Un modello avanzato di murine per la steatoepatite non alcolica in associazione con il diabete di tipo 2

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande nel campo dell'immunometabolismo sul contributo delle cellule immunitarie all'infiammazione indotta dall'obesità nell'adiposo e nella steatoepatite nel tessuto epatico. Queste tecniche sono state ottimizzate per l'isolamento delle cellule immunitarie adipose ed epatiche in un modello indotto dalla dieta di steatoepatite analcolica ottenuta attraverso un alloggiamento non specifico dei roditori privo di agenti patogeni. Questi metodi possono aiutare ad approfondire la nostra comprensione dei meccanismi immunologici coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi metabolica.

Generalmente, gli individui nuovi a questa tecnica faranno fatica a massimizzare la resa delle cellule dissociate funzionalmente vitali e a impostare la corretta ghiandolazione nella citometria del flusso. Per generare una sospensione monoscicolare del tessuto adiposo, spruzzare il torace di un topo eutanasiato con il 70% di etanolo e fare con cura un'incisione centrale da cinque a sei centimetri attraverso il tegumento e la parete addominale lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica e il cuore. Utilizzando un ago calibro 26, iniettare almeno 10 millilitri di soluzione salina allo 0,9% nell'apice del ventricolo sinistro e utilizzare le forbici per aprire la cavità peritoneale.

Quindi, sezionare il tessuto adiposo epigonadale e pesarlo. Dissociare meccanicamente il tessuto adiposo in pezzi fini in una piastra di Petri a quattro gradi Celsius prima di trasferire i frammenti di tessuto in un tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare la piastra di Petri con un millilitro dello 0,5% di albumina siere bovina, o BSA, in PBS, e aggiungere tre millilitri di soluzione di digestione dei tessuti adiposi appena preparata per grammo di tessuto adiposo al tubo.

Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto, aggiungere cinque millilitri dello 0,5%BSA in PBS e posizionare il digest adiposo sul ghiaccio. Triturare la soluzione più volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri e utilizzare uno stantuffo per passare la soluzione attraverso un colino da 100 micrometri. Separare le frazioni tissutali per centrifugazione e utilizzare una pipetta per scartare la frazione adipocite galleggiante.

Rimescolare il pellet cellulare della frazione vascolare stromale in un millilitro di ammonio-cloruro-potassio, o ACK, tampone dilisi, fermando la reazione dilisi con 10 millilitri di siero di vitello fetale al 2%, o FCS, in PBS dopo pochi secondi. Quindi, raccogliere i globuli bianchi isolati per centrifugazione e rimosogliere il pellet in 250 microlitri del 2%FCS in PBS per il conteggio. Raccogliere il fegato in un tubo conico di PBS sul ghiaccio prima di usare i timbri delle siringhe per dissociare meccanicamente il tessuto in una piastra di Petri a quattro gradi Celsius.

Trasferire i frammenti di tessuto epatico sezionati in un tubo da 50 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione calda di digestione del fegato e sciacquare la piastra di Petri con tre millilitri di soluzione di digestione del fegato fresco. Dopo 20 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto, interrompere la digestione con 20 millilitri di HBSS e triturare il liquame tissutale più volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri. Utilizzare uno stantuffo per passare la soluzione tissutale attraverso un colino di 100 micrometri e raccogliere le cellule del fegato mediante centrifugazione.

Rimorsi il pellet in 20 millilitri di HBSS fresco e rimuovere la matrice di epatociti mediante centrifugazione. Raccogliere il supernatante per la centrifugazione, rimescolando il pellet in 10 millilitri di soluzione media gradiente di densità di viscosità bassa del 33% in HBSS. Separare le cellule immunitarie del fegato per centrifugazione gradiente di densità e rimescolare il pellet di leucocitario in un millilitro del tampone di lisi ACK.

Dopo quattro minuti a temperatura ambiente, interrompere lalisi con 10 millilitri di HBSS e filtrare le cellule attraverso un colino poro di 30 micrometri in un tubo da 15 millilitri per la centrifugazione. Quindi, rimospensì il pellet in 250 microlitri del 2%FCS in PBS per il conteggio. Per l'analisi citometrica del flusso delle popolazioni isolate di leucociti, aggiungere fino a tre volte 10 alle sei cellule in 100 microlitri del 2%FCS in PBS dal tessuto di interesse in singoli tubi di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza in polistirolo, o FACS.

Aggiungere 10 microlitri di anticorpo anti-CD16/CD32 a ciascun tubo per bloccare qualsiasi legame non specifico per 10 minuti sul ghiaccio, seguito dalla colorazione con il volume appropriato di miscela di anticorpi e da un microlitro di colorante di vitalità per campione per consentire la discriminazione delle cellule vive e morte. Dopo 20 minuti a quattro gradi Celsius protetti dalla luce, lavare i campioni due volte con due millilitri di 2%FCS più PBS per lavaggio e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Quindi, resuspend il pellet in PBS fresco più FCS.

Per analizzare le cellule per citometria di flusso, utilizzare un campione di controllo negativo non macchiato per impostare la dispersione avanti e laterale e regolare le tensioni del citometro di flusso per rilevare la popolazione di leucociti vitale ed escludere i detriti. Successivamente, eseguire singoli campioni di controllo macchiati per la compensazione multicolore prima di eseguire i campioni sperimentali, raccogliendo almeno cinque volte 10 ai quattro eventi per tubo. Quindi, esportare i file di dati FCS per l'analisi e impostare la strategia di gating per i leucociti positivi al CD45 per consentire l'identificazione delle successive popolazioni di cellule immunitarie di interesse.

Qui viene mostrata una strategia rappresentativa di gating per le sottopopolazioni di cellule T, tra cui la discriminazione del doppietto e la colorazione della vitalità nel grasso perigonadale murino. I leucociti positivi ai CD45 vengono prima gated per CD4 e CD8 e successivamente per il ligando CD44 e CD62 per discriminare tra ingenua memoria centrale, memoria effettore e cellule T dell'effettore. Le cellule cd44-positive sono quindi ulteriormente caratterizzate con CD127, recettore killer simile alla lettalina a cellule G1 e morte programmata-1.

Qui viene mostrata la strategia di gating per l'analisi di cellule B, granulociti, cellule killer naturali, macrofagi e cellule dendritiche. Una percentuale più elevata di cellule CD4-positive e CD8-positive della memoria effettore può essere rilevata in topi dietetici ad alto contenuto di grassi ospitati in condizioni non SPF, mentre le cellule T ingenue intraepatiche CD4-positive e CD8-positive sono considerevolmente più basse in questi animali rispetto ai topi dietetici ad alto contenuto di grassi SPF alla settima settimana. Steatosi grave, tra cui un aumento di grandi goccioline lipidiche con conseguente steatosi macrovesicolare, infiammazione lobulare, palloncino epatocellulare e struttura lobulare distrutta si trova nella dieta ricca di grassi topi esposti mentre solo alcuni topi SPF mostrano un lieve accumulo di grasso nel fegato.

Inoltre, la percentuale di cellule killer naturali è più alta nel tessuto adiposo perigonadale dei topi esposti alla dieta ad alto contenuto di grassi, mentre i topi SPF a dieta ad alto contenuto di grassi hanno dimostrato percentuali più elevate di cellule dendritiche. Quando si tenta questa procedura, è importante mantenere le cellule sul ghiaccio e al buio se non diversamente indicato. Ora dovresti avere una buona comprensione di come preparare correttamente le sospensioni uni-cellule e come isolare l'adiposo murino e il tessuto epatico per gli esperimenti di citometria a flusso.