Name: Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Impara a generare culture primarie di melanociti e fibroblasti murini dalla pelle di topi neonati. Questo metodo rapido facilita lo studio della biologia cellulare cutanea, della pigmentazione e della cicatrizzazione.

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Gli autori ringraziano la Damon Runyon Foundation (Innovation Award #38-16 a C.E.B.) e Pelotonia (B.M.M.) per il sostegno finanziario. Siamo grati a C. Haines e C. Wormsbaecher che hanno fornito commenti per migliorare il testo del manoscritto. Questo lavoro ha beneficiato della risorsa condivisa Cytometry analitica dell'Ohio State Comprehensive Cancer Center, supportata da NIH P30 CA016058.

Ottenere l'approvazione dal comitato istituzionale per l'etica degli animali prima di iniziare questo o qualsiasi altro studio sugli animali. Gli esperimenti condotti in questo protocollo sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protocollo #2012A00000134) della Ohio State University.
1. Preparazione del protocollo
 NOT:</</c0> Le seguenti istruzioni di preparazione del reagente sono appropriate per la generazione di colture di 9 cm2 melanociti e fibroblastda da un singolo topo. Fare riferimento alla guida alla preparazione dei reagenti nella Tabella 1 per gli isolamenti su scala più ampia.
<ol><li>Preparare 1,5 mL di soluzione di collagene che contiene 50 g/mL di collagene in acido acetico glaciale da 0,1 m.</li>
	<li>In un armadio a flusso laminare, ricoprite un pozzo di un piatto di coltura a 6 pozze mobili con 8 g/cm2 (1,44 mL) Di collagene. Assicurarsi che il pozzo sia completamente coperto dalla soluzione di collagene. Incubare il piatto a 37 gradi centigradi per 3 h o a 4 gradi durante la notte. Prima dell'uso, lavare il collagene rivestito bene due volte con 1,35 mL di fosfato sterile tampinato salina (PBS) (150 - L di PBS per 1 cm2).</li>
	<li>Assemblare l'elicottero dei tessuti in un armadio a flusso laminare posizionando con attenzione un disco di taglio sulla piattaforma dell'elicottero dei tessuti e fissando una lama sterile al braccio mobile.</li>
	<li>Preparare 3 mL di 1x Antibiotic/Antimycotic Solution diluendo 100x soluzione di riserva antibiotico/antimiocotico in PBS sterile.</li>
	<li>Preparare 3 mL di fresco Skin Digestion Buffer contenente 10% siero bovino fetale, 1% penicillin/streptomycin soluzione, 1% L-glutamina, 10 mg/mL collagenase tipo I, 0.25% porcine trypsin e 0.02 mg/mL deoxyribonuclelease I in RPMI 1640.</li>
	<li>Preparare 6 mL di Melanocite Media fresco contenente il 10% di siero bovino fetale, 7% siero di cavallo, 1% penicillina/streptomycin soluzione, 1% L-glutamina, 0,5 mM di-butyryl cyclic AMP (dbcAMP), 20 nM tetradecanoylphorbol 13 acetati (TPA) e 200 pM cholera tossina (CT) in Nutrient Mix F-12 Supporti di Ham. NOT:</</c2> Le soluzioni di stock concentrate dbcAMP, TPA e CT possono essere realizzate, rivestite e conservate per >1 anno a -80 gradi centigradi. I supporti di base privi di questi componenti possono essere conservati per un massimo di 1 mese a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 4 mL di Fibroblast Media contenente il 10% di siero bovino fetale, l'1% di penicillina/streptomicina e l'1% di L-glutamina nel mezzo aquila modificato di Dulbecco. Questo supporto può essere conservato a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.</li>
	<li>Preparare 40 mL del 4% di soluzione di paraformaldeide diluindo il 16% di paraformaldeide in PBS. Conservare l'eccesso a 4 gradi centigradi per 1 mese o -20 gradi centigradi per un massimo di 1 anno.</li>
	<li>Preparare una soluzione di scorta di saponin a 1% mescolando 0,5 g di saponina in 50 mL di PBS a 37 gradi centigradi fino a quando la saponina non si è completamente sciolta. Sterilizzare la soluzione per lo stoccaggio a lungo termine utilizzando una siringa da 50 mL dotata di un filtro PES da 0,2 m. La soluzione di riserva di saponin risultante può essere mantenuta a 4 gradi centigradi per 1 mese.</li>
	<li>Preparare in PBS una soluzione Saponin pari allo 0,1% dello 0,1% di Saponin mediante il diluizione di una soluzione di stock di saponin dell'1% in PBS contenente il 3% di albumina del siero bovino (BSA).</li>
	<li>Preparare la soluzione di 1 mL di fattibilità diluindo 1 ll di tintura di vitalità fissabile in 1 mL di PBS.</li>
</ol>2. Isolamento melanocito e fibroblasto
<ol><li>Eutanasia da 0 a 4 giorni maschi e/o femmine C57Bl/6J cuccioli di decapitazione e rimuovere le estremità dai topi eutanasia utilizzando forbici chirurgiche.</li>
	<li>In un armadio a flusso laminare, rotolare brevemente il tronco di ogni topo in una parabola Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Togliere il tronco dall'etanolo e metterlo in un piatto Petri vuoto e sterile.</li>
	<li>Utilizzando forbici chirurgiche, sterilizzate nel 70% di etanolo, fare un'incisione nella pelle sul lato ventrale del tronco a partire dal collo alla coda. Sbucciare la pelle dal tronco del topo utilizzando pinze sterili.</li>
	<li>Mettere il derma della pelle in un piatto a 6 pozze contenente 3 mL di 1x Soluzione antibiotica / antimicotica e incubare a temperatura ambiente per 2-3 min.</li>
	<li>Accendere l'elicottero di tessuto con le seguenti impostazioni in posizione: spessore Slice: 1 m; Forza lama: il 60% del massimo; Velocità: 50% del massimo.</li>
	<li>Trasferire la pelle, derma lato verso il basso, su un disco di taglio di tessuto sterile e passare la pelle completamente attraverso l'elicottero di tessuto attivato 3 volte.</li>
	<li>Trasferire la pelle omogeneizzata su un tubo conico sterile da 15 mL contenente 3 mL di buffer per la digestione della pelle. Mescolare la sospensione risultante convogliando su e giù 10-15 volte con una micropipetta P1000.</li>
	<li>Far fronte al tubo conico e incubare il campione in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi per 15 min, invertendo il tubo ogni 3-5 min.</li>
	<li>Pellet le cellule nella pelle omogenea centrifusando il tubo conico in un rotore secchio oscillante a 750 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando una micropipetta P1000, rimuovere lentamente e completamente il buffer di digestione della pelle facendo attenzione a non disturbare il pellet. NOT:</</c1> Una porzione di pelle intera può essere salvata in questa fase e utilizzata come controllo per la Fase 3: Conferma della purezza cellulare. Filtrare queste cellule attraverso un colino cellulare di 70 m e quindi iniziare al passaggio 3.5 per un'ulteriore elaborazione.</li>
	<li>Risospendere accuratamente il pellet cellulare in 1 mL di Melanocyte Media pipetting su e giù 15-20 volte con una micropipetta P1000. Aggiungere la soluzione cellulare risultante dropwise a un pozzo non rivestito di un piatto di 6 pozze contenente 1 mL di Melanocite Media.</li>
	<li>Collocare l'omogenea della pelle placcata in un'incubatrice di coltura tissutale impostata a 37 e 5% di CO2. Lasciare che le colture incubano per 40 min. NOT:</</c3> Durante questo periodo, alcuni fibroblasti nella pelle omogenea aderiscono al piatto non rivestito mentre i melanociti e i cheratinociti rimangono in sospensione.</li>
	<li>Trasferire la coltura supernatante dal piatto non rivestito a un pozzo di un piatto pre-lavato e rivestito di collagene 6 pozzetti. Aggiungere G418 al supporto in modo che la concentrazione finale sia 100 ng/mL.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di Fibroblast Media in un pozzo del piatto non rivestito, ora contenente fibroblasti aderenti.</li>
	<li>Incubare entrambe le colture durante la notte in un'incubatrice di coltura tissutale fissata a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.</li>
	<li>Separatamente aspirare i media e gli eventuali detriti da ogni coltura, 16-24 h dopo la placcatura. Lavare ogni piatto due volte con 1 mL di PBS sterile, quindi aggiungere 2 mL di Melanocyte Media fresco più 100 ng/mL G418 alla coltura melanocite e 2 mL di supporti fibroblasti freschi alla coltura fibroblasta.</li>
	<li>Dopo che le colture melanocite sono state trattate con G418 per 48 h, lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS sterile e aggiungere 2 mL di Melanocyte Media fresco senza G418 alla coltura. NOT:</</c5> Poiché i fibroblasti nella coltura melanocite continuano a morire durante il trattamento post-G418, lavare il piatto con PBS sterile per rimuovere le cellule morte e aggiungere supporti melanociti freschi. Le colture di melanociti e fibroblasti devono essere accompagnate quando raggiungono il 70-80% di confluenza.</li>
</ol>3. Conferma della purezza cellulare
<ol><li>Aspirare i mezzi di comunicazione di ogni coltura e lavare con cura ogni piatto con 1 mL di PBS sterile.</li>
	<li>Aggiungete 0,7 mL dello 0,25% di trypsin a ogni coltura e incubate le colture in trypsin a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 1 min.</li>
	<li>Spostare le cellule convogliando la trypsin sul fondo del piatto utilizzando una micropipetta P1000.</li>
	<li>Aggiungere 0,7 mL del supporto appropriato a ogni coltura orpinizzata e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Pellet le cellule per centrifugazione a 750 x g per 2 min a temperatura ambiente. Rimuovere e scartare con cura il supernatante utilizzando una micropipetta P1000. NOT:</</c2> I passaggi da 3.1-3.5 possono essere utilizzati per passare le colture melanociti e fibroblaste. Il pellet risultante deve essere risospeso nel supporto appropriato e collocato in un nuovo piatto non rivestito (fibroblasti) o pre-lavato, rivestito di collagene (melanociti).</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 0,5 mL di PBS ghiacciato.</li>
	<li>Enumerare e trasferire 0,5 milioni di cellule in un tubo di microcentrifuga pre-raffreddato da 1,5 mL.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5 e quindi risospendere nuovamente le celle in 100 gradi l di soluzione di fattibilità. Incubare la sospensione cellulare per 30 min a 4 gradi centigradi al buio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3,5 a 3,6 due volte.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5, quindi fissare le cellule rispendendo il pellet in 100 - L di ghiaccio freddo 4% Soluzione di paraformaldeide. Incubare la sospensione per 15 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5 due volte, ogni volta ripartendo il pellet in 0,5 mL del 3% BSA in 1x PBS.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare a 100 gradi L di 0,1% Soluzione Saponin. Incubare la sospensione per 15 min a temperatura ambiente al buio.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare in 100 .L di 0,1% Soluzione Saponin contenente 0,5 g di anticorpo anti-gp100 di coniglio, 0,5 g di anticorpo anti-fibroblasto del coniglio 1 (FSP1) e 0,025 g di anti-Cytokeratin 14 (K14) anticorpo. Incubare la sospensione per 1 h a temperatura ambiente al buio. NOT:</</c3> Mentre l'anticorpo K14 fu acquistato pre-coniugato ad Alexa Fluor 647, gli anticorpi gp100 e FSP1 furono coniugati rispettivamente agli anticorpi CF 555 e CF 488. Anche la colorazione delle popolazioni di controllo dovrebbe iniziare in questa fase. Le popolazioni di cellule di controllo devono essere isolate dalle colture ed elaborate come descritto nei passaggi 3.5-3.12.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.11 due volte per rimuovere qualsiasi anticorpo non associato.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3.5, quindi risospendere il pellet cellulare in 200-400 - L del 3% di BSA in 1x PBS.</li>
	<li>Passare la soluzione cellulare attraverso un colino di 40 m in un tubo rotondo-inferiore in polistirolo da 5 mL e analizzare le cellule tese per citometria di flusso.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

La cultura in vitro dei melanociti primari e dei fibroblasti ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia e della malattia della pelle. Questo protocollo migliora i precedenti metodi di isolamento dei melanociti riducendo il tempo e l'esperto tecnico necessari per generare colture di melanociti coerenti, consentendo al contempo l'isolamento simultaneo dei fibroblasti cutanei. Un nuovo elemento che consente di risparmiare tempo di questa procedura è che il dermide e l'epidermide non hanno ...

La pelle di mammifero è un organo multistrato che protegge il corpo da patogeni estranei e irradiazione ultravioletta (UVR). La pelle svolge anche un ruolo fondamentale nei processi omeostatici come la guarigione delle ferite, la regolazione della temperatura e la produzione di vitamina D1,2,3. La pelle di mammaliana è costituita da tre tipi principali di cellule: melanociti, fibroblasti e cheratinociti. Questi tipi di cellule popolano diversi strati della pelle, con cheratinociti che compongono l'epidermide, fibroblasti che risiedono nel derma e melanociti che si localizzano alla giunzione epidermal-dermica e follicoli piliferi4. Qui, dettagliamo una semplice procedura che consente la generazione simultanea di colture primarie di melanociti e fibroblasti dalla pelle murina.
I melanociti sono cellule che producono pigmenti che si trovano in molte posizioni in tutto il corpo umano, tra cui l'epidermide basale, l'iride, la coclea, il cervello e i follicoli piliferi5. La funzione principale dei melanociti è quella di generare e secernere vesciche contenenti melanina chiamate melanosomi5,6. I melanosomi contengono due classi principali di melanina: eumelanina marrone/nera e feomelanina giallo/rosso6,7. I processi biochimici all'interno del melanocito regolano l'abbondanza relativa di ogni specie di melanina e aiutano a determinare il colore dei capelli, della pelle e degli occhi8,9. La melanina serve anche ad assorbire UVR e proteggere i tessuti esposti al sole dalla mutagenesi10.
La disfunzione melanocite può causare difetti pigmentari e aumentare la suscettibilità al cancro della pelle. Ad esempio, le macchie di pelle iperpigmentate caratteristiche del melasma sono il risultato della sovrapproduzione di melanina focale, mentre le mutazioni genetiche germinali che compromettono i geni coinvolti nella sintesi della melanina portano all'albinismo11,12 . La conoscenza intima della biologia del melanocite è necessaria per sviluppare strategie che correggano tali difetti pigmentari e, in ultima analisi, migliorino il benessere psicosociale degli individui afflitti da queste malattie. I deficit nella produzione di melanina e/o la sintesi preferenziale della feomelanina sono anche associati con un aumento del rischio di cancro della pelle10. Si ritiene che questo rischio risulti deriva dalla protezione UVR ridotta6,13. Così, metodi per migliorare o ripristinare la produzione di eumelanina in melanociti possono ridurre l'incidenza del cancro della pelle in queste popolazioni.
I fibroblasti mesenchymi stabiliscono il tessuto connettivo e il supporto strutturale per tutti gli organi del corpo, compreso lo strato dermico della pelle14. L'escrezione di proteine come collagene, elastina, laminina e fibronectina consentono ai fibroblasti di formare la matrice extracellulare (ECM) che è essenziale per l'integrità del tessuto1,14. I fibroblasti svolgono anche un ruolo essenziale in processi come la guarigione delle ferite, l'infiammazione, l'angiogenesi e la formazione/progressione del cancro1,15,16.
Simile ai melanociti, i difetti nell'attivazione e nella funzione del fibroblasto possono promuovere la tumorigenesi e la malattia. Ad esempio, l'attivazione inappropriata del fibroblasto porta comunemente alla formazione di fibrosi, risultante dalla maggiore deposizione di componenti ECM in eccesso nel tessuto circostante. Come fibroblasti mantengono gran parte dell'integrità strutturale del corpo, fibrosi promuove malattie che colpiscono numerosi tessuti e organi, tra cui fibrosi polmonare idiopatica, sclerosi sistemica, cirrosi epatica e fibrosi cardiaca15. I fibroblasti svolgono anche un ruolo fondamentale nel cancro16. I fibroblasti associati al cancro (CAF) sono le cellule non maligne più abbondanti nel microambiente di molti tumori. I CAF hanno dimostrato di promuovere la proliferazione tumorale, la progressione e la resistenza terapeutica modulando la rigidità dei tessuti, la produzione di citochine locali e la funzione immunitaria16.
Le colture cellulari primarie forniscono ai ricercatori modelli geneticamente trattabili per identificare e mitigare i difetti del melanocito e del fibroblasto che portano alla malattia. Tuttavia, gli attuali metodi per stabilire le culture melanocite richiedono molto tempo e sono tecnicamente impegnativi. La necessità di provare e la delicata separazione dell'epidermide e del dermide contribuisce alla variabilità nella resa sperimentale e rende difficile eseguire esperimenti su larga scala. Inoltre, attualmente mancano protocolli per isolare simultaneamente melanociti e fibroblasti da tutta la pelle.
Abbiamo sviluppato un metodo per ridurre le fasi di lavorazione, la variabilità e il tempo necessario per stabilire le colture di melanociti e fibroblasti dallo stesso campione di pelle intero. Utilizzando un metodo di omogeneizzazione meccanica seguito da una breve digestione, la nostra strategia riduce significativamente la quantità di tempo pratico necessario per isolare i melanociti primari consentendo l'isolamento simultaneo del fibroblasto. L'aumento della velocità, dell'efficienza e della coerenza di questo protocollo, in combinazione con la capacità di isolare i melanociti dai topi vecchi di 0-4 giorni, offre ai ricercatori la flessibilità necessaria per eseguire una gamma più ampia di esperimenti rispetto a prima possibile.

<table><tbody><tr><td>0,2 &micro; m Filtro per siringa sterile in PES</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari da 10 cm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>40 &; filtro cellulare</td><td>m Fisher Scientific 22363547</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL in polistirene provette a fondo tondo</td><td>Fisher Scientific 352008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piatto per coltura cellulare a 6 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIAL0516</td><td></td></tr><tr><td>70 &; filtro per cellule m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione antimicotica antibiotica (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>CF 488A Kit di marcatura degli anticorpi Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92273</td><td></td></tr><tr><td>CF 555 Kit di etichettatura degli anticorpi Mix-n-Stain</td><td>Biotium</td><td>92274</td><td></td></tr><tr><td>Tossina del colera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>Collagene dalla coda di ratto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi di tipo I</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS004156</td><td></td></tr><tr><td>Corning Soluzione di penicillina/streptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>30-002-CL</td><td></td></tr><tr><td>Citocheratina 14 Anticorpo Alexa Fluor 647</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-34403AF647</td><td></td></tr><tr><td>Deossiribonucleasi I</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>LS002058</td><td></td></tr><tr><td>Di-butirril ciclico AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td><td>Thermo Fisher</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>22032601</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>FSP1 / S100A4 anticorpo</td><td>Millipore Sigma</td><td>07-2274</td><td></td></tr><tr><td>G418 Disolfuro</td><td>P212121</td><td>LGB-418-1</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>VWR</td><td>VWRV0714</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>HyClone L-Glutammina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003402</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Ted Pella</td><td>10180</td><td></td></tr><tr><td>Melanoma gp100 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab137078</td><td></td></tr><tr><td>Miscela di nutrienti F-12 Ham's Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6760</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristate 13-acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% Formaldeide</td><td>Thermo Fisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85450C</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-7900</td><td></td></tr><tr><td>Lama tritatessuti</td><td>Ted Pella</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Tritatutto in plastica Ted</td><td>Pella</td><td>10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>VWRL0154-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione rapida delle culture primarie di murine melanocite e fibroblast

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

I difetti nella funzione fibroblasta o melanocite sono associati a malattie della pelle, tra cui scarsa funzione di barriera, guarigione difettosa delle ferite, difetti di pigmentazione e cancro. Vitali per la comprensione e il miglioramento di queste malattie sono esperimenti nelle colture primarie di fibroblasto e melanociti. Tuttavia, i protocolli attuali per l'isolamento del melanocite richiedono che gli strati epidermici e dermici della pelle siano trypsinizzati e dissociati manualmente. Questo processo richiede molto tempo, è tecnicamente impegnativo e contribuisce a rendimenti incoerenti. Inoltre, i metodi per generare simultaneamente colture fibroblaste pure dallo stesso campione di tessuto non sono prontamente disponibili. Qui, descriviamo un protocollo migliorato per isolare melanociti e fibroblasti dalla pelle dei topi nei giorni postnatali 0-4. In questo protocollo, tutta la pelle viene omogeneizzata meccanicamente utilizzando un chopper di tessuto e poi brevemente digerita con collagenae e trypsina. Le popolazioni cellulari vengono poi isolate attraverso la placcatura selettiva seguita dal trattamento G418. Questa procedura si traduce in rendimenti costante di melanocite e fibroblasto da un singolo topo in meno di 90 min. Questo protocollo è anche facilmente scalabile, consentendo ai ricercatori di elaborare grandi coorti di animali senza un aumento significativo dei tempi pratici. Dimostriamo attraverso le valutazioni citometriche di flusso che le colture stabilite utilizzando questo protocollo sono altamente arricchite per melanociti o fibroblasti.

I topi Maschi e Femmine C57Bl/6J sono stati eutanasiati nei giorni postnatali 0-4 e la pelle tronica è stata sottoposta a dissociazione meccanica come descritto sopra. Dopo il taglio, la pelle formava un liquame viscoso privo di qualsiasi segno di tessuto strutturale. La centrifugazione di questo liquame ha portato alla formazione di un grande pellet cellulare nella parte inferiore del tubo conico e di uno strato di adiposo galleggiante sulla parte superiore del supernatante. Questo strato adiposo è stato scartato con il...

Questo protocollo delinea un metodo rapido per generare simultaneamente colture di melanociti e fibroblasti dalla pelle di topi di 0-4 giorni. Queste colture primarie possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare una varietà di processi fisiologicamente rilevanti, tra cui biologia cellulare della pelle, pigmentazione, guarigione delle ferite e melanoma.

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Questo protocollo descrive un metodo rapido e semplice per generare colture primarie di melanociti e fibroblasti dai topi. Poiché questa tecnica non richiede che l'epidermide e il derma siano separati, può essere eseguita in modo rapido e coerente con un allenamento minimo. Questo metodo può essere utilizzato per studiare la biologia dei melanociti cutanei e dei fibroblasti.Gli esperimenti in queste culture possono fornire informazioni rilevanti per il cancro, la guarigione delle ferite e i difetti di pigmentazione. Prima di iniziare, assicurarsi di preparare tutti i reagenti necessari e controllare la temperatura del bagno d'acqua. Se si prevede di elaborare più campioni, fare riferimento alla guida al ridimensionamento dei reagenti nella tabella uno.A dimostrare questa procedura sarà Brandon Murphy, uno studente laureato del mio laboratorio. In un armadio a flusso laminare, arrotolare brevemente il tronco di ogni topo eutanasiato in una piastra di Petri sterile contenente il 70% di etanolo. Rimuovere il topo dall'etanolo e posizionarelo in una piastra di Petri sterile vuota.Successivamente, sterilizzare le forbici chirurgiche con il 70% di etanolo. Usa queste forbici per fare un'

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Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Questo articolo descrive un protocollo per l'isolamento e il mantenimento delle colture primarie di fibroblasti della pelle e tessuto polmonare dei roditori selvatici.

Stabilire colture primarie di fibroblasti adulti dai roditori

In questo protocollo, w e identificato una popolazione romanzo di cellule melanociti-simile (anche conosciuto come melanociti cardiaci) nel cuore dei topi e gli esseri umani che contribuiscono ad aritmia atriale provoca nei topi.

Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

Questo video descrive il metodo rapido per isolare e coltivare contemporaneamente i melanociti e i fibroblasti dalla pelle del cucciolo di topo postnatale. Queste cellule possono essere mantenute e manipolate in vitro per studiare la biologia delle cellule della pelle, la guarigione delle ferite e il melanoma.

Coltura rapida di melanociti murini primari e fibroblasti: isolamento di melanociti e fibroblasti da un campione di pelle intera murina

Descriviamo la dissezione e ex vivo della cultura di topo pelle embrionale. Il sistema di coltura mantiene un'interfaccia aria-liquido attraverso la superficie del tessuto e permette l'imaging su un microscopio invertito. Melanoblasts, un componente della pelle in via di sviluppo, sono fluorescente permettendo loro comportamento da osservare mediante microscopia confocale.

Ex vivo Cultura embrionali di topo della pelle e live-imaging delle Migrazioni Melanoblast

Descriviamo una procedura sperimentale semplice e rapido per la generazione di fibroblasti primari dalle orecchie e le code di topi. La procedura non richiede addestramento speciale animali e può essere utilizzato per la generazione di colture di fibroblasti da spighe conservati a temperatura ambiente per 10 giorni.

Generazione di primaria fibroblasti culture da orecchio e coda tessuti di topo

Questo lavoro descrive un protocollo in vitro la differenziazione di produrre pigmentate, i melanociti maturi da cellule staminali pluripotenti umane tramite una cresta neurale e melanoblast fase intermedia utilizzando un protocollo senza alimentatore 25 giorni.

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle 3D organotipiche melanoma sferoide che ricapitola sia l'architettura e pluricellulari complessità di un organo/del tumore in vivo ma allo stesso tempo accomoda sistematica sperimentale intervento.

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Presentiamo un protocollo per isolare i fibroblasti adulti primari in modo semplice, veloce e affidabile, performabile dai principianti (ad esempio, gli studenti). La procedura combina la digestione del tessuto enzimatico e l'agitazione meccanica con onde ultrasoniche per ottenere fibroblasti primari. Il protocollo può essere facilmente adattato a specifiche esigenze sperimentali (ad esempio, tessuto umano).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Viene stabilito un nuovo modello di sferoide tridimensionale basato sull'interazione eterotipica delle cellule tumorali e dei fibroblasti stromali. Qui, presentiamo la cocoltura di cellule tumorali e fibroblasti stromali, imaging time-lapse, e microscopia confocale per visualizzare la formazione di sferoidi. Questo modello tridimensionale offre una piattaforma pertinente per studiare le interazioni tumora-stroma e testare le terapie antitumorali.

Un nuovo modello di spheroid del tumore strutturato in 3D modulato come fibromastro per studiare l'interazione tumora-stroma e la scoperta di farmaci

Questo documento riporta che l'aggiunta di Y-27632 al mezzo TIVA può aumentare significativamente la resa dei melanociti dai tessuti della pelle adulti.

Y-27632 arricchisce la resa dei melanociti umani dai tessuti della pelle adulta

Qui descriviamo un sistema di riprogrammazione diretta ottimizzato per i melanociti e un sistema di confezionamento dei virus concentrato ad alta efficienza che garantisce una riprogrammazione diretta senza intoppi.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti di topo in melanociti

Impara a generare culture primarie di melanociti e fibroblasti murini dalla pelle di topi neonati. Questo metodo rapido facilita lo studio della biologia cellulare cutanea, della pigmentazione e della cicatrizzazione.

Generazione rapida delle culture primarie di Murine Melanocite e Fibroblast

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