VirWaTest, un metodo point-of-use per il rilevamento di virus nei campioni d'acqua

I virus enterici si trovano principalmente in diversi bacini acquatici, tra cui acque sotterranee, acque naturali, corsi d'acqua, fiumi e acqua r. Sono associati a rischi per la salute e sono responsabili di infezioni nell'uomo. I virus enterici comunemente causano gastroenterite e sono per lo più trasmessi attraverso la via fecale-orale.

Altre malattie aviotrasportabili causano l'epatite acuta da virus dell'epatite A e virus dell'epatite E, con una significativa mortalità associata, in particolare per quanto riguarda l'epatite E nelle donne in gravidanza. I protocolli effettivi per il monitoraggio della qualità dell'acqua proposti per contesti umanitari sono stati progettati per mantenere batteri come E.Coli come indicatore di contaminazione fecale. Ma è già noto che non c'è correlazione con altri microrganismi come i virus che sono più resistenti a molti processi di attivazione.

Finora, l'individuazione di virus in contesti di crisi umanitaria è stata eseguita adattando i protocolli esistenti alle condizioni di tali contesti e spedendo campioni ai laboratori di riferimento per il rilevamento molecolare dei virus. Sono necessari metodi per individuare agenti patogeni virali e indicatori virali nel punto di vista per ridurre i rischi per la salute pubblica, prevenire i focolai e aumentare l'efficienza degli interventi umanitari. Proponiamo un metodo per il rilevamento di virus in campioni d'acqua da 10 litri che è diviso in tre fasi: concentrazione virale, estrazione di acido nucleico e rilevamento virale.

Tutte queste fasi sono state adattate a partire dai metodi attualmente in uso nel nostro laboratorio e possono essere eseguite nel punto di vista utilizzando reagenti e apparecchiature portatili, producendo i dipendenti dell'alimentazione e dei congelatori. Inoltre, è stata aggiunta una soluzione conservante al metodo per garantire la stabilità degli acidi nucleici per la spedizione ai laboratori di riferimento, se necessario. Il metodo che proponiamo si chiama VirWaTest ed è stato sviluppato con la collaborazione di GenIUL e Intermon Oxfam.

Prima di iniziare, il numero di campioni da testare deve essere preso in considerazione per la preparazione di reagenti e materiale. Si consiglia di raccogliere due repliche di ciascun campione d'acqua al fine di ottenere risultati rappresentativi. Più campioni possono essere testati contemporaneamente se è disponibile la quantità appropriata di materiale.

I reagenti e i materiali devono essere preparati e imballati prima di essere spostati o spediti nel luogo in cui è necessario il metodo. L'elenco dei materiali e delle piccole attrezzature che devono essere imballati è descritto nella tabella uno. Preparare uno stock di batteriofago MS2 da aggiungere a ciascun campione d'acqua come controllo di processo seguendo il metodo ISO corrispondente.

Quindi distribuire 10 microlitri di una sospensione contenente da 10 a 10 unità platform prefatti in tubi da 10 ml e lasciare asciugare l'acqua. Sarà necessario un tubo per campione d'acqua. Inoltre, preparare un tubo contenente 10 ml di acqua distillata sterile per campione raccolto.

Per la soluzione di latte scremato pre-flocculato, preparare un tubo contenente il latte scremato, un sacchetto di plastica con cerniera contenente il sale marino e una bottiglia di plastica contenente l'acqua distillata. Per la regolazione del pH, preparare un tubo contenente l'acido citrico, un tubo contenente l'idrossido di sodio e due contenitori di plastica con 25 e 50 ml di acqua distillata. Per ogni campione d'acqua da testare, preparare una bustina di condizionamento aggiungendo i sali marini e l'acido citrico a un sacchetto di plastica con cerniera, e una soluzione di conservazione aggiungendo il tampone di lysis e il conservante dell'acido nucleico a un tubo da 5 ml.

Infine, preparare quattro bustine neutralizzanti, aggiungendo detersivo di potenza a quattro sacchetti di plastica con cerniera. Per ogni campione d'acqua da estrarre, preparare un tubo da cinque ml contenente particelle magnetiche ed etanolo e tre tubi da 2 ml contenenti rispettivamente 500, 600 e 200 microlitri di tamponi di lavaggio uno, due e tre e un tubo contenente tampone di eluizione. Due diverse estrazioni di acido nucleico possono essere analizzate simultaneamente in ogni saggio PCR se viene utilizzato un termociclore Newell.

Per tutti i test PCR, preparare l'acqua di biologia molecolare. Preparare miscele contenenti due primer e una prova specifica per ogni virus bersaglio in base ai volumi e alle concentrazioni descritti nel protocollo. Per ogni virus, aggiungere i volumi indicati in tubi da uno a otto di un vassoio tubi.

Tagliare la striscia, dividendolo in due strisce. Tubi da uno a cinque e tubi da sei a otto. Per ogni virus, sospensioni del DNA ad aria secca contenenti da 10 a 5, da 10 a 7 e da 10 a 9 e copie conosciute prefazione in tubi sei, sette e otto.

Questo protocollo di concentrazione si basa sul principio della flocculazione organica con cui la bassa condizione di pH e ad alta conduttività spinge le proteine del latte scremato ad organizzarsi in floc a cui i virus assorbono. Una volta sistemati i floc, possono essere facilmente raccolti. Raccogliere un campione d'acqua da 10 litri in un secchio a fondo piatto dotato di coperchio.

Se si raccoglie da un tubo, lasciare correre l'acqua per alcuni secondi prima di raccogliere l'acqua. È importante utilizzare secchi chiari per visualizzare i pellet. Cerca uno spazio piatto in un luogo fresco lontano dalla luce solare diretta Metti un agitatore magnetico collegato a una batteria sotto il supporto della benna e posiziona il secchio contenente il campione d'acqua su ogni supporto.

Riconsiderare l'acido citrico e l'idrossido di sodio e agitare fino a quando non sono completamente sciolti. Versare 500 mL di acqua distillata in un sacchetto stand-up e posizionare la borsa su un agitatore magnetico. Aggiungere il contenuto di una bustina di sale marino e il contenuto di un tubo di latte scremato e mescolare per cinque minuti a media velocità.

Regolare il pH del latte scremato flocculato con acido citrico e idrossido di sodio su un pH compreso tra 3,4 e 3,6. Spegnere l'agitatore magnetico e assicurarsi che i floc siano visibili. Una torcia elettrica può aiutare a visualizzare i floc.

Far cadere un magnete in agitazione nell'acqua. Impostare l'agitatore magnetico alla massima velocità e accenderlo. Aggiungere 10 ml di acqua distillata a un tubo controllato dal processo.

Invertirlo un paio di volte e versare la soluzione nell'acqua. Versare il contenuto di una bustina di condizionamento del campione nell'acqua e mescolare per cinque minuti. Assicurarsi che il pH del campione d'acqua, che dovrebbe essere compreso tra 3,4 e 3,6.

Regolare il pH, se necessario. Aggiungere 100 mL di soluzione di latte scremato pre-flocculato, sigillare il secchio con il coperchio e lasciare l'acqua mescolando per otto ore alla velocità minima. Dopo otto ore, spegnere l'agitatore magnetico e consentire ai floc di accontentarsi di almeno cinque ore in più.

Con un sistema basato sull'uso di un controller pipetta, un tubo di plastica e un paio di pipette, scartare il supernatante, facendo attenzione a non disturbare i passeggini sul fondo del secchio. Quando il livello dell'acqua sta per raggiungere il magnete di agitazione, spremere il tubo di plastica per fermare il flusso d'acqua e allontanare la pipetta dal secchio. Agitare il secchio per rimospendare i floc e versarli in un sacchetto di plastica stand-up.

Lascia che i floc si accontenti di un'ora in più. Aspirare con cura il supernatante d'acqua utilizzando una pipetta evitando di disturbare i floc. Aspirare i floc usando una pipetta e trasferirli in un tubo conico.

Annotare il volume finale del concentrato di campione e trasferire 1 ml in un tubo contenente la soluzione conservante. La sospensione può essere utilizzata per eseguire l'estrazione di acido nucleico sul campo o spedita in un laboratorio di riferimento per ulteriori analisi. L'acqua scartata durante la raccolta dei floc deve essere trattata prima dello smaltimento.

Aggiungere il contenuto di una bustina di agente neutralizzante al secchio contenente l'acqua scartata. Mescolare l'acqua e lasciarla ferma per trenta minuti. Quindi smaltire l'acqua trattata come rifiuti generali.

Le particelle magnetiche possono essere trasferite da un tubo all'altro utilizzando una pipetta magnetica. Abituarsi al funzionamento di una pipetta magnetica prima di eseguire l'estrazione. Disporre i tubi contenenti il reagente necessario per l'estrazione in un rack.

Cioè, da sinistra a destra: buffer di associazione, buffer di lavaggio e buffer di eluizione. Trasferire 1 ml di concentrato di campione sul tubo contenente il tampone di legame utilizzando una pipetta di plastica usa e getta. Invertire il tubo dieci volte per ottimizzare la soluzione.

Incubare la soluzione a temperatura ambiente per dieci minuti mescolando continuamente utilizzando un orbitale solista o manualmente. Raccogliere le particelle magnetiche utilizzando una pipetta magnetica e una punta pulita che può essere riutilizzata per i tre tamponi di lavaggio e rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente il tampone di lavaggio uno. Lavarli scuotendo delicatamente la soluzione con la punta per trenta secondi e raccoglierli.

Ripetere questa procedura di lavaggio per i tamponi di lavaggio due e tre. Raccogliere le particelle magnetiche nel tampone di lavaggio tre e rilasciarle nel tubo contenente il tampone di eluizione. Quindi scartare la punta.

Incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti mescolando continuamente utilizzando l'orbitale solista. Sostituire la punta sulla pipetta magnetica con una qualsiasi e raccogliere tutte le particelle magnetiche dal tampone di eluizione. Scartare la punta con le particelle attaccate.

L'acido nucleico rimane nel tampone di eluizione, che dovrebbe essere immagazzinato per ulteriori analisi o spedizioni. Utilizzare una striscia a cinque tubi e una striscia a tre tubi preparata per rilevare gli adenovirus umani. Aggiungere acqua, miscela PCR ed estrazione di acido nucleico ai tubi da uno a cinque secondo il protocollo.

Successivamente, aggiungere acqua e mix PCR ai tubi da sei a otto. Mettere entrambe le strisce nel termociclo e selezionare la corsa appropriata. Una volta terminata l'esecuzione, raccogliere i risultati e analizzare i dati ottenuti.

Solo quando i test virali hanno provocato un rilevamento negativo, è necessario eseguire il rilevamento MS2. Utilizzare strisce di tubi preparate per il rilevamento MS2 e selezionare il profilo termico appropriato per la PCR. L'estrazione dell'acido nucleico magnetico VirWaTest è stata confrontata con l'RNA virale QIAgen, imitata testando campioni d'acqua picchiati con adenovirus umani e MS2.

Il valore p del test di riduzione mostra recuperi virali significativamente più elevati utilizzando VirWaTest rispetto a QiAgen come metodo di estrazione per entrambi i virus testati. Il metodo sviluppato per la concentrazione virale è stato testato sul campo con la collaborazione di squadre di lavaggio Oxfam situate a Bangui, nella Repubblica Centrafricana e a Pedernales, in Ecuador, che hanno raccolto campioni d'acqua, li hanno concentrati applicando il metodo di concentrazione sviluppato e li hanno inviati al laboratorio di Barcellona per l'estrazione di acido nucleico e la quantificazione virale. In Ecuador, gli adenovirus umani sono stati rilevati in tutti i campioni testati, mentre uno su cinque campioni raccolti e concentrati a Bangui è risultato positivo agli adenovirus umani.

Il metodo sviluppato si è dimostrato utile quando è stato valutato dai team di lavaggio di Oxfam Intermon a Bangui, nella Repubblica Centrafricana e da un altro team a Pedernales, in Ecuador. VirWaTest può far parte di un sistema di allarme rapido o può essere utilizzato nelle indagini sui focolai da parte di organizzazioni coinvolte nella sanificazione dell'acqua. Questa apparecchiatura facilita l'analisi degli agenti patogeni virali nell'acqua e il miglioramento della gestione della sicurezza idrica con l'obiettivo di ridurre gli incidenti di malattie virali in contesti di crisi umanitaria.