Name: VirWaTest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni dacqua (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Scopri VirWaTest, un metodo point-of-use per rilevare virus enterici in campioni d'acqua. Questa tecnica portatile e conveniente migliora la sicurezza idrica nei contesti umanitari e la salute pubblica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VirWaTest è stato un progetto di ricerca finanziato dal programma HIF (Humanitarian Innovation Funds) di ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Gli autori riconoscono i team WASH che hanno collaborato gentilmente a questo studio. L'analisi dei campioni in Ecuador è stata finanziata da Oxfam Ecuador e Direcciàn de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas è un borsista Serra-Hunter presso l'Università di Barcellona.

1. Preparazione e confezionamento
NOTA: i materiali/attrezzature da imballare sono elencati nella tabella 1. Utilizzare i guanti per gestire i reagenti necessari per il controllo del processo, i reagenti di concentrazione, i reagenti di estrazione dell'acido nucleico e i reagenti di rilevamento. Indossare occhiali protettivi per maneggiare i reagenti necessari per l'estrazione dell'acido nucleico.
<ol><li>Controllo del processo
	<ol>
<li>Preparare la cultura dello stock MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contenente 1 x 1010 PFU/mL in laboratorio seguendo la procedura ISO 10705-1:199514.</li>
		<li>Quindi, 10 l'aliquota della sospensione per tubo contenente 1 x 108 PFU in tubi da 10 mL e lasciare che l'acqua evapora a 37 gradi centigradi. Utilizzare un tubo per ogni campione d'acqua.</li>
		<li>Inoltre, preparare un tubo contenente 10 mL di acqua distillata sterile per ogni campione raccolto.</li>
	</ol></li>
	<li>Reagenti di concentrazione
	<ol>
<li>Per la soluzione di latte scremato prefloccato (PSM), utilizzare i seguenti importi per concentrare cinque campioni di acqua da 10 L.<ol>
<li>Preparare un tubo di plastica contenente 5 g di latte scremato.</li>
			<li>Preparare un sacchetto di plastica con cerniera contenente 16,66 g di sali marini.</li>
			<li>Preparare una bottiglia di plastica contenente 500 mL di acqua distillata.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare i reagenti necessari per la regolazione del pH. Utilizzare i seguenti importi per regolare il pH del PSM e di cinque campioni di acqua da 10 L.<ol>
<li>Aggiungere 5 g di acido citrico 1-idrato in un tubo di plastica da 10 ml. APRudenza: L'acido citrico causa gravi irritazioni quando entra in contatto con gli occhi. In questo caso, sciacquare l'occhio con cautela con acqua per alcuni minuti. Se l'irritazione persiste, consultare un medico.</li>
			<li>Mettere 2 g di idrossido di sodio in un tubo di plastica da 10 ml. AVVISO: l'idrossido di sodio può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Se ingerito, sciacquare la bocca. Non indurre il vomito. Se viene a contatto con gli occhi, risciacquare con cautela con acqua per diversi minuti. Quindi, consultare un medico.</li>
			<li>Mettere 25 mL di acqua distillata sterile in un contenitore di plastica.</li>
			<li>Mettere 50 mL di acqua distillata sterile in un contenitore di plastica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparare la sacca di condizionamento del campione utilizzata per la flocculazione, la soluzione di conservazione utilizzata per conservare gli acidi nucleici e la sacca neutralizzante per neutralizzare l'acqua e i materiali scartati. Utilizzare le seguenti quantità per ogni campione d'acqua da 10 L da testare.<ol>
<li>Mettere 15 g di sali di mare e 8 g di acido citrico 1-idratare in un sacchetto di plastica cerniera per la borsa di condizionamento.</li>
			<li>Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (Tabella dei materiali) e 0,3 mL di acido nucleico conservando l'agente ( Tabella deimateriali) a un tubo da 5 mL. AVVISO: il buffer di lisi contiene il fiideo di guanidina e il Triton X-100. Il contatto con l'acido libera gas tossici, ed è dannoso se ingerito, inalato, o entra in contatto con la pelle. Se ingerito, sciacquare la bocca. Non indurre il vomito. Se viene a contatto con la pelle, lavare con molta acqua. Quindi, consultare un medico. L'agente conservante dell'acido nucleico causa irritazione della pelle e degli occhi ed è dannoso se ingerito. Se viene a contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua per diversi minuti. In ogni caso, soprattutto se ingerito e sentirsi male, consultare un medico.</li>
			<li>Mettere 40 g di polvere detergente in quattro sacchetti di plastica con cerniera. AMMONIenza: Il detersivo in polvere causa irritazione agli occhi. Se viene a contatto con gli occhi, risciacquare con abbondante acqua per diversi minuti. Se l'irritazione persiste o se ingerita, consultare un medico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Reagenti di estrazione dell'acido nucleico
	<ol>
<li>Mettete 50 -L di particelle magnetiche (Tabella dei Materiali) e 1 mL di etanolo 96% in un tubo da 5 mL che costituiscono il buffer di legame. AVVISO: Il buffer di particelle magnetiche contiene azide di sodio, che forma un gas tossico quando entra in contatto con acidi o ioni metallici pesanti ed è tossico se ingerito o quando viene a contatto con la pelle. Se ingerito o a contatto con la pelle, sciacquare la bocca o la pelle con abbondante acqua e consultare un medico. L'etanolo è un liquido e vapore altamente infiammabile e provoca gravi irritazioni agli occhi. Tenere lontano da calore, superfici calde, scintille, e qualsiasi altra fonte di accensione. Se viene a contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua. In caso di ingestione di grandi quantità di acqua e/o se inalato, uscire all'aria aperta. In ogni caso, consultare un medico.</li>
		<li>Aggiungete rispettivamente 500 l, 600 l e 200 l di detersivi 1, 2 e 3 (Tabella dei materiali), a tre tubi da 2 mL. AVVISO: i tamponi di lavaggio contengono il tiocianato di guanidinium e il cloruro di guanidio, che sono dannosi se inalati o ingeriti e irritano la pelle e gli occhi. Il contatto con gli acidi rilascia gas molto tossico. Se entrano in contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua. Se ingerito, sciacquare la bocca con abbondante acqua. Non indurre il vomito. Consultare sempre un medico.</li>
		<li>Aggiungere 120 l di tampone di eluizione (Tabella dei materiali) a un tubo da 0,5 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Reagenti di rilevamento HAdV e MS2 NOTA: Due diverse reazioni di estrazione dell'acido nucleico possono essere analizzate simultaneamente in ogni test PCR se viene utilizzato un termociclo a 8 bengeti. Per tutti i saggi PCR, preparare l'acqua di biologia molecolare aliquota in tubi da 1,5 mL.<ol>
<li>
Rilevamento HAdV
		<ol>
<li>Preparare una miscela contenente 10 -L di 22,5 M di primer in avanti AdF, 10 -L di 22,5 M AdRinversi e 5 -L di 11,25 M sonda AdP (tabella 2).</li>
			<li>Aggiungere 2,5 l'l del mix ai tubi da 1 a 8 di una striscia di tubi. Lasciare asciugare a temperatura ambiente, chiudere i tubi e tenerli protetti dalla luce.</li>
			<li>Tagliare la striscia dividendola in due strisce: tubi 1-5 e tubi 6-8.</li>
			<li>Preparare una diluizione seriale delle sospensioni del DNA contenente la sequenza nucleotida della regione HAdV amplificata. L'aria secco 1 L- di sospensioni contenenti 1 x 105, 1 x 107e 1 x 109 GC/mL in tubi 6-8. NOTA: Tenere i tubi contenenti i primer, la sonda e le sospensioni essiccate all'aria protette dalla luce.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Rilevamento MS2
		<ol>
<li>Preparare una miscela contenente 10 -L di 25 s.l. per il pezzetto-2F, 10-L di 25 pecson-2R inversi e 2,5 litri di 25 M PecP-2 (tabella 2).</li>
			<li>Aggiungere 2,25 l del mix ai tubi da 1 a 8 di una striscia di tubi. Lasciare asciugare a temperatura ambiente, chiudere i tubi e tenerli protetti dalla luce.</li>
			<li>Tagliare la striscia dividendola in due strisce: tubi 1-5 e tubi 6-8.</li>
			<li>Procedere come nel passaggio 1.4.1.4, ma utilizzare una sospensione standard progettata per MS2.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Concentrazione virale
NOTA: utilizzare i guanti in qualsiasi momento durante le procedure di raccolta dei campioni, preparazione del reagente, flocculazione, raccolta di floc e smaltimento dei rifiuti. Indossare occhiali protettivi durante la procedura di preparazione del reagente.
<ol><li>Raccolta di campioni
	<ol>
<li>Raccogliere un campione d'acqua da 10 L in un secchio piatto con coperchio. Raccogliere un minimo di due repliche per ogni campione. NOTA: È importante utilizzare secchi chiari per visualizzare il pellet. Se il campione d'acqua contiene materiale sospeso (ad esempio, sabbia, alghe), lasciarlo sedimentare e, quindi, raccogliere il supernatante d'acqua in un nuovo secchio.</li>
		<li>Registrare il volume raccolto, nonché la posizione e la data di ritiro, per ogni campione d'acqua.</li>
		<li>Mettere un agitatore magnetico collegato a una batteria sotto un supporto secchio e posizionare il secchio contenente il campione d'acqua sul suo supporto. NOTA: Cercare una superficie piana in un luogo fresco e mantenere i secchi contenenti i campioni d'acqua dalla luce solare diretta.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei reagenti
	<ol>
<li>
Reagenti di regolazione pH
		<ol>
<li>Versare la polvere acida citrica e i pellet di idrossido di sodio nelle pentole contenenti rispettivamente 25 e 50 mL di acqua distillata.</li>
			<li>Agitare delicatamente a mano fino a quando l'acido citrico e l'idrossido di sodio sono completamente disciolti. AVVISO: Non versare l'acqua sui pellet di idrossido di sodio. Versare invece i pellet di idrossido di sodio sull'acqua.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Latte scremato prefloccolto
		<ol>
<li>Mettere un sacchetto in piedi su un agitatore magnetico e versarci 500 mL di acqua distillata. Far cadere un magnete di agitazione all'interno del sacchetto e accendere l'agitatore magnetico.</li>
			<li>Versare il contenuto di una folatà di sale marino e di un tubo di latte scremato nel sacchetto di stand-up e mescolare per 5 min a media velocità per scioglierli.</li>
			<li>Aggiungere 3 mL di acido citrico alla soluzione PSM utilizzando una pipetta Pasteur per assicurarsi che il pH sia compreso tra 3,4 e 3,6. Misurare il pH della soluzione PSM utilizzando strisce di indicatore pH. Aggiungere piccole quantità di acido citrico e idrossido di sodio man mano che il pH si avvicina a 3,5.</li>
			<li>Spegnere l'agitatore magnetico e assicurarsi che i floc siano visibili. Utilizzare una torcia elettrica per aiutare a visualizzare i floc.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Flocculazione
	<ol>
<li>Far cadere un magnete di agitazione in acqua, impostare l'agitatore magnetico alla massima velocità e accenderlo. Assicurarsi che il magnete agitando inizi a girare.</li>
		<li>Aggiungere 10 mL di acqua distillata a un tubo di controllo di processo. Invertire il tubo un paio di volte per reidratare il brodo virale e versare la soluzione in acqua.</li>
		<li>Versare il contenuto di una sacca di condizionamento campione in acqua e mescolare per 5 min.</li>
		<li>Misurare il pH del campione d'acqua utilizzando strisce indicatore pH. Aggiungere alcune gocce di acido citrico o idrossido di sodio al campione d'acqua per assicurarsi che il pH si trovi tra 3,4 e 3,6. Aggiungere piccole quantità di acido citrico e idrossido di sodio man mano che il pH si avvicina a 3,5.</li>
		<li>Aggiungere 100 mL della soluzione PSM utilizzando un contenitore da 100 mL.</li>
		<li>Sigillare il secchio con il coperchio, impostare l'agitatore magnetico alla velocità minima e lasciare che l'acqua si agiti per 8 h.</li>
		<li>Spegnere l'agitatore magnetico e lasciare che l'acqua sia ferma per almeno 5 h per consentire ai floc di depositarsi.</li>
	</ol></li>
	<li>Collezione Floc
	<ol>
<li>Costruire un sistema di sifone composto da un controller pipetta, due pipette e un tubo di plastica, per aspirare il sovrettinte ad acqua per scaricare l'acqua sui floc.<ol>
<li>Attaccare una pipetta a nastro da 10 mL al controller della pipetta. Quindi, attaccare la punta della pipetta al tubo di plastica.</li>
			<li>Rimuovere il filtro di una pipetta a punta aperta da 10 mL utilizzando una pinzetta e attaccare la pipetta al tubo di plastica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Posizionare un secchio vuoto sul pavimento.</li>
		<li>Immergere la punta della pipetta a punta aperta nell'acqua. Assicurarsi di tenerlo vicino alla superficie dell'acqua per evitare di disturbare i floc. Aspirare il supernatante d'acqua fino a raggiungere la pipetta a nastro.</li>
		<li>Avvicinare il tubo di plastica all'estremità attaccata alla pipetta adesiva e staccarlo dalla pipetta.</li>
		<li>Collocare il tubo in un secchio vuoto. Rilasciare la pressione sul tubo per far scorrere l'acqua nel secchio vuoto.</li>
		<li>Pizzicare il tubo di plastica per fermare il flusso d'acqua quando il livello dell'acqua sta per raggiungere il magnete di agitazione e spostare la pipetta lontano dal secchio.</li>
		<li>Agitare il secchio per risospendere i floc e versarli in un sacchetto di plastica stand-up da 500 mL. Lasciare che i floc si accontentino di 1 h di più.</li>
		<li>Aspirare con attenzione il supernatante ad acqua usando una pipetta da 50 mL e un controller manuale pipetta, evitando di disturbare i floc.</li>
		<li>Aspirare i floc usando una pipetta da 100 mL e trasferirli in un tubo di centrifuga turalario da 50 mL. Annotare il volume finale del concentrato del campione e trasferirne 1 mL in un tubo da 5 mL contenente la soluzione conservante, utilizzando una pipetta Pasteur. NOTA: È importante che il tubo di centrifuga sia graduato in modo che il volume finale del campione concentrato possa essere misurato nel modo più accurato possibile e registrato.</li>
		<li>Eseguire l'estrazione dell'acido nucleico sul campo. In alternativa, conservare la soluzione conservante contenente i virus a 20-30 gradi centigradi per un massimo di 15 giorni o spedirli in un laboratorio di riferimento per ulteriori analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Smaltimento dei rifiuti e riutilizzo dei materiali
	<ol>
<li>Aggiungere il contenuto di una sacca agente neutralizzante al secchio contenente l'acqua scartata. Mescolare l'acqua, e poi, lasciare fermo per 30 min.</li>
		<li>Smaltire l'acqua trattata come rifiuti generali.</li>
		<li>Posizionare le pipette e il tubo di plastica all'interno del secchio. Riempire il secchio con acqua e versare il contenuto di una sacca agente neutralizzante.</li>
		<li>Lavarli per almeno 30 minuti per sterilizzarli e sciacquarli con abbondante acqua pulita per rimuovere qualsiasi agente neutralizzante rimanente.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Estrazione di acido nucleico
NOTA: Utilizzare guanti e indossare sempre occhiali protettivi durante la procedura di estrazione dell'acido nucleico.
<ol><li>
Funzionamento della pipetta magnetica
	<ol>
<li>Acquisire familiarità con il funzionamento della pipetta magnetica prima di eseguire l'estrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estrazione di acido nucleico
	<ol>
<li>Disporre i tubi contenenti i reagenti necessari per l'estrazione in un rack, da sinistra a destra: tampone di rilegatura, buffer di lavaggio e buffer di elusione. Impostare il numero appropriato di tubi in base al numero di campioni o repliche in corso di analisi.</li>
		<li>Trasferire 1 mL di concentrato di campione al tubo contenente il tampone di rilegatura, utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta. Invertire il tubo da 8x a 10x per omogeneizzare la soluzione.</li>
		<li>Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min mescolando continuamente, utilizzando un orbitale a energia solare o manualmente.</li>
		<li>Raccogliere le particelle magnetiche utilizzando la pipetta magnetica e una punta pulita, che può essere riutilizzata per i tre buffer di lavaggio.</li>
		<li>Rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente 500 L di lavaggio buffer 1. Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.</li>
		<li>Trasferire le particelle magnetiche al tubo contenente 600 - L di lavaggio buffer 2. Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.</li>
		<li>Trasferire le particelle magnetiche al tubo contenente 200 . Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.</li>
		<li>Rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente il tampone di eluizione e scartare la punta.</li>
		<li>Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min mescolando continuamente, utilizzando l'orbitale a energia solare. NOTA: La miscelazione delle particelle magnetiche nel tampone di eluizione è un passo cruciale. In caso di mancanza di un orbitale, mescolare continuamente a mano durante il tempo di incubazione.</li>
		<li>Sostituire la punta sulla pipetta magnetica con una nuova e raccogliere le particelle magnetiche dal buffer di eluizione. Assicurarsi di rimuovere completamente le particelle magnetiche dal buffer di eluizione poiché possono interferire con i metodi di rilevamento molecolare.</li>
		<li>Scartare la punta con le particelle ad essa attaccate. Procedere con l'analisi PCR, spedire il tampone di eluizione in un laboratorio di riferimento o conservare il tampone di eluizione a 4 gradi centigradi per un'ulteriore analisi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Rilevamento virale con termociclo in tempo reale a otto tubi a batteria
NOTA: Utilizzare guanti e indossare sempre occhiali protettivi durante la procedura di rilevamento dell'acido nucleico. Sostituire i guanti per quelli nuovi quando si esegue un nuovo esperimento PCR per evitare la contaminazione incrociata.
<ol><li>
HAdV quantitativo PCR
	<ol>
<li>Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenono ai tubi 2, 4 e 5.</li>
		<li>Aggiungere 4 -L di miscela PCR ai tubi 1-5.</li>
		<li>Aggiungere 14 - L di estrazione dell'acido nucleico dal campione A al tubo 1 e 14 l dal campione B al tubo 3.</li>
		<li>Aggiungere 2 -L di acidi nucleici estratti dal campione A al tubo 2 e 2 -L dal campione B al tubo 4. Chiudere la striscia di cinque tubi.</li>
		<li>Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenonità ai tubi 6, 7 e 8.</li>
		<li>Aggiungete 4 gradi di questo mix ai tubi 6, 7 e 8 e chiudeteli.</li>
		<li>Inserire entrambe le strisce nel termociclore e selezionare la conduttura appropriata (Tabella 3).</li>
		<li>Scartare il tubo dell'acqua e mantenere l'acido nucleico estratto nel congelatore, se possibile, o, in caso contrario, in un luogo fresco protetto dalla luce nel caso in cui sia necessario eseguire una seconda prova.</li>
		<li>Pulire correttamente le micropipette, il rack, il materiale di lavoro e tutto il materiale con un detergente acido nucleico e scartare il sacchetto di plastica contenente la punta, i guanti e i tubi usati. AVVISO: L'assovia dell'acido nucleico è un liquido e vapore molto infiammabili. Non respirare la nebbia spray ed evitare qualsiasi contatto del liquido con gli occhi o la pelle. In caso contrario, risciacquare immediatamente con abbondante acqua e consultare un medico.</li>
		<li>Raccogliere i risultati e analizzare i dati ottenuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BCR quantitativo MS2
	<ol>
<li>Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenono ai tubi 2, 4 e 5.</li>
		<li>Aggiungete 4 -L di miscela PCR e 0,5 l di enzima di trascrizione inversa ai tubi 1-5.</li>
		<li>Aggiungere 14 - L di estrazione dell'acido nucleico dal campione A al tubo 1 e 14 l dal campione B al tubo 3.</li>
		<li>Aggiungere 1 l l di acidi nucleici estratti dal campione A al tubo 2 e 1 l dal campione B al tubo 4. Chiudere la striscia di cinque tubi.</li>
		<li>Aggiungete 15,5 l di acqua priva di nuclenonazione ai tubi 5, 6, 7 e 8 e chiudeteli.</li>
		<li>Aggiungete 4 o L di miscela PCR e 0,5 l di enzima di trascrizione inversa ai tubi 6, 7 e 8.</li>
		<li>Inserire entrambe le strisce nel termociclore e selezionare la conduttura appropriata (Tabella 3).</li>
		<li>Procedere come descritto nei passaggi da 4.1.8 a 4.1.10.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>The Sphere Project. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Sphere+Project%3A+Humanitarian+Charter+and+Minimum+Standards+in+Humanitarian+Response%22">The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response</a>. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).</li>
<li>Bartram, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBartram%2C+J+%22Water+Safety+Plan+Manual%3AStep-by-step+risk+management+for+drinking-water+suppliers%22">Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+Drinking-water+Quality%22">Guidelines for Drinking-water Quality</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%2225+Years+Progress+on+Sanitation+and+Drinking+Water%22">25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water</a>. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).</li>
<li>Girones, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+pathogens+in+water+-+The+pros+and+cons+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques.</a> Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).</li>
<li>Rodriguez-Manzano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+and+new+fecal+indicators+and+pathogens+in+sewage+treatment+plants%2C+microbiological+parameters+for+improving+the+control+of+reclaimed+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water.</a> Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).</li>
<li>Puig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+adenoviruses+and+enteroviruses+in+polluted+waters+by+nested+PCR+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).</li>
<li>Carter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterically+infecting+viruses%3A+Pathogenicity%2C+transmission+and+significance+for+food+and+waterborne+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection.</a> Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Documenting+the+epidemiologic+patterns+of+polyomaviruses+in+human+populations+by+studying+their+presence+in+urban+sewage%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+aspects+of+using+human+adenovirus+as+a+viral+water+quality+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Research%22%5BJournal%5D)">Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator.</a> Water Research. 96, 308-326 (2016).</li>
<li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).</li>
<li>International Organization for Standardization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+10705-1%3A1995%3A+Water+quality+-+Detection+and+enumeration+of+bacteriophages+-+Part+1%3A+Enumeration+of+F-specific+RNA+bacteriophages%22">ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages</a>. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).</li>
<li>Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+PCR+for+determining+the+infectivity+of+bacteriophage+MS2+upon+inactivation+by+heat%2C+UV-B+radiation%2C+and+singlet+oxygen%3A+Advantages+and+limitations+of+an+enzymatic+treatment+to+reduce+false-positive+results%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).</li>
<li>Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantitation+of+infectious+human+adenoviruses+and+JC+polyomaviruses+in+water+by+immunofluorescence+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay.</a> Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Bofill-Mas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+method+for+microbial+source+tracking+using+specific+human+and+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), e2820(2011).</li>
<li>Gonzales-Gustavson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+efficiency+and+uncertainty+of+skimmed+milk+flocculation+for+the+simultaneous+concentration+and+quantification+of+water-borne+viruses%2C+bacteria+and+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa.</a> Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo VirWaTest consente la concentrazione di virus e l'estrazione di acido nucleico da campioni d'acqua nel punto di utilizzo da parte di utenti non esperti. Si tratta di un protocollo conveniente, rapido e semplice. La concentrazione si basa sul principio della flocculazione organica con latte scremato, con il quale il pH basso e le condizioni di alta conduttività rendono le proteine del latte scremato aggregate in floc gli adsorbienti dei virus. Quando il sedimento di floc, è facile raccoglierli, rendendo possibil...

Durante le prime fasi di qualsiasi emergenza umanitaria, l'accesso alle forniture di acqua pulita, i servizi igienico-sanitari e l'igiene sono fondamentali per la sopravvivenza delle persone colpite. Pertanto, il monitoraggio della qualità dell'acqua è una priorità per prevenire i focolai di origine idrica. È risaputo che l'acqua contaminata è spesso l'origine di malattie, ma è spesso difficile determinare le fonti di focolai virali come il virus dell'epatite E (HEV), anche con la disponibilità di metodi di laboratorio convenzionali. Il controllo della qualità dell'acqua si basa sulla quantificazione di FIB1,2,3,4. Tuttavia, è stato ampiamente documentato che non vi è alcuna correlazione tra l'assenza di FIB e la presenza di patogeni virali trasmessi dall'acqua come rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV5,6. Pertanto, l'utilizzo dei criteri di qualità dell'acqua basati sulla FIB potrebbe comportare una sottovalutazione dei rischi associati alla presenza di patogeni virali trasportati dall'acqua. La sorveglianza dei virus indicatori, come gli adenovirus umani (HAdV), o di specifici patogeni sarebbe utile per definire l'esposizione a patogeni virali e identificare la potenziale fonte di infezione umana7,8, 9,10 e nella convalida dell'efficacia delle misure igienico-sanitarie11.
Fino ad ora, il rilevamento di virus in questi scenari si basava su personale qualificato e logistica complessa. VirWaTest (virwatest.org) è finalizzato allo sviluppo di un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e la successiva rilevazione di virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo.
La concentrazione di virus si basa sul principio di flocculazione organica di campioni di acqua 10 L, con cui i virus vengono recuperati in piccoli volumi12,13. I floc vengono raccolti e aggiunti a un buffer che liccia i virus e impedisce la degradazione degli acidi nucleici quando sono conservati a temperatura ambiente per non più di 2 settimane.
Il metodo di estrazione dell'acido nucleico si basa sull'uso di particelle magnetiche a cui gli acidi nucleici vengono adsorbiti. Possono essere trasferiti da un buffer di lavaggio all'altro e infine nel buffer di eluizione utilizzando una pipetta magnetica a cui le particelle si attaccano. Le sospensioni virali dell'acido nucleico ottenute possono essere spedite in un laboratorio di riferimento in cui il rilevamento può essere eseguito utilizzando metodi molecolari basati sulla PCR. Per ogni estrazione dell'acido nucleico, vengono testate due diverse quantità per escludere l'inibizione ezimatica originata dal campione. In alternativa, con una disponibilità minima delle apparecchiature, i test PCR possono essere eseguiti nel punto di utilizzo. L'intero processo è progettato per essere eseguito indipendentemente da un alimentatore (Figura 1).
Un saggio pcR quantitativo per rilevare l'HAdV, espulso dall'uomo e trovato in campioni di acque reflue in alte concentrazioni, è stato adattato per essere eseguito nel punto di utilizzo. HAdV sono utilizzati come indicatori virali fecali umani. Una PCR per la quantificazione del batteriofago MS2 è stata adattata anche poiché MS2 viene utilizzato in VirWaTest come controllo del processo. Il metodo può essere personalizzato per il rilevamento di qualsiasi virus di interesse.
Dopo lo sviluppo, il metodo VirWaTest è stato applicato dagli utenti in due diverse impostazioni nella Repubblica di Africa Centrale (RCA) e in Ecuador, fornendo feedback sull'applicazione del protocollo in situazioni reali.
Per quanto ne sappiamo, questa è la prima procedura che consente la concentrazione e il rilevamento di virus nel punto di utilizzo, indipendentemente da qualsiasi alimentazione, grandi apparecchiature e condizioni di congelamento/raffreddamento. Si raccomanda di raccogliere due repliche di ogni campione d'acqua al fine di ottenere risultati robusti.

<table><tbody><tr><td>5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX)</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-14-00001</td><td>Include la sonda HOT FIREPol di Solis Biodyne qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 strisce</td></tr><tr><td>di reazioni da 8 microprovette con tappi</td><td>dD Biolab</td><td>840637</td><td>basso profilo, pareti sottili, adattate per batterie PCR quantitative e qualitative</td></tr> e <tr><td>adattatori di alimentazione per agitatore magnetico</td><td>GenIUL</td><td>900011674</td><td>Include alimentazione per auto a 12 V adattatore</td></tr><tr><td>Supporto per secchio</td><td>GenIUL</td><td>900011648</td><td>Secchio di supporto in alluminio</td></tr><tr><td>, 10 L</td><td>Cater4You</td><td>10LTR</td><td>Polipropilene, a prova di manomissione, provetta da centrifuga di colore trasparente</td></tr><tr><td>, 50 mL</td><td>LabBox</td><td>CTSP-E50-050</td><td>Polipropilene, sterile, graduato, con gonna</td></tr><tr><td>Acido citrico 1-idrato, 500 g</td><td>PanReac AppliChem</td><td></td><td>1410181211 puro, grado farmaceutico, 1 chilogrammo</td></tr><tr><td>Flacone in PET trasparente</td><td>LabBox</td><td>FPET-500-088</td><td>Colore trasparente, PET, tappo non incluso</td></tr><tr><td>Latte scremato Difco, 500 g</td><td>Becton Dickinson</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Scudo DNA/RNA disidratato, 250 mL</td><td>Zymo Research</td><td>R1100-250</td><td>Terreno di conservazione DNA/RNA, 250 mL</td></tr><tr><td>Pipette Controller Easy9</td><td>LabBox</td><td>EAS9-001-001</td><td>0,3 &mu; m filtro, Pipette da 0,1 a 100 mL, Portapipette in silicone autoclavabile</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 0,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>0030121023 Polipropilene, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>Polipropilene, Safe-Lock</td></tr><tr><td>Eppendorf Tube, 5 mL</td><td>dD Biolab</td><td>999542</td><td>Polipropilene, sterile, etanolo graduato</td></tr><tr><td>96% V/V, 1 L</td><td>Panreac AppliChem</td><td>361085-1611</td> Per pinzette <td>da laboratorio UV, IR&nbsp; e HPLC</td></tr><tr><td></td><td>LabBox</td><td>FORS-007-002</td><td>Estremità sottile e curva, L= 120 mm</td></tr><tr><td>Agitatore magnetico</td><td>GenIUL</td><td>900017000</td><td>Pennarello a batteria</td></tr><tr><td></td><td>dD Biolab</td><td>929203</td><td>nero, punta extra fine, resistente all'acqua, asciugatura rapida, per plastica e vetreria</td></tr><tr><td>Micro Rota-Rack per microprovette</td><td>dD Biolab</td><td>37782</td><td>4 moduli, L x P x A= 208 x 100 x 100 mm</td></tr><tr><td>Cycler per PCR in tempo reale Mini8</td><td>Coyote Biosciences, Cina</td><td>Mini-8</td><td>portatile, funziona con alimentatori da 12 V o batterie esterne, due canali, capacità per 8 provette</td></tr><tr><td>NucliSens Lysis Buffer</td><td>Biomerieux</td><td>200292</td><td>Reagenti per un massimo di 48 isolamenti, conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica a punta aperta, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>900136N</td><td>Tappo a vite in PE sterile, confezionato singolarmente (carta/plastica)</td></tr> <tr><td>PP28</td><td>LabBox</td><td>TP28-004-020</td><td>per bottiglie in PET</td></tr><tr><td>Striscia indicatrice di pH</td><td>LabBox</td><td>WSPH-001-001</td><td>Intervallo da pH 2,8 a pH 4,4, 50 strisce per confezione</td></tr><tr><td>Provetta in plastica</td><td>Quimikals</td><td>300913</td><td>include tappo</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur in polietilene</td><td>LabBox</td><td>PIPP-003-500</td><td>Graduato, volume complessivo 7 ml, </td></tr> Pallone a vite in polipropilene non sterile <tr><td>con tappo a vite, 150 mL</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td>Tappo a vite, sterile, graduato fino a 100 mL</td></tr><tr><td>Pallone a vite in polipropilene con tappo a vite, 60 mL</td><td>Deltalab</td><td>409526G</td><td>Tappo a vite, sterile, graduato fino a 50 mL</td></tr><tr><td>Detersivo in polvere</td><td></td><td></td> <td>- Sapone in polvere normale per lavare i vestiti</td></tr><tr><td>Cavi di alimentazione per agitatore magnetico</td><td>GenIUL</td><td>900011692</td><td>Collegamento tra batterie e agitatori magnetici</td></tr><tr><td>QuickPick Magnetic Tool</td><td>BioNobile</td><td>24001</td><td>Strumento portatile per particelle magnetiche</td></tr><tr><td>QuickPick Tips in Box</td><td>BioNobile</td><td>24296</td><td>Senza RNasi, autoclavato, 96 unità</td></tr><tr><td>QuickPick XL gDNA Particelle magnetiche</td><td>BioNobile</td><td>SN51100</td><td>3,2 mL</td></tr><tr><td>Sali marini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883-500G</td><td>Una miscela di sali artificiali molto simile alla composizione dei sali disciolti dell'acqua dell'oceano</td></tr><tr><td>Tubi in silicone</td><td>LabBox</td><td>SILT-006-005</td><td>Rotolo di 5 metri, interno &nbsp; x esterno&nbsp; &oslash;= 6 x 10 mm</td></tr><tr><td>Pellet di idrossido di sodio, 98,5 - 100,5%</td> <td>VWR Chemicals</td><td>28244295</td><td>Pellet, 1 kg</td></tr><tr><td>Piattaforma solare rotante</td><td>SOL-EXPERT Gruppo</td><td>70020</td><td>Piastra in acrilico, 10 giri/min, supporta fino a 300 grammi</td></tr><tr><td>Kit di sonde SOLIScript 1-step</td><td>Solis BioDyne</td><td>08-57-00250</td><td>Include la miscela di sonde One-Step 5x (qPCR Mix) e 40x SOLIScript Mix One-Step (enzima trascrittasi inversa), 250 reazioni</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del virus RNA SPEEDTOOLS</td><td>BioTools</td><td>21.141-4197</td><td>Include il tampone BAW (tampone di lavaggio 1), il tampone BAV3 (tampone di lavaggio 2 e 3) e il tampone BRE (tampone di eluizione) di BioTools.</td></tr><tr><td>SpinBar Octhaedral Stirring Magnet</td><td>dD Biolab</td><td>045926</td><td>Pivot Ring, L x &nbsp; &oslash; = 38 x 8 mm, Pipetta sierologica blu</td></tr><tr><td>con estremità a nastro, 10 mL</td><td>Deltalab</td><td>PN10E1</td><td>sterile, confezionata singolarmente (carta/plastica)</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica con estremità a nastro, 50 mL</td><td>Deltalab</td><td>900043</td><td>sterile, confezionata singolarmente (carta/plastica)</td></tr><tr><td>Termi-DNA-Tor - Dispositivo di rimozione</td> <td>dell'acido nucleicoBioTools</td><td>22001-4291</td><td>Rimozione di acidi nucleici, batteri, funghi e micoplasmi da materiale e superfici, 450 mL</td></tr><tr><td>di reagente per biologia molecolare dell'acqua, 1L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502-1L</td><td>senza nucleasi e proteasi, 0,1 &mu; m</td></tr><tr><td>Sacca Whirl-Pak filtrata, 540 mL</td><td>Deltalab</td><td>200361</td><td>Fondo stabile</td></tr><tr><td>Sacca con chiusura a zip</td><td>LabBox</td><td>BZIP-080-100</td><td>Polietilene, L x L= 120 x 80 mm</td></tr></tbody></table>

virwatest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni d'acqua

VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples

I virus escreti da esseri umani e animali possono contaminare le fonti d'acqua e rappresentare un rischio per la salute umana quando quest'acqua viene utilizzata per bere, irrigazione alimentare, lavaggio, ecc. L'indicatore classico dei batteri fecali non sempre controlla la presenza di patogeni virali, quindi il rilevamento di patogeni virali e indicatori virali è rilevante per adottare misure di mitigazione del rischio, soprattutto in scenari umanitari e in aree dove i focolai virali trasmessi dall'acqua sono frequenti.
Attualmente, diversi test commerciali che consentono la quantificazione dei batteri dell'indicatore fecale (FIB) sono disponibili per i test presso il punto di utilizzo. Tuttavia, tali test commerciali non sono disponibili per il rilevamento di virus. La rilevazione di virus nei campioni di acqua ambientale richiede la concentrazione di diversi litri in volumi più piccoli. Inoltre, una volta concentrata, la rilevazione di virus si basa su metodi quali l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento molecolare (ad esempio, la reazione a catena della polimerasi [PCR]) dei genomi virali.
Il metodo qui descritto consente la concentrazione di virus da campioni d'acqua da 10 L, nonché l'estrazione di acidi nucleici virali nel punto di utilizzo, con apparecchiature semplici e portatili. Ciò consente la sperimentazione di campioni d'acqua nel punto di utilizzo di diversi virus ed è utile in scenari umanitari, nonché in qualsiasi contesto in cui non è disponibile un laboratorio attrezzato. In alternativa, il metodo consente di concentrare i virus presenti nei campioni d'acqua e la spedizione del concentrato in un laboratorio a temperatura ambiente per ulteriori analisi.

Sviluppo del metodo
Questa procedura è stata sviluppata nel Laboratorio dei virus Contaminanti dell'Acqua e degli Alimenti con la collaborazione di GenIUL e Oxfam Intermàn. Si compone di tre fasi diverse. Il primo, la concentrazione di particelle virali, è un adattamento di un metodo di flocculazione del latte scremato descritto in precedenza12,17,<...

Qui presentiamo VirWaTest, che è un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e il rilevamento di virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo.

VirWaTest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni d'acqua

Viruses excreted by humans and animals may contaminate water sources and pose a risk to human health when this water is used for drinking, food ...

I virus enterici si trovano principalmente in diversi bacini acquatici, tra cui acque sotterranee, acque naturali, corsi d'acqua, fiumi e acqua r. Sono associati a rischi per la salute e sono responsabili di infezioni nell'uomo. I virus enterici comunemente causano gastroenterite e sono per lo più trasmessi attraverso la via fecale-orale.Altre malattie aviotrasportabili causano l'epatite acuta da virus dell'epatite A e virus dell'epatite E, con una significativa mortalità associata, in particolare per quanto riguarda l'epatite E nelle donne in gravidanza. I protocolli effettivi per il monitoraggio della qualità dell'acqua proposti per contesti umanitari sono stati progettati per mantenere batteri come E.Coli come indicatore di contaminazione fecale. Ma è già noto che non c'è correlazione con altri microrganismi come i virus che sono più resistenti a molti processi di attivazione.Finora, l'individuazione di virus in contesti di crisi umanitaria è stata eseguita adattando i protocolli esistenti alle condizioni di tali contesti e spedendo campioni ai laboratori di riferimento per il rilevamento molecolare dei virus. Sono necessari metodi per individuare agenti patogeni virali e indicatori virali nel punto di vista per ridurre i rischi per la salute pubblica, prevenire i focolai e aumentare l'efficienza degli interventi umanitari. Proponiamo un metodo per il rilevamento di virus in campioni d'acqua da 10 litri che è diviso in tre fasi: concentrazione virale, estrazione di acido nucleico e rilevamento virale.Tutte queste fasi sono state adattate a partire dai metodi attualmente in uso nel nostro laboratorio e possono essere eseguite nel punto di vista utilizzando reagenti e apparecchiature portatili, producendo i dipendenti dell'alimentazione e dei congelatori. Inoltre, è stata aggiunta una soluzione conservante al metodo per garantire la stabilità degli acidi nucleici per la spedizione ai laboratori di riferimento, se necessario. Il metodo che proponiamo si chiama VirWaTest ed è stato sviluppato con la collaborazione di GenIUL e Intermon Oxfam.Prima di iniziare, il numero di campioni da testare deve essere preso in considerazione per la preparazione di reagenti e materiale. Si consiglia di raccogliere due repliche di ciascun campione d'acqua al fine di ottenere risultati rappresentativi. Più campioni possono essere testati contemporaneamente se è disponibile la quantità appropriata di materiale.I reagenti e i materiali devono essere preparati e imballati prima di essere spostati o spediti nel luogo in cui è necessario il metodo. L'elenco dei materiali e delle piccole attrezzature che devono essere imballati è descritto nella tabella uno. Preparare uno stock di batteriofago MS2 da aggiungere a ciascun campione d'acqua come controllo di processo seguendo il metodo ISO corrispondente.Quindi distribuire 10 microlitri di una sospensione contenente da 10 a 10 unità platform prefatti in tubi da 10 ml e lasciare asciugare l'acqua. Sarà necessario un tubo per campione d'acqua. Inoltre, preparare un tubo contenente 10 ml di acqua distillata sterile per campione raccolto.Per la soluzione di latte scremato pre-flocculato, preparare un tubo contenente il latte scremato, un sacchetto di plastica con cerniera contenente il sale marino e una bottiglia di plastica contenente l'acqua distillata. Per la regolazione del pH, preparare un tubo contenente l'acido citrico, un tubo contenente l'idrossido di sodio e due contenitori di plastica con 25 e 50 ml di acqua distillata. Per ogni campione d'acqua da testare, preparare una bustina di condizionamento aggiungendo i sali marini e l'acido citrico a un sacchetto di plastica con cerniera, e una soluzione di conservazione aggiungendo il tampone di lysis e il conservante dell'acido nucleico a un tubo da 5 ml.Infine, preparare quattro bustine neutralizzanti, aggiungendo detersivo di potenza a quattro sacchetti di plastica con cerniera. Per ogni campione d'acqua da estrarre, preparare un tubo da cinque ml contenente particelle magnetiche ed etanolo e tre tubi da 2 ml contenenti rispettivamente 500, 600 e 200 microlitri di tamponi di lavaggio uno, due e tre e un tubo contenente tampone di eluizione. Due diverse estrazioni di acido nucleico possono essere analizzate simultaneamente in ogni saggio PCR se viene utilizzato un termociclore Newell.Per tutti i test PCR, preparare l'acqua di biologia molecolare. Preparare miscele contenenti due primer e una prova specifica per ogni virus bersaglio in base ai volumi e alle concentrazioni descritti nel protocollo. Per ogni virus, aggiungere i volumi indicati in tubi da uno a otto di un vassoio tubi.Tagliare la striscia, dividendolo in due strisce. Tubi da uno a cinque e tubi da sei a otto. Per ogni virus, sospensioni del DNA ad aria secca contenenti da 10 a 5, da 10 a 7 e da 10 a 9 e copie conosciute prefazione in tubi sei, sette e otto.Questo protocollo di concentrazione si basa sul principio della flocculazione organica con cui la bassa condizione di pH e ad alta conduttività spinge le proteine del latte scremato ad organizzarsi in floc a cui i virus assorbono. Una volta sistemati i floc, possono essere facilmente raccolti. Raccogliere un campione d'acqua da 10 litri in un secchio a fondo piatto dotato di coperchio.Se si raccoglie da un tubo, lasciare correre l'acqua per alcuni secondi prima di raccogliere l'acqua. È importante utilizzare secchi chiari per visualizzare i pellet. Cerca uno spazio piatto in un luogo fresco lontano dalla luce solare diretta Metti un agitatore magnetico collegato a una batteria sotto il supporto della benna e posiziona il secchio contenente il campione d'acqua su ogni supporto.Riconsiderare l'acido citrico e l'idrossido di sodio e agitare fino a quando non sono completamente sciolti. Versare 500 mL di acqua distillata in un sacchetto stand-up e posizionare la borsa su un agitatore magnetico. Aggiungere il contenuto di una bustina di sale marino e il contenuto di un tubo di latte scremato e mescolare per cinque minuti a media velocità.Regolare il pH del latte scremato flocculato con acido citrico e idrossido di sodio su un pH compreso tra 3,4 e 3,6. Spegnere l'agitatore magnetico e assicurarsi che i floc siano visibili. Una torcia elettrica può aiutare a visualizzare i floc.Far cadere un magnete in agitazione nell'acqua. Impostare l'agitatore magnetico alla massima velocità e accenderlo. Aggiungere 10 ml di acqua distillata a un tubo controllato dal processo.Invertirlo un paio di volte e versare la soluzione nell'acqua. Versare il contenuto di una bustina di condizionamento del campione nell'acqua e mescolare per cinque minuti. Assicurarsi che il pH del campione d'acqua, che dovrebbe essere compreso tra 3,4 e 3,6.Regolare il pH, se necessario. Aggiungere 100 mL di soluzione di latte scremato pre-flocculato, sigillare il secchio con il coperchio e lasciare l'acqua mescolando per otto ore alla velocità minima. Dopo otto ore, spegnere l'agitatore magnetico e consentire ai floc di accontentarsi di almeno cinque ore in più.Con un sistema basato sull'uso di un controller pipetta, un tubo di plastica e un paio di pipette, scartare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare i passeggini sul fondo del secchio. Quando il livello dell'acqua sta per raggiungere il magnete di agitazione, spremere il tubo di plastica per fermare il flusso d'acqua e allontanare la pipetta dal secchio. Agitare il secchio per rimospendare i floc e versarli in un sacchetto di plastica stand-up.Lascia che i floc si accontenti di un'ora in più. Aspirare con cura il supernatante d'acqua utilizzando una pipetta evitando di disturbare i floc. Aspirare i floc usando una pipetta e trasferirli in un tubo conico.Annotare il volume finale del concentrato di campione e trasferire 1 ml in un tubo contenente la soluzione conservante. La sospensione può essere utilizzata per eseguire l'estrazione di acido nucleico sul campo o spedita in un laboratorio di riferimento per ulteriori analisi. L'acqua scartata durante la raccolta dei floc deve essere trattata prima dello smaltimento.Aggiungere il contenuto di una bustina di agente neutralizzante al secchio contenente l'acqua scartata. Mescolare l'acqua e lasciarla ferma per trenta minuti. Quindi smaltire l'acqua trattata come rifiuti generali.Le particelle magnetiche possono essere trasferite da un tubo all'altro utilizzando una pipetta magnetica. Abituarsi al funzionamento di una pipetta magnetica prima di eseguire l'estrazione. Disporre i tubi contenenti il reagente necessario per l'estrazione in un rack.Cioè, da sinistra a destra: buffer di associazione, buffer di lavaggio e buffer di eluizione. Trasferire 1 ml di concentrato di campione sul tubo contenente il tampone di legame utilizzando una pipetta di plastica usa e getta. Invertire il tubo dieci volte per ottimizzare la soluzione.Incubare la soluzione a temperatura ambiente per dieci minuti mescolando continuamente utilizzando un orbitale solista o manualmente. Raccogliere le particelle magnetiche utilizzando una pipetta magnetica e una punta pulita che può essere riutilizzata per i tre tamponi di lavaggio e rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente il tampone di lavaggio uno. Lavarli scuotendo delicatamente la soluzione con la punta per trenta secondi e raccoglierli.Ripetere questa procedura di lavaggio per i tamponi di lavaggio due e tre. Raccogliere le particelle magnetiche nel tampone di lavaggio tre e rilasciarle nel tubo contenente il tampone di eluizione. Quindi scartare la punta.Incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti mescolando continuamente utilizzando l'orbitale solista. Sostituire la punta sulla pipetta magnetica con una qualsiasi e raccogliere tutte le particelle magnetiche dal tampone di eluizione. Scartare la punta con le particelle attaccate.L'acido nucleico rimane nel tampone di eluizione, che dovrebbe essere immagazzinato per ulteriori analisi o spedizioni. Utilizzare una striscia a cinque tubi e una striscia a tre tubi preparata per rilevare gli adenovirus umani. Aggiungere acqua, miscela PCR ed estrazione di acido nucleico ai tubi da uno a cinque secondo il protocollo.Successivamente, aggiungere acqua e mix PCR ai tubi da sei a otto. Mettere entrambe le strisce nel termociclo e selezionare la corsa appropriata. Una volta terminata l'esecuzione, raccogliere i risultati e analizzare i dati ottenuti.Solo quando i test virali hanno provocato un rilevamento negativo, è necessario eseguire il rilevamento MS2. Utilizzare strisce di tubi preparate per il rilevamento MS2 e selezionare il profilo termico appropriato per la PCR. L'estrazione dell'acido nucleico magnetico VirWaTest è stata confrontata con l'RNA virale QIAgen, imitata testando campioni d'acqua picchiati con adenovirus umani e MS2.Il valore p del test di riduzione mostra recuperi virali significativamente più elevati utilizzando VirWaTest rispetto a QiAgen come metodo di estrazione per entrambi i virus testati. Il metodo sviluppato per la concentrazione virale è stato testato sul campo con la collaborazione di squadre di lavaggio Oxfam situate a Bangui, nella Repubblica Centrafricana e a Pedernales, in Ecuador, che hanno raccolto campioni d'acqua, li hanno concentrati applicando il metodo di concentrazione sviluppato e li hanno inviati al laboratorio di Barcellona per l'estrazione di acido nucleico e la quantificazione virale. In Ecuador, gli adenovirus umani sono stati rilevati in tutti i campioni testati, mentre uno su cinque campioni raccolti e concentrati a Bangui è risultato positivo agli adenovirus umani.Il metodo sviluppato si è dimostrato utile quando è stato valutato dai team di lavaggio di Oxfam Intermon a Bangui, nella Repubblica Centrafricana e da un altro team a Pedernales, in Ecuador. VirWaTest può far parte di un sistema di allarme rapido o può essere utilizzato nelle indagini sui focolai da parte di organizzazioni coinvolte nella sanificazione dell'acqua. Questa apparecchiatura facilita l'analisi degli agenti patogeni virali nell'acqua e il miglioramento della gestione della sicurezza idrica con l'obiettivo di ridurre gli incidenti di malattie virali in contesti di crisi umanitaria.

virwatest-point-use-method-for-detection-viruses-water

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il tasso di turnover dei virus in sistemi marini e d'acqua dolce può essere stimato da una riduzione e tecnica ripetersi. I dati permettono ai ricercatori di dedurre i tassi di virus-mediata mortalità microbica nei sistemi acquatici.

Stimare i tassi di produzione del virus nei sistemi acquatici

Lo studio descrive un metodo conveniente per l'identificazione della fonte di contaminazione fecale / urina o la contaminazione da nitrati in acqua utilizzando qPCR per la quantificazione specifica di virus DNA umano / suini / bovini, adenovirus e poliomavirus, proposti come strumenti di MST.

Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali

Questo protocollo descrive l'uso di un flusso tangenziale a fibre cave sistema di concentrazione del campione di ultrafiltrazione ed una dissociazione calore come procedura alternativa per la rilevazione di...

Un metodo modificato EPA 1623 che utilizza flusso tangenziale a fibre cave di ultrafiltrazione e di calore passi dissociazione per rilevare Waterborne<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; E<em&gt; Giardia spp.</em

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Quantifying Infectious Viruses in Water Samples Using an In Vitro Total Culturable Virus Assay

È stato sviluppato un approccio per identificare le condizioni ottimali di concentrazione virale per campioni d'acqua di piccolo volume utilizzando punte di adenovirus umano. Le tecniche qui descritte sono utilizzate per identificare i parametri di concentrazione per altri bersagli virali e applicate alla sperimentazione della concentrazione virale su larga scala.

A Procedura piccolo volume per concentrazione virale da Water

EPA Il metodo 1615 utilizza un filtro elettropositivo per concentrare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili. Questo manoscritto descrive la procedura per la raccolta dei campioni per le analisi del Metodo 1615.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Evento in acqua per la cultura e RT-qPCR. I. Raccolta di campioni di virus

Qui presentiamo una procedura per misurare i virus coltivabili totali utilizzando la linea cellulare di rene Buffalo Green Monkey. La procedura fornisce uno strumento standardizzato per misurare la presenza di virus infettivi nelle acque ambientali e potabili.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay

Qui presentiamo una procedura per quantificare enterovirus e norovirus nelle acque ambientali e potabili utilizzando la PCR quantitativa a trascrizione inversa. Il recupero medio del virus dalle acque sotterranee con questa procedura standardizzata del metodo EPA 1615 è stato del 20% per il poliovirus e del 30% per il norovirus murino.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

Un anione cambio metodo a base di resine, adattato a liquido basato su urto bioaerosol campionamento dei virus è dimostrato. Quando accoppiato con rilevazione molecolare a valle, il metodo consente facile e sensibile di rilevazione di virus da bioaerosols.

Rilevamento di virus da Bioaerosols utilizzando resina a scambio anionico

La concentrazione di virus da campioni di acqua ambientale e acque reflue è un compito impegnativo, svolto principalmente per l'identificazione e la quantificazione dei virus. Mentre diversi metodi di concentrazione del virus sono stati sviluppati e testati, dimostriamo qui l'efficacia dell'ultrafiltrazione e della flocculazione del latte scremato per i virus a RNA con diversi tipi di campioni.

Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato

Scopri VirWaTest, un metodo point-of-use per rilevare virus enterici in campioni d'acqua. Questa tecnica portatile e conveniente migliora la sicurezza idrica nei contesti umanitari e la salute pubblica.

VirWaTest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni d'acqua

Esplora altri video