</td><td>B1204</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*2H2O</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CdCl2</td><td>sigma</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>DNQX</td><td>Tocris</td><td>189</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>K2-ATP</td><td>Sigma</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare acqua</td><td>Sigma</td><td>W4502-1L</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Na-gluconato</td><td>Sigma</td><td>S2054</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>71504</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Picrotossina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>SrCl</td><td>Sigma</td><td>255521</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>Bioshop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Alamone Labs</td><td>T-550</td><td></td></tr><tr><td>yDGG</td><td>Tocris</td><td>6729-55-1</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch-clamp elettrofisiologia

Evaluation of Synaptic Multiplicity Using Whole-cell Patch-clamp Electrophysiology

Nel sistema nervoso centrale, un paio di neuroni formano spesso più contatti sinaptici e/o siti di rilascio di neurotrasmettitore funzionale (molteplicità sinaptica). Molteplicità di sinaptica è di plastica e cambiamenti nel corso dello sviluppo e in differenti condizioni fisiologiche, essendo un fattore determinante per l'efficacia della trasmissione sinaptica. Qui, descriviamo gli esperimenti per stimare il grado di molteplicità di sinapsi che chiude su un dato neurone postsinaptico usando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto. In particolare, registrazione di tensione-morsetto viene utilizzato per confrontare la differenza tra l'ampiezza delle correnti postsinaptiche eccitatori spontanee (sEPSC) e in miniatura eccitatori postsinaptici correnti (mIPSCs). La teoria dietro questo metodo è che input afferente che esibiscono molteplicità mostrerà sEPSC grande, potenziale d'azione-dipendente a causa del rilascio sincrono che si verifica a ogni contatto sinaptico. Al contrario, rilascio potenziale di azione indipendente (che è asincrona) genererà più piccola ampiezza mIPSCs. Questo articolo definisce una serie di esperimenti e analisi per caratterizzare l'esistenza di molteplicità sinaptica e vengono illustrati i requisiti e le limitazioni della tecnica. Questa tecnica può essere applicata per studiare come i diversi interventi comportamentali, farmacologici o ambientali in vivo influenzano l'organizzazione dei contatti sinaptici in aree differenti del cervello.

Il protocollo di cui sopra descrive un metodo per l'utilizzo di elettrofisiologia morsetto della intero-cellula patch per esaminare il grado di molteplicità sinaptica, usando neuroni ipotalamici del mouse come un esempio. Questa tecnica di preparazione di fetta dovrebbe produrre sane cellule vitali che non hanno una membrana gonfie o nucleo (Figura 1). Ogni passaggio nel protocollo è importante per la salute del tessuto e la qualità delle registrazioni.
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Qui, presentiamo un protocollo per la valutazione funzionale molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere patch ed elettrofisiologia di morsetto in fettine di cervello acuto.

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

In the central nervous system, a pair of neurons often form&#160;multiple synaptic contacts and/or functional neurotransmitter release sites (synaptic ...

Nel cervello, una coppia di neuroni spesso forma molteplici contatti sinaptici, che è chiamata molteplicità sinaptica. Tuttavia, un esame preciso della molteplicità sinaptica richiede esperimenti tecnicamente impegnativi. Questo protocollo descrive un metodo semplice per la stima lorda della molteplicità sinaptica usando l'elettrofisiologia patch-clamp a celle intere.Questo metodo può essere applicato a qualsiasi specie e area cerebrale per indagare la molteplicità sinaptica. Questo metodo richiede abilità di base nell'elettrofisiologia patch-clamp a cellule intere. Ottenere registrazioni di alta qualità con bassa e stabile resistenza agli accessi è fondamentale per un'interpretazione accurata dei dati.Per ottenere la configurazione a cella intera, posizionare la pipetta di registrazione appena sopra la corrente della pipetta di sezione e offset in modalità morsetto di tensione. Applicare una leggera pressione positiva sulla pipetta e bloccare il fermaviere. Quindi, selezionare una cellula sana con una membrana intatta e avvicinarsi al tessuto con la pipetta.La pressione positiva dovrebbe causare un leggero disturbo sul tessuto. Avvicinare lentamente la pipetta alla cella con un movimento diagonale fino a formare una piccola fossetta sulla superficie della cella. Quindi, rilasciare il blocco di pressione positivo.La cellula inizierà a formare un sigillo e la resistenza aumenterà sopra un gigaohm. Nel morsetto di tensione, tenere la cella a meno 68 millivolt. Successivamente, allontanare leggermente la pipetta dalla cella in diagonale per rimuovere la pressione in eccesso.Compensare la capacità di pipetta veloce e lenta. Applicare una breve aspirazione attraverso il tubo collegato al supporto della pipetta per sfondare la cella e ottenere una configurazione a cella intera. Quindi, passare alla modalità cellulare nella finestra di test della membrana in un software di acquisizione e analisi dei dati di elettrofisiologia.Mantenere la temperatura del bagno di registrazione a 27-30 gradi Celsius e la portata da 1,5 a due millilitri al minuto per gli esperimenti successivi. In una sinapsi molteplicista, un potenziale d'azione sincronizza il rilascio di neurotrasmettitori e genera una corrente postsinaptica più grande. Il potenziale di azione bloccante e il rilascio vescicolare dipendente dal calcio con TTX e cadmio prevengono la sommatoria della corrente postsinaptica e diminuiscono l'ampiezza.Quando non c'è molteplicità, il potenziale di azione di blocco non cambierà l'ampiezza. Nell'esperimento uno, per stimare la molteplicità, tenere la cellula a meno 68 millivolt mentre la perfonde con aCSF a basso calcio. Registrare gli EPSC spontanei per almeno cinque minuti per garantire una linea di base stabile.Successivamente, aggiungere 30 micromolari 4-AP all'aCSF per aumentare gli eventi di azione potenziali dipendenti e registrare EPSC spontanei per almeno 10 minuti per ottenere l'effetto farmacologico completo. Quindi, aggiungere 0,5 micromolari TTX e 10 micromolari cadmio all'aCSF con 4-AP e registrare gli EPSC in miniatura per almeno 10 minuti. Per l'analisi offline, utilizzare l'ultimo minuto di linea di base immediatamente prima dell'applicazione di 4-AP, il 10 ° minuto dell'applicazione 4-AP e il 10 ° minuto dell'applicazione TTX.In questo esperimento, il calcio extracellulare viene sostituito con stronzio per de sincronizzare il rilascio di vescicole sinaptiche. Pertanto, se la molteplicità è presente, questo dovrebbe diminuire l'ampiezza delle correnti postsinaptiche. Nell'esperimento due, registrare EPSC spontanei per almeno cinque minuti mentre si perfonde la cellula con il normale aCSF di calcio.Per sincronizzare il rilascio di vescicola, iniziare a perfondere la cellula con aCSF stronzio e registrare EPSC spontanei. Per l'analisi offline, per determinare se gli EPSC spontanei di grande ampiezza sono dovuti al rilascio sincrono di vescicole, confrontare l'ultimo minuto della linea di base con il 10 ° minuto dell'applicazione aCSF stronzio. La molteplicità può comportare il rilascio multivesicolare, che causa una maggiore concentrazione di neurotrasmettitori nella fessura sinaptica.L'aggiunta di gamma-DGG, un antagonista del recettore AMPA a bassa affinità, porta ad un'inibizione meno efficace di più grandi correnti postnaptiche uniquantali. Senza rilascio multivesicolare, gamma-DGG sarà ugualmente efficace su correnti postsinaptiche sempre più grandi. Nell'esperimento tre, per testare il rilascio multivesicolare, registrare EPSC spontanei in aCSF a basso calcio per almeno cinque minuti.Aggiungere 30 micromolari 4-AP all'aCSF attraverso il sistema di perfusione. Registrare gli EPSC spontanei per almeno 10 minuti. Quindi, aggiungere 200 micromolari gamma-DGG all'aCSF con 4-AP e registrare gli EPSC spontanei per almeno 10 minuti.Come esperimento di controllo in una cella separata, ripetere le procedure, ma applicare una bassa concentrazione di DNQX anziché gamma-DGG. Per l'analisi offline, analizza l'ultimo minuto di ogni applicazione farmacologica. Raffiche di attività sinaptica possono aumentare transitoriamente il potenziale di azione spontanea sparando e rilasciando la probabilità degli afferenti stimolati.Se i neuroni mostrano molteplicità, l'aumento dei potenziali d'azione dovrebbe causare un aumento transitorio dell'ampiezza delle correnti postsinaptiche. Nell'esperimento quattro, registrare EPSC spontanei nel calcio normale aCSF. Per aumentare il potenziale d'azione, stimolare gli afferenti utilizzando un elettrodo di vetro monopolare riempito con aCSF ad una velocità di 20 hertz per due secondi e ripetere 10 volte con un intervallo inter-burst di 20 secondi.Per l'analisi, utilizzare EPSC spontanei di 5.000 millisecondi prima del primo stimolo come linea di base e confrontarli con gli EPSC spontanei da 10 a 300 millisecondi dopo lo stimolo finale. Quindi, prendi l'ampiezza media e il cambio di frequenza in 10 prove. Analizza EPSC spontanei ed EPSC in miniatura utilizzando un programma che rileva e analizza le correnti sinaptiche.Utilizzare i parametri di rilevamento suggeriti e la funzione di analisi non-stop per rilevare gli EPSC mediati dal recettore AMPA. Scansiona manualmente ogni registrazione per assicurarti che il programma rilevi con precisione ogni evento. Esportare i dati dell'evento copiarli negli Appunti e incollarli in un software di gestione dei dati.Successivamente, calcolare la frequenza media e l'ampiezza per ogni trattamento farmacologico ed eseguire le analisi statistiche pertinenti. In un esempio mostrato qui, 4-AP aumenta sia l'ampiezza che la frequenza degli EPSC spontanei. La successiva applicazione del TTX e del cadmio diminuisce sia l'ampiezza che la frequenza.Ecco la distribuzione dell'ampiezza EPSC spontanea dalla registrazione. Nei neuroni ipotalamici qui esaminati, l'ampiezza e la frequenza delle condizioni di base e TTX sono le stesse, suggerendo che gli EPSC spontanei di base contengono pochissimi EPSC potenziali-dipendenti dall'azione. Di conseguenza, gli esperimenti successivi possono confrontare la differenza tra basale e 4-AP per misurare la molteplicità.La forza della trasmissione sinaptica può essere aumentata transitoriamente da raffiche di attività sinaptica. Per studiare la molteplicità in condizioni più fisiologiche, la stimolazionefferente può essere utilizzata per aumentare la probabilità di attivazione e rilascio potenziale di azione. Ecco i riassunti dei cambiamenti spontanei di frequenza e ampiezza dell'EPSC a seguito della stimolazione sinaptica.Registrazioni stabili sono essenziali per un'interpretazione accurata dei dati. Descrivere i dati se la resistenza all'accesso cambia di oltre il 20% durante la registrazione, in quanto ciò potrebbe confondere l'analisi. Questo protocollo offre un modo semplice per stimare la molteplicità sinaptica, che è un fattore determinante dell'efficacia sinaptica e della sua plasticità in diverse condizioni fisiologiche e fisiopatiche.

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Neuroscienze

Questo protocollo descrive una tecnica chiamata elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera, che è un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni di Mauthner e di altre cellule reticolospinali negli embrioni di zebrafish.

Elettrofisiologia del Patch Clamp a cellula intera: un metodo per studiare le proprietà elettriche dei neuroni

Questo video mostra la tecnica del patch clamp a cellula intera in una fetta di cervello di topo. Questa tecnica stabilisce una connessione stabile tra la micropipetta e la membrana del neurone, che viene ulteriormente interrotta per stabilire una configurazione dell'intera cellula per studiare la salute del neurone e le risposte fisiologiche.

Definizione di una configurazione a cella intera tramite il metodo Patch Clamp

Il video dimostra un metodo per studiare l'eccitabilità delle cellule neuronali che esprimono una proteina fluorescente utilizzando un morsetto di corrente patch a cellula intera. Nella modalità current-clamp, vengono generati potenziali d'azione indicativi di eccitabilità neuronale.

Studio dell'eccitabilità dei neuroni fluorescenti utilizzando un patch clamp a cellula intera

Questo video mostra il posizionamento di una pipetta a punta fine vicino a fette di cervello, formando un sigillo con una cellula neuronale. L'aspirazione rompe la membrana cellulare, creando così un patch clamp a cellula intera che consente misurazioni di corrente per esperimenti di elettrofisiologia.

Stabilire una configurazione di voltage-clamp a cellula intera per registrazioni elettrofisiologiche in fette di cervello

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

Le registrazioni di coppia sono registrazioni simultanee di patch clamp di intere cellule da due neuroni collegati sinapticamente, che consentono una precisa caratterizzazione elettrofisiologica e farmacologica delle sinapsi tra i singoli neuroni. Qui descriviamo la metodologia dettagliata e i requisiti per stabilire questa tecnica in colture organotipiche di fette di ippocampo in qualsiasi laboratorio attrezzato per l'elettrofisiologia.

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

Impara a valutare la molteplicità sinaptica nei neuroni utilizzando l'elettrofisiologia patch-clamp su fette cerebrali acute. Questo metodo permette di stimare i contatti sinaptici multipli in diverse specie e aree cerebrali.

Valutazione di molteplicità sinaptica utilizzando cellule intere Patch-clamp Elettrofisiologia

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