Name: Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti negli interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Scopri la riprogrammazione in vivo delle cellule gliali in interneuroni parvalbumina-positivi mediante vettori virali AAV nel cervello di topo. Questo metodo offre potenziali applicazioni per terapie di sostituzione cellulare nei disturbi psichiatrici.

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Marcella Birtele è stata finanziata dal Programma dell'Unione Europea Orizzonte 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) nell'ambito delle reti di formazione innovativa Marie Skaodowskae e dell'accordo di sovvenzione n. 676408. Daniella Rylander Ottosson è stata finanziata dal Consiglio svedese della ricerca (2017-01234).

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<li>Grealish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A9+dopamine+neuron+component+in+grafts+of+ventral+mesencephalon+is+an+important+determinant+for+recovery+of+motor+function+in+a+rat+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is an important determinant for recovery of motor function in a rat model of Parkinson's disease.</a> Brain. 133 (Pt 2), 482-495 (2010).</li>
<li>Thompson, L., Barraud, P., Andersson, E., Kirik, D., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+dopaminergic+neurons+of+nigral+and+ventral+tegmental+area+subtypes+in+grafts+of+fetal+ventral+mesencephalon+based+on+cell+morphology%2C+protein+expression%2C+and+efferent+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of dopaminergic neurons of nigral and ventral tegmental area subtypes in grafts of fetal ventral mesencephalon based on cell morphology, protein expression, and efferent projections.</a> Journal of Neuroscience. 25 (27), 6467-6477 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La riprogrammazione diretta in vivo può essere ottenuta utilizzando vettori AAV FLEX in ceppi di mouse che esprimono Cre. È importante notare che sono state osservate differenze tra i ceppi di topi per quanto riguarda l'efficacia della riprogrammazione. Per la riprogrammazione in vivo nello striato, la linea murino NG2-Cre si è dimostrata più efficiente rispetto ad altri ceppi. Prima di iniziare a utilizzare un nuovo ceppo animale, è importante controllare le linee guida del fornitore di topi per quanto riguarda l'espressione Cre nel tempo, poiché l'età degli animali spesso influisce sulla specificità di questa espressione proteica. Nei nostri studi, gli animali di età superiore a 12 settimane non sono stati utilizzati per la riprogrammazione in vivo in quanto vi era un rischio per l'espressione creina in cellule diverse da NG2 glia. Si consiglia la presenza costante e il monitoraggio degli animali di controllo iniettati solo con il costrutto Synapsin-FLEX-GFP. Ciò consente di monitorare gli animali per le cellule GFP-positive che non dovrebbero essere presenti se non vengono utilizzati geni di riprogrammazione (ALN).
Per identificare i neuroni appena riprogrammati, un metodo di identificazione specifico del neurone come quello descritto in questo protocollo è della massima importanza. Ciò consente una corretta identificazione e distinzione dei neuroni riprogrammati dalle cellule circostanti endogene che è di particolare rilevanza quando la riprogrammazione in una regione omotopica.
È anche importante indirizzare la struttura corretta per l'iniezione virale. Pertanto, la chirurgia stereotassica per l'iniezione virale è importante e deve essere affrontata con precisione, soprattutto quando si mirano strutture più piccole del cervello.
In precedenza abbiamo dimostrato11 che non è affidabile prevedere l'esito della riprogrammazione in vivo basata su esperimenti di riprogrammazione in vitro utilizzando gli stessi fattori di riprogrammazione. Tutti i fattori di interesse devono quindi essere testati in vivo. Nelle nostre mani, molte combinazioni di fattori diversi danno lo stesso sottotipo di neuroni (cioè interneuroni11 in vivo) nonostante il fatto che questi geni siano stati implicati nello sviluppo di altri neuroni.
Il morsetto a celle intere per i neuroni riprogrammati è una tecnica delicata e l'elaborazione dei tessuti è importante per un buon risultato. La perfusione con soluzione Krebs ghiacciata migliora la qualità dei tessuti. Inoltre, i neuroni patchati devono essere trattati con attenzione. Anche se la maturazione e l'identità fenotipica dei neuroni riprogrammati possono essere in qualche modo valutate utilizzando il morsetto di patch a tutta cellula, queste cellule non sono completamente comparabili alle loro controparti endogene. Ulteriori tipi di analisi, come il sequenziamento del genoma (ad esempio, il sequenziamento dell'RNA) dovrebbero essere utilizzati per confermare ulteriormente l'identità cellulare riprogrammata.
La tecnica qui descritta potrebbe essere considerata per lo sviluppo di future terapie in cui è necessaria la sostituzione neuronale nel cervello. Anche se la riprogrammazione in vivo è ancora nelle sue fasi iniziali e la traduzione negli esseri umani non è ancora prevista, questa tecnica potrebbe fornire un metodo per valutare la funzione genica esogena nel cervello e studiare la maturazione cellulare in vivo.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di convertire in modo efficiente la glia residente del cervello in vivo in neuroni funzionali e specifici per sottotipo, come gli interneuroni che esprimono parvalbumina. Questo fornisce un passo avanti verso lo sviluppo di una terapia sostitutiva cellulare alternativa per le malattie cerebrali senza la necessità di una fonte cellulare esogena. Crea anche uno strumento per studiare gli interruttori del destino cellulare in situ.
Il cervello ha solo una capacità limitata per generare nuovi neuroni. Pertanto, nelle malattie neurologiche, c'è bisogno di fonti cellulari esogene per la riparazione del cervello. Per questo, diverse fonti di cellule sono state sottoposte a intense ricerche nel corso degli anni, comprese le cellule dal tessuto primario, cellule derivate da cellule staminali e cellule riprogrammate1,2,3. Riprogrammazione diretta delle cellule cerebrali residenti in neuroni è un approccio recente che potrebbe fornire un metodo attraente per la riparazione del cervello in quanto utilizza le cellule del paziente per generare nuovi neuroni all'interno del cervello. Ad oggi, diversi rapporti hanno dimostrato che la riprogrammazione in vivo attraverso la consegna di vettori virali nel cervello4,5,6,78,9 in diverse regioni del cervello come la corteccia, il midollo spinale, lo striato e il midbrain5,10,11, così come nel cervello intatto e lesione5,8,11,12. Entrambi i neuroni inibitori ed eccitatori sono stati ottenuti4,8, ma il fenotipo preciso o la funzionalità di queste cellule non è ancora stato analizzato in dettaglio.
In questo protocollo, descriviamo una riprogrammazione più efficiente e un'identificazione specifica delle cellule dei neuroni riprogrammati in vivo. Forniamo un protocollo per la valutazione funzionale della maturazione neuronale e della caratterizzazione del fenotipo in base alla funzionalità e ai tratti immunohistochimici.
Abbiamo usato un vettore AAV Cre-inducible e un reporter GFP per identificare i neuroni riprogrammati in vivo. Questa scelta di vettori virali ha il vantaggio di infettare sia le cellule divisorie che non divise del cervello, aumentando il numero di cellule mirate, in alternativa all'uso del retrovirus7,8. Un giornalista FLEX (GFP) specifico della sinapsi specifico del neurone, ci ha permesso di rilevare specificamente i neuroni appena generati. Studi precedenti hanno utilizzato promotori specifici di sottotipi per la riprogrammazione in vivo7,9, che consentono anche l'espressione di geni di riprogrammazione e reporter in tipi di cellule specifiche. Tuttavia, tale metodo richiede un'ulteriore identificazione dei neuroni riprogrammati mediante analisi post-mortem della co-espressione dei marcatori reporter e neuronali. L'uso di un reporter specifico del neurone, come quello descritto nel presente documento, consente un'identificazione diretta. Questo fornisce una prova diretta di una conversione di successo e consente un'identificazione delle cellule vive che è necessaria per l'elettrofisiologia patch-clamp.

<table><tbody><tr><td>REAGENTI PER IL CLONAGGIO DI AAV5 E LA PREPARAZIONE DI VETTORI VIRALI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAAV-CA-FLEX</td><td>AddGene</td><td>38042</td><td></td></tr><tr><td>Ascl1</td><td>AddGene</td><td>67291</td><td>NM_008553.4</td></tr><tr><td>Lmx1a</td><td>AddGene</td><td>33013</td><td>NM_0033652.5</td></tr><tr><td>Nurr1</td><td>AddGene</td><td>35000</td><td>NM_013613.2</td></tr><tr><td>GFP-syn</td><td>AddGene</td><td>30456</td><td></td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequenza 1</td><td></td><td></td><td>GATCTccataacttcgtataaagtatcctatac gaagttatatcaaaataggaagaccaatgcttc accatcgacccgaattgccaagcatcaccatcg acccataacttcgtataatgtatgctatacgaa gttatactagtcccgggaaggaggcgaagacgcgga agaggctctaga</td></tr><tr><td>LoxP (FLEX) sequenze 2</td><td></td><td></td><td>tactagtataacttcgtataggatactttatac gaagttatcattgggattcttcctattttgatc caagcatcaccatcgaccctctagtccacatctct caccatcgacccataacttcgtatagcatacat tatacgaagttatgtctcgaagaggttcgaaa ttcgtttaaacGGTACCCTCGAC</td></tr><tr><td>pDP5</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF435</td><td></td></tr><tr><td>pDP6</td><td>Plasmid Factory</td><td>PF436</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Siero fetale bovino)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)+ Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965026</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Celle 14190094</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85120602-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche</td><td>BD Falcon</td><td>10078780</td><td>175 cm2</td></tr><tr><td>Tris H-CL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td> Per tampone TE utilizzare 10 mM, pH 8,0; per tampone di lisi utilizzare 50 mM, pH 8,5; per tampone IE utilizzare 20 mM, pH 8,0; per tampone di eluizione utilizzare 20 mM, pH 8,0 </td></tr><tr><td>EDTA</td><td>EDTA: Invitrogen</td><td>EDTA: AM9260G</td><td> Per il tampone TE utilizzare 1 mM EDTA </td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td> ultrapura <td> vedere Sistema per acqua ultrapura </td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SigmaAldrich</td><td>C5080</td><td>2,5 M</td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td> PER HBS utilizzare 140 mM; per tampone di lisi utilizzare 150 mM; per tampone IE utilizzare 15 mM; per tampone di eluizione utilizzare 250 mM </td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td> Per tampone di lisi: 1 mM </td></tr><tr><td>Provette di tenuta per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Quick-Seal&reg; &nbsp; Tubo in</td><td></td>polipropilene</tr><tr><td>OptiPrep&trade; &nbsp; Gradiente di densità medio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10-mL siringa-18G ago</td><td>BD</td><td>305064</td><td></td></tr><tr><td>Bottiglie di vetro da laboratorio</td><td>VWR</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Filtro a scambio anionico</td><td>MSTG25Q6 da laboratorio PALL</td><td></td><td> Unità Acrodisc con membrana Mustang Q </td></tr><tr><td>Unità filtrante centrifuga</td><td>Merck</td><td>Z740210-24EA</td><td> Dispositivo Amicon Ultra-4 </td></tr><tr><td>Kit di isolamento del DNA plasmidico senza endotossine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A33073</td><td></td></tr><tr><td>Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td> Tubo Falcon <td>da 15 ml</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352196</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Corning 352070</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro</td><td>Novatech</td><td>30209-1232</td><td> CGGCCTCAGFGAGGGGA </td></tr><tr><td>Primer diretto per sequenza</td><td></td><td></td> ITR (Inverted Terminal Repeat) <td> GGAACCCCTAGTGATGGAGTT </td></tr><tr><td>Primer inverso per la sequenza</td><td></td><td></td> di ripetizione terminale invertita (ITR) <td> CACTCCCTCTGCGCGCTCG </td></tr><tr><td>5&acute; FAM / 3&acuto; Sonda BHQ1</td><td>Jena Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro da 0,22 mm</td><td>Merck</td><td>SLGV004SL</td><td>Filtro Millex-GV</td></tr><tr><td>ATTREZZATURA AAV5 PREPARAZIONE DEL VETTORE VIRALE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelatore -20 gradi; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelatore -80 &deg; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero +4 gradi C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAV per sala</td><td></td><td></td><td></td>virale</tr><tr><td>Sistema di acqua ultrapura</td><td>Merck</td><td>Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>VWR</td><td>444-0004</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Beckman Optima LE-80K Ultracentrifuga</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Tuttnauer</td><td>2540 EL</td><td></td></tr><tr><td>Reazione a catena della polimerasi (PCR)</td><td>BioRad</td><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>PCR quantitativa (qPCR)</td><td>Roche</td><td>LightCycler&reg; 480 Sistema</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Sorvall ST16</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>ANIMAL MODEL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NG2-Cre topi</td><td>Jackson</td><td>NG2-CrexB6129, Stock #008533</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTI PER L'INIEZIONE DI FATTORI DI RIPROGRAMMAZIONE NEL CERVELLO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td>70%</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Solveco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolfurane</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td> Diluire all'1% la soluzione con acqua tiepida. </td></tr><tr><td>Virkon</td><td>Viroderm</td><td>7511&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Apoteket AB</td><td>P0500000</td><td> i.p. per procedura terminale alla dose di 60 mg/ml. </td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Merck</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Retrobeads</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>Apoteket AB</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>EQUIPMENT PER L'INIEZIONE DI FATTORI DI RIPROGRAMMAZIONE NEL CERVELLO</td><td></td><td></td><td> Da RSG Solingen. </td></tr><tr><td>Forbici</td><td>VWR</td><td>233-1552</td><td>di Biochem.</td></tr><tr><td>Pinzetta</td><td>VWR</td><td>232-0007</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>VWR</td><td>232-0120</td><td></td></tr><tr><td>Porta bisturi</td><td>VWR</td><td>RSGA106.621</td><td>Numero 20.</td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>VWR</td><td>RSGA106.200</td><td></td></tr><tr><td>Montatura stereotassica</td><td>Stoelting Europe</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Barre auricolari per mouse</td><td>Stoelting Europe</td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 5 ul con ago rimovibile</td><td>Hamilton Company</td><td>65</td><td> 0,75 diametro interno e 1,5 diametro esterno. </td></tr><tr><td>Capari in vetro</td><td>Stoelting</td><td>50811</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore capillare in vetro</td><td>Azienda</td><td>Sutter P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trapano dentale</td><td>Agnthos AB</td><td>1464</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio</td><td>Agnthos AB</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>Camera e pompa isoflurano</td><td>Agnthos AB</td><td>8323101</td><td>Siringhe da 2 ml</td></tr><tr><td>Merck</td><td></td><td>Z118400-30EA</td><td>25G</td></tr><tr><td>Aghi</td><td>Merck</td><td>Z192414&nbsp; Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore per topo e ratto neonatale per telaio stereotassico</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Braintree scientific, inc</td><td>53800M</td><td> Da Covidien 2187. </td></tr><tr><td>Garza di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-037-902</td><td></td></tr><tr><td>Tubo di gomma</td><td>Elfa Distrelec</td><td>HFT-A-9.5/4.8 PO-X BK 150</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-366-473</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTI PER REGISTRAZIONI DI PATCH CLAMP A CELLULE INTERE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4-H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2-6 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7 H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td> vedi Sistema di acqua ultrapura </td></tr><tr>Acqua <td>ultrapura</td><td></td><td></td><td>Preparare 1 o 2M.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>K-D-gluconato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KOH-EGTA (Acido etilglicol-bis-N-tetracetico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889&nbsp; Acido Sigma</td><td></td></tr><tr><td>KOH- Hepes (acido N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Mg2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Picrotossina</td><td>Merck</td><td>P1675&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Merck</td><td>C239&nbsp; Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATTREZZATURA PER REGISTRAZIONI DI PATCH CLAMP A CELLE INTERE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in vetro borosilicato</td><td>Sutter Company</td><td>B150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore capillare in vetro</td><td>Sutter company</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>Leica VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>WaterBath</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSGP02</td><td></td></tr><tr><td>Software Clampfit</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr> Software <tr><td>Multiclamp</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY</td><td></td><td></td><td> Utilizzare a una concentrazione del 4%.&nbsp; ATTENZIONE:&nbsp; Il PFA è un potente fissativo. Evitare l'ingestione e il contatto con la pelle. </td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Merck Millipore</td><td>1040051000</td><td> Utilizzare ad una concentrazione dello 0,1%. </td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>10254640</td><td> Donkey.Utilizzare ad una concentrazione di 1 : 400. </td></tr><tr><td>Siero</td><td>Merck Millipore</td><td>S30-100ML</td><td> Ricostituire la polvere in acqua Milli-Q a 1 mg/mL. Aliquotare e conservare a -20 gradi C,&nbsp; sensibile alla luce. Utilizzare ad una concentrazione di 1 : 500. </td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2&prime;-fenilindolo dicloridrato (DAPI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td> 1: 600 in KPBS-T. </td></tr><tr><td>streptavidina- Cy3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434315</td><td>1:5000, coniglio.</td></tr><tr><td>Anti-GAD65/67</td><td>Abcam</td><td></td><td>1:2000, mouse.</td></tr><tr><td>Anti-PV</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td>1:200, capra.</td></tr><tr><td>Anti-Chat</td><td>Merk</td><td>AB143</td><td>1:5000, coniglio.</td></tr><tr><td>Anti-NPY</td><td>Immunostar</td><td>22940</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td>1:1000, pollo.</td></tr><tr><td>Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di montaggio</td><td>Merck</td><td>10981</td><td> Mezzo di montaggio in alcool polivinilico con DABCO&reg;, OCT antifading </td></tr><tr><td></td><td>Agar Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td>distillata</tr><tr><td>Soluzione antigelo</td><td>Tissue Pro Technology</td><td>AFS05-1000N, 1000 mL/cad.</td><td></td></tr><tr><td>APPARECCHIATURA PER IMMUNOISTOCHIMICA</td>Microscopio a fluorescenza invertita Leica DMI6000 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica</td><td>TCS SP8 Microscopio confocale a scansione laser.</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo GraphPad</td><td></td><td></td><td></td>a</tr><tr><td>prisma</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td></td></tr></tbody></table>

riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti negli interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

La conversione della glia residente nel cervello in neuroni funzionali e specifici del sottotipo in vivo fornisce un passo avanti verso lo sviluppo di terapie alternative di sostituzione cellulare, creando anche strumenti per studiare il destino cellulare in situ. Fino ad oggi, è stato possibile ottenere neuroni tramite la riprogrammazione in vivo, ma il fenotipo preciso di questi neuroni o come maturano non è stato analizzato in dettaglio. In questo protocollo, descriviamo una conversione più efficiente e un'identificazione specifica delle cellule dei neuroni riprogrammati in vivo, utilizzando un sistema vettoriale virale basato su AAV. Forniamo anche un protocollo per la valutazione funzionale della maturazione neuronale delle cellule riprogrammate. Iniettando vettori flex (flip-escisione), contenenti i geni reporter riprogrammazione e synapsin a specifici tipi di cellule nel cervello che fungono da bersaglio per la riprogrammazione cellulare. Questa tecnica consente la facile identificazione dei neuroni appena riprogrammati. I risultati mostrano che i neuroni riprogrammati ottenuti maturano funzionalmente nel tempo, ricevono contatti sinaptici e mostrano proprietà elettrofisiologiche di diversi tipi di interneuroni. Utilizzando i fattori di trascrizione Ascl1, Lmx1a e Nurr1, la maggior parte delle cellule riprogrammate hanno proprietà di interneuroni contenenti parvalbumina a punta rapida.

L'iniezione di vettori AAV viene utilizzata per riprogrammare con successo le cellule glia NG2 residenti nei neuroni nello striato del topo NG2-Cre (Figura 1A). Per rivolgersi specificamente a NG2 glia, i vettori FLEX con geni di riprogrammazione/reporter, vengono inseriti in una direzione antisenso e affiancati da due coppie di siti loxP antiparalleli ed eterotipici (Figura 1B). Ognuno dei tre geni di riprogrammazione (Ascl1, Lmx1a e Nurr1) è posto sotto il controllo dell'onnipresente promotore cba su singoli vettori. Al fine di assicurarsi che l'espressione GFP sia limitata ai neuroni riprogrammati provenienti da una cellula che esprime la Crestia, la GFP viene posta sotto il controllo del promotore di sinapsi specifico del neurone, (anche in un vettore FLEX).
L'uso della combinazione di riprogrammazione e costrutti reporter consente la generazione di neuroni GFP-positivi nello striato del topo (Figura 1C,C'). L'uso del costrutto reporter senza la presenza di geni di riprogrammazione non produce neuroni GFP-positivi (Figura 1D).
I neuroni riprogrammati riempiti di biocitina sono visibili dopo l'immuno-colorazione post-mortem (Figura 2A). Se la conversione ha successo, ci dovrebbe essere ampia morfologia neuronale. Le registrazioni elettrofisiologiche dei neuroni riprogrammati mostrano la presenza di connessioni funzionali post-sinaptiche con misure di attività spontanea (Figura 2B, C). Questo può essere bloccato con blocco ionotropico GABAergic o glutamatergico (Picrotoxin o CNQX), suggerendo sia input sinaptico eccitatorio e inibitorio per i neuroni riprogrammati. L'insorgenza di attività spontanea aumenta con il tempo dopo l'iniezione virale (Figura 2D), indicando una maturazione graduale.
I potenziali d'azione indotti dall'attuale sono presenti nei neuroni funzionali. I potenziali di azione aumentano di numero nel tempo dopo la conversione (Figura 2E). Questo indica ulteriormente la maturazione nella funzione neuronale. In un neurone immaturo, la corrente indurrà nessuno o pochissimi potenziali d'azione (Figura 2F).
I modelli di cottura di un neurone sono specifici del tipo di cellula in quanto dipende da fattori come la morfologia delle cellule e l'espressione del canale15. I modelli registrati nei neuroni riprogrammati in vivo possono essere distinti in gruppi e confrontati con quelli di sottotipi neuronali endogeni, ad esempio interneuroni a chiodare veloce (Tipo di cella B, Figura 3B) o altri tipi di cellule (Figura 3A, C,D ). Le differenze elettrofisiologiche osservate possono essere confermate dalla presenza di specifici marcatori di sottotipi e co-espressione con GFP (Figura 3E-H). Complessivamente, questi dati indicano che i neuroni riprogrammati presenti nello striato hanno proprietà di diversi tipi di interneuroni, come Parvalbumin-, ChAt- e NPY- che esprimono interneuroni, così come l'identità striata del neurone spinoso medio (DARPP32) ( Figura 3E -H).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig1.jpg"> Figura 1: Riprogrammazione in vivo della glia NG2 residente in neuroni. (A) Rappresentazione schematica della riprogrammazione in vivo mediata dal virus AAV della striale NG2 glia. (B) Rappresentazione schematica dei costrutti AAV5 FLEX utilizzati per la riprogrammazione in vivo, in cui l'espressione genica è regolata dall'espressione Cre nelle cellule mirate. (C e C')Neuroni in vivo riprogrammati, risultanti dall'iniezione Syn-GFP - ALN nello Striatum. (D) L'assenza di neuroni riprogrammati quando non vengono aggiunti fattori di riprogrammazione nel cocktail virale e viene iniettato solo il costrutto reporter in vivo. Barre di scala: 100 mm (C), 25 mm (C'), 25 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig2.jpg"> Figura 2: I neuroni riprogrammati in vivo sono funzionali e mostrano la maturazione nel tempo. (A) Neurone riprogrammato pieno di biocitina, mostra una morfologia neuronale matura, comprese le spine dendritiche. Tracce mostra (B) attività inibitoria (GABAergic) che è bloccato con picrotosina, un antagonista recettore GABAA e (C) attività eccitatoria che è bloccato con CNQX, un antagonista recettore AMPA. (D) Il numero di neuroni con attività post-sinaptica aumenta nel tempo. (E) I neuroni patchati mostrano una cottura ripetitiva già a 5 settimane dopo l'iniezione (w.p.i.) e continuano a mostrare che a 8 e 12 w.p.i. (F) Potenziale di azione indotta dall'attuale e attività post-sinaptica di un neurone immaturo, mostrando pochi eventi e pochi potenziali di azione rispetto alla barra di scala B e D. 25 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2.jpg"> Figura 3: I neuroni riprogrammati in vivo mostrano le proprietà immunohistochimiche ed elettrofisiologiche degli interneuroni striatali. (A-D) I modelli di cottura dei neuroni riprogrammati in vivo possono essere di tipi distinti: (A) Il tipo A è simile al neurone spinoso medio endogeno (DARPP32); (B) simile agli interneuroni a chiodare veloce (PV) ; (C) simile ai neuroni chiodati a bassa soglia con cedimento prominente (NPY); (D) neuroni che sparano con grande post-iperpolarizzazione (Chat). (E-H) Immagini confocali che mostrano la co-localizzazione di GFP e dei marcatori interneuroni PV (E), ChAT (F), NPY (G) e marcatore neuronale di proiezione DARPP32 (H). Tutte le barre in scala - 50 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59465/59465fig3v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo mira a generare interneuroni direttamente riprogrammati in vivo, utilizzando un sistema virale basato su AAV nel cervello e un giornalista GFP basato sulla sinapsi FLEX, che consente l'identificazione delle cellule e ulteriori analisi in vivo.

Riprogrammazione diretta in vivo delle cellule gliali residenti negli interneuroni mediante iniezione intracerebrale di vettori virali

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Questo protocollo mostra che è possibile generare nuovi neuroni direttamente nel cervello dai glia residenti e che queste cellule riprogrammate maturano in neuroni specifici del sottotipo. Il vantaggio principale è il virus AAV cre-dipendente che consente il targeting specifico del NG2-glia e del reporter GFP che etichetta i neuroni riprogrammati per l'analisi. Generare nuovi neuroni nel cervello può portare allo sviluppo futuro per terapie di sostituzione cellulare nel cervello.Nel nostro protocollo generiamo gli internauri parvalbumina-positivi che hanno implicazioni per i disturbi psichiatrici. La riprogrammazione in vivo può essere applicata ad altre aree cerebrali e circuiti a seconda del fenotipo neuronale e delle condizioni neurologiche che si desidera indirizzare. A dimostrare la procedura saranno Jenny Johansson: una tecnico, Maria Pereira: un'ex dottoranda, e Marcella Birtele: una dottoranda nel nostro laboratorio.Per produrre vettore virale AAV5, seminare cellule HEK293T con mezzo di coltura standard in cinque mastri T175. Quando le celle raggiungono il 50-70% di confluenza, preparare il seguente mix per la trasvezione. In un tubo di centrifuga da 50 millilitri, aggiungere quantità molare uguali di plasmide vettoriale e plasmide aiutante della serie pDG.Aggiungere il buffer Tris-EDTA a un volume finale di 144 microlitri, quindi aggiungere acqua ultrapura per ottenere un volume totale di 1296 microlitri e mescolare. Quindi, aggiungere 144 microlitri di cloruro di calcio molare 2.5 e mescolare. Successivamente, aggiungere immediatamente 1,92 millilitri di HBS alla soluzione di DNA e al vortice.Incubare a temperatura ambiente per esattamente 60 secondi. Successivamente, trasferire la soluzione a 28 millilitri di mezzo di coltura cellulare fresco e mescolare. Sostituire il mezzo nei contenitori con il mezzo contenente miscela di trasvezione.Aspetta tre giorni e trasferisci i media in spreco. Aggiungere cinque millilitri di tampone di raccolta a ciascun pallone, quindi aggiungere altri quattro millilitri di DPBS a ciascun pallone per risciacquare le celle rimanenti e mettere in comune con la soluzione cellulare. Centrifugare le cellule raccolte a 1.000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante e sciogliere il pellet in 15 millilitri di tampone di lisi. Congelare il tubo di centrifuga da 50 millilitri sul ghiaccio secco per 15 minuti e conservare in un congelatore meno 20 gradi Celsius. Prima dell'uso, scongelare il lisato cellulare raccolto in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.In questa procedura, eseguire la purificazione AAV mediante ultracentrifugazione del gradiente iodixanolo e utilizzare tubi del soffitto ultracentrifugo con centrifugazione a 350,000 x g per un'ora e 45 minuti a temperatura ambiente. Per estrarre la fase contenente AAV, inserire una siringa da 10 millilitri con un ago calibro 18 a circa due millimetri sotto il bordo di fase dal 40 al 60% con la smussatura rivolta verso l'alto e ritirarsi. Assicurarsi di fermarsi prima di raggiungere la banda proteica dopo che sono stati estratti da cinque a sei millilitri del vettore virale.Quindi, purificare e concentrare il gradiente di iodixanolo diluito attraverso un filtro di scambio di anione, spingendolo attraverso ad una velocità non più veloce di una goccia al secondo. Successivamente, spingere lentamente tre millilitri di buffer IE attraverso il filtro per lavarlo. Quindi, eludere la miscela in un'unità filtrante centrifuga con uno o due millilitri di tampone di eluizione.Aggiungere DPBS al dispositivo a un volume finale di quattro millilitri. Centrifuga a 2.000 x g a temperatura ambiente fino a quando non vengono lasciati meno di 0,5 millilitri di DPBS nel filtro. Successivamente, rimuovere il liquido dal fondo del tubo, ricaricare con quattro millilitri di DPBS e centrifugare di nuovo.Ripetere questo passaggio altre due volte, assicurarsi che il volume del vettore concentrato sul filtro sia di circa 200 microlitri dopo l'ultima centrifugazione. Rimuovere il vettore concentrato da 200 microliter utilizzando una pipetta e spingerlo attraverso un filtro da 0,22 micrometri per sterilizzarlo. Successivamente, aliquota 200 microlitri in una fiala di vetro con inserto interblocco.Per iniettare fattori di riprogrammazione, posizionare un mouse anestetizzato nel fotogramma stereotassico. Somministrare un'analgesia appropriata all'inizio dell'intervento chirurgico, quindi portare la punta del capillare di vetro dell'ago di iniezione appena sopra il bregma. Assicurarsi che la punta capillare sia perfettamente dritta sia nei piani A-P che M-L.Reimpostate entrambi i valori M-L e A-P su 0,0 nel contatore delle coordinate digitali. Per assicurarsi che la testa dell'animale sia in una posizione perfettamente piatta, utilizzare il contatore delle coordinate digitali per misurare il valore della coordinata D-V quando il braccio A-P è a più 2,0 e meno 2,0, nonché quando il braccio M-L è a più 2,0 e meno 2,0. Regolare di conseguenza l'altezza della barra dei denti e delle barre dell'orecchio.Successivamente, sollevare leggermente la siringa e praticare un foro utilizzando un trapano dentale alle coordinate di iniezione. Inizia a trivellare nel sito, lavorando in modo circolare e delicato. Quindi, posizionare un pezzo di garza di cotone sopra l'incisione aperta e sciacquare la siringa con soluzione salina.Dopo lo sciacquone, redigere una bolla d'aria e quindi un microlitro di soluzione contenente il vettore virale. Assicurarsi che la soluzione virale possa essere facilmente visualizzato sotto la bolla d'aria. Quindi, abbassare la siringa, procedendo lentamente alla profondità desiderata, e assicurarsi che la traiettoria sia libera da frammenti ossei.Successivamente, iniettare un microlitro della soluzione virale ad una velocità di 0,4 microlitri al minuto. Al termine dell'iniezione, lasciare due minuti per la diffusione prima del ritiro della siringa. Dopo la diffusione, ritrarre lentamente la siringa fino a quando la punta del capillare non viene completamente ritirata dal cervello, quindi suturare attentamente l'incisione e rimuovere l'animale dal telaio stereotassico.Monitorare l'animale in una stazione postoperatoria fino a quando la coscienza non viene riconquistata. Gli animali vengono tenuti fino a 12 settimane dopo l'iniezione di virus per consentire alla glia residente di riprogrammarsi in neuroni maturi. Per preparare le fette cerebrali per l'elettrofisiologia usando un vibratoma, sezionare il cervello dalla parte più rostrale fino al livello striato ad alta velocità.Quindi sessò lo striato coronally a 275 micrometri a 0,1 millimetri al secondo. Dopo ogni sezione, rimuovere con cura il lato striato non iniettato e trasferire il lato iniettato in una fiala con una rete inferiore e uno scivolo di senso CREB ossigenato nel bagno d'acqua a temperatura ambiente. Mantenere la fiala a temperatura ambiente fino a quando tutte le sezioni non vengono tagliate.Successivamente, aumentare lentamente la temperatura del bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e lasciarlo per 30 minuti, quindi spegnere il riscaldatore e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Dopo aver trasferito una sezione di tessuto in una camera di registrazione per elettrofisiologia, montare la pipetta di vetro sull'elettrodo di registrazione e abbassarla nella soluzione. Ricontrollare la resistenza dell'elettrodo.Quindi, avvicinarsi lentamente alla cella riprogrammata con la pipetta, mantenendo una leggera pressione positiva nell'elettrodo per evitare di tappare la punta e verificare che la cella sia positiva alla GFP prima dell'applicazione di patch. Quando la cella viene patchata, mantenere la cella nel morsetto di corrente da meno 60 a meno 70 millivolt e iniettare correnti di 500 millisecondi da meno 20 a più 90 picoampere con incrementi di 10 picoampere per indurre potenziali d'azione. Questo è indicativo di una maturazione neuronale e di una riprogrammazione riuscita.Successivamente, passare al morsetto di tensione e misurare il sodio verso l'interno e ritardare la rettifica delle correnti di potassio a fasi depolarizzanti di 10 millivolt. Ecco un neurone riprogrammato riempito di biocitina post registrato che mostra la morfologia neuronale matura e le spine dendritiche. Qui, le registrazioni elettrofisiopatiche dei neuroni riprogrammati mostrano la presenza di connessioni funzionali postinaptiche con misure di attività spontanea.Le tracce mostrano l'attività inibitoria che è bloccata con picrotoxina, un antagonista del recettore GABAA e l'attività eccitatoria che è bloccata con CNQX, un antagonista del recettore AMPA. I neuroni patchati mostrano già attività postsinaptica a cinque settimane dopo l'iniezione e continuano a otto e 12 settimane dopo l'iniezione. Anche il numero di neuroni con attuali potenziali di azione indotta aumenta nel tempo.Un'analisi più dettagliata ha rivelato diversi modelli di cottura distinti in cui la maggior parte delle cellule mostra un'attività di spiking veloce simile agli internauri parvalbumina. L'analisi immunoistochimica a 12 settimane ha ulteriormente mostrato la co-espressione del reporter GFP e della parvalbumina. Seguendo questa procedura è possibile esaminare l'espressione genica con la tecnica del ricerca di patch o valutare la connettività sinaptica tridimensionale con tracciamento monosinaptico e iDISCO.Ora che è possibile riprogrammare glia residenti in parvalbumina esprimendo internauri, abbiamo iniziato a indagare se questi sono autentici e possono essere utilizzati come strumento terapeutico. Ricordarsi di seguire i protocolli e le linee guida stabiliti quando si maneggiano animali e si utilizza il virus AAV.

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