Name: Inattivazione chimica dellE3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Scopri la sintesi di un homo-PROTAC bifunzionale basato su pomalidomide per indurre la degradazione della ligasi E3 ubiquitina Cereblon. Questo metodo innovativo permette di studiare meccanismi molecolari e funzioni fisiologiche di CRBN.

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Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (Programma Emmy-Noether Kr-3886/2-1 e SFB-1074 a J.K.; DA FOR2372 a M.G.)

1. Preparazione di molecole PROTAC
AVVISO: consultare tutte le schede tecniche di sicurezza dei materiali pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Molte delle sostanze chimiche utilizzate in queste sintetisi sono tossiche e cancerogene. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e le attrezzature di protezione personale.
<ol><li>Preparazione del carbamate tert-butyl N-(2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composto 1)
	<ol>
<li>Aggiungere 1,1'-carbonyldiimidazole (1,95 g, 12 mmol) e una quantità catalitica di 4-(dimethylamino)pyridine (5 mg) a una miscela di Boc-Gln-OH (2,46 g, 10 mmol) in THF (50 mL) in 100 mL toder tostante in pallone da stiro con una barra di stir. Riscaldare a reflusso per 10 h mescolando fino a quando non si forma una soluzione chiara.</li>
		<li>Rimuovere il solvente a pressione ridotta con un evaporatore rotante, aggiungere EtOAc (200 mL) e trasferirlo in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con H2O (50 mL) e salamoia (50 mL) e asciugarlo su 52SO4.</li>
		<li>Filtrare la soluzione attraverso un breve cuscinetto di gel di silice (5 cm di diametro e 5 cm di altezza) ed eludere con un ulteriore volume (200 mL) di EtOAc.</li>
		<li>Evaporare il solvente e asciugare il solido incolore ottenuto in vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del carbamate tert-butyl N-(1-metil-2,6-dioxo-3-piperidyl)carbamate (composto 2)
	<ol>
<li>Unire composto 1 (2,28 g, 10 mmol) con carbonato di potassio macinato (2,76 g, 20 mmol) e DMF (25 mL) in un pallone rotondo rotondo da 100 mL. Aggiungere iodometano (1,42 g, 0,62 mL, 10 mmol) gocciolante utilizzando una siringa ed equipaggiare il pallone con un setto di gomma forato. Posizionare il vaso di reazione in un bagno di ultrasuoni per 2 h.</li>
		<li>Diluire la miscela di reazione con EtOAc (100 mL) e trasferirla in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con 1 N NaOH (2x 25 mL), H2O (25 mL) e salamoia (25 mL) e asciugarlo su Na2SO4.</li>
		<li>Filtrare ed far evaporare il solvente. Purificare il prodotto per cromatografia a colonna su gel di silice (6 cm di diametro della colonna e 20 cm di altezza) utilizzando etere di petrolio/EtOAc (2:1).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-fluoroisoindoline-1,3-dione (composto 3)
	<ol>
<li>Combinare 3 acridride fluorofalico (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 1 (1,14 g, 5 mmol) e una soluzione di acetato di sodio (0,50 g, 6,0 mmol) in acido acetico glaciale (20 mL) in un fiascheggiante rotondo da 50 mL con una barra di stir e dotato di un condensatore di reflusso. Riscaldare il composto a 120 gradi centigradi per 6 h.</li>
		<li>Dopo il raffreddamento, versare la miscela viola su H2O (100 mL) e mescolare per 10 min. Raccogliere il solido formato per filtrazione, lavare con H2O (3 x 5 mL) e l'etere petrolifero (3 x 5 mL) e asciugare in vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di 4-fluoro-2-(1-metil-2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline-1,3-dione (composto 4)
	<ol>
<li>Combinare 3 acridride fluorofalico (1,25 g, 7,5 mmol), glutarimide 2 (1,21 g, 5 mmol) e una soluzione di acetato di sodio (0,50 g, 6,0 mmol) in acido acetico glaciale (20 mL) in un flacone rotondo da 100 mL con una barra di stir dotata di un reflusso. Riscaldare il composto a 120 gradi centigradi per 6 h.</li>
		<li>Dopo il raffreddamento, versare la miscela viola su H2O (100 mL) e mescolare per 10 min. Raccogliere il solido formato per filtrazione, lavare con H2O (3 x 5 mL) e l'etere petrolifero (3 x 5 mL) e asciugare in vacuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione del carbamate (composto 7) composto (composto 7) (composto 7)
	<ol>
<li>Caricare un pallone rotondo sul fondo da 50 mL con tert-butyl N-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate (5, 0,41 g, 1,65 mmol), composto 3 (0,41 g, 1,50 mmol), DMF secco (10 mL) e DIPEA (0,39 g, 0,51 mL, 3,0 mmol). Equipaggiare con una barra di agitazione e un condensatore di reflusso. Riscaldare sotto l'atmosfera argon a 90 gradi centigradi per 10 h.</li>
		<li>Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, versare la miscela verde scuro su H2O (100 mL) ed estrarre con EtOAc (3x 50 mL) in un imbuto separatore. Lavare gli strati organici combinati con H2O (50 mL) e salamoia (50 mL), asciugare su Na2SO4, filtrare e concentrarsi in vacuo.</li>
		<li>Purificare il prodotto grezzo per cromatografia a colonna su gel di silice (3 cm di diametro della colonna e 60 cm di altezza) utilizzando un gradiente di etere di petrolio/EtOAc (1:1 a 1:2).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dell'omodimero (composto 8)
	<ol>
<li>Combinare il linker di z, e diamina 6 (0,22 g, 0,22 mL, 1,50 mmol), DIPEA (1,05 mL, 6,00 mmol) e una soluzione di 3 (0,83 g, 3,00 mmol) in DMSO secco (20 mL) in una flacone di fondo tondo da 50 ml con una barra di collegsi. Riscaldare sotto l'atmosfera argon a 90 gradi centigradi per 18 ore.</li>
		<li>Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, versare la miscela verde scuro su H2O (100 mL) ed estrarre con EtOAc (3x 50 mL) in un imbuto separatore. Lavare gli strati organici combinati con H2O (50 mL) e salamoia (50 mL), asciugare su Na2SO4, filtrare e concentrarsi in vacuo.
</li>
		<li>Purificare il prodotto grezzo per colonna cromatografia su gel di silice (3 cm di diametro colonna e 50 cm di altezza) utilizzando un gradiente di etere di petrolio / EtOAc (1:2) a EtOAc.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dell'eterodimero (composto 9)
	<ol>
<li>Sciogliere il composto 7 (0,83 g, 1,65 mmol) in secco CH2Cl2 (10 mL). Aggiungere l'acido trifluoroacetico (10 mL) e mescolare la miscela gialla a 40 gradi centigradi per 2 h in una fiaschetta rotonda chiusa da 50 ml.</li>
		<li>Rimuovere le sostanze volatili e coevaporare con CH2Cl2 (4x 5 mL). Asciugare il residuo in vacuo per 10 h.</li>
		<li>Sciogliere il materiale in DMF secco (20 mL). Aggiungere il composto 4 (0,44 g, 1,50 mmol) e DIPEA (0,78 g, 1,05 mL, 6,00 mmol) ed equipaggiare il pallone con un condensatore di reflusso. Riscaldare sotto l'atmosfera argon a 90 gradi centigradi per 10 h.</li>
		<li>Dopo il raffreddamento a temperatura ambiente, versare la miscela verde scuro su H2O (100 mL) ed estrarre con EtOAc (3x 50 mL) in un imbuto separatore. Lavare gli strati organici combinati con NaHCO3 saturo saturo (50 mL), H2O (50 mL), 10% KHSO4 (50 mL), H2O (50 mL) e salamoia (50 mL), asciugare su Na2SO4, filtrare e concentrare in vacuo.</li>
		<li>Purificare il prodotto grezzo per colonna cromatografia su gel di silice (3 cm di diametro colonna e 50 cm di altezza) utilizzando un gradiente di etere di petrolio / EtOAc (1:2) a EtOAc.</li>
		<li>Elucidate e verificate la struttura delle molecole (Figura 5A composta 8, composto 5B 9) di 1H NMR e 13C Spettri NMR in DMSO-d6 su una risonanza magnetica nucleare (NMR) Spettrometro. Verificare che la purezza di entrambi i composti sia superiore al 97% mediante la spettrometria linfografia-massa liquida (LC-MS), applicando un rilevamento di array didi diodi (DAD) a 220-500 nm.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Convalida funzionale delle molecole PROTAC
<ol><li>Analisi western della degradazione di CRBN da parte dei PROTAC NOTA: Gli effetti dei composti8 (IN vioe composto9 (in viesul livello delle proteine CRBN sono stati testati dall'analisi delle macchie occidentali. Inoltre, l'impatto sui livelli di IK-F1 e IK-F3 potrebbe essere confermato (Figura 6).<ol><li>
Preparazione del campione
		<ol>
<li>Sciogliere i composti 8 e 9, lenalidomide (Len), pomalidomide (Pom), MG132, e MLN-4924 in DMSO ad una concentrazione di 10 mM, e conservare a -80 gradi centigradi fino a un ulteriore utilizzo.</li>
			<li>Seme 1 x 106 cellule MM1S in una piastra a 6 pozze con supporto da 2,5 mL e trattare le cellule con 100 nM o 1 composto M 8 o 9 per 24 h.</li>
			<li>Raccogliere le cellule dopo il trattamento e centrifugare a 700 x g, 5 min, 4 gradi centigradi. Lavare il pellet cellulare con 1x PBS freddo per rimuovere i supporti rimanenti, centrifugare a 700 x g, 5 min, 4 gradi C, e scartare supernatante. Ripetere questo passaggio una volta.</li>
			<li>Cellule di lysise nel buffer di lisi (25 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5% glicerolo, 1x Protease & Fosfono Inibitore Cocktail) per 10 min sul ghiaccio, centrifuga a 320 x g per 10 min, 4 C. Raccogliere supernatante e determinare la concentrazione di proteine da un saggio di proteine acido bicinchoninico (saggio BCA) secondo il protocollo del produttore.</li>
			<li>Proteine di denaturazione (15-30 g/campione) con tampone di carico 1x LDS (5% 2-mercaptoetanolo) e far bollire 10 min, 75 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Pagina SDS-PAGE
		<ol>
<li>Fissare sandwich gel con un 10% gel di separazione [4 mL 3x gel buffer (3 M Tris/HCl, 0,3% (w/v) solfato di sodio al sodio di sodio (SDS), pH 8,45), 4 mL di acrilamma 30%, 2,52 mL di licerone 50%, 1,395 mL H2O, 75 - 11 % ammonial perlato (APS) e 9,75 TEMED l'EL [1,992 mL 3x gel buffer, 0,792 mL 30% acrilamide, 3,168 mL H2O, 36 L 11% APS e 6 TEMED] in un'unità di assemblaggio di elettrodi. Rimuovere pettini, lavare i pozzi con tampone catodo (100 mM Tris/HCl, 100 mM tricine, 0,1% (w/v) SDS) e caricare i campioni.</li>
			<li>Riempire il buffer anode (100 mM Tris/HCl, pH 8.9) nel serbatoio. Caricare il campione proteico dal passo 2.1.1.4 e eseguire SDS-PAGE a 70 V, 20 min, seguito da 115 V, 150 min a tensione costante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Immunoblotting e rilevamento di CRBN, IK-F1 e IK-F3
		<ol>
<li>Attivare la membrana PVDF (0,45 m) nel 100% di metanolo per 1 min. membrana e gel di separazione nel buffer di trasferimento 1x [10x buffer di trasferimento (192 mM glicina, 25 m Tris-base/HCl, 900 mL H2O), 20% metanolo, 0.1% SDS, pH 8.3].</li>
			<li>Assemblare cassetta gonfia secondo il protocollo del produttore. Gel di trasferimento a 180 mA per 90 min.</li>
			<li>La membrana di lavaggio 3 x in 1x TBS-T (25 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, pH 7,6, 0,1% Tween 20) per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Membrana a blocchi in 5% di latte essiccato non grasso (NFDM), TBS-T per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la membrana 3 volte in 1X TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente.</li>
			<li>Membrana di incubatura con anticorpo primario per CRBN (1:500 nel 5% BSA, TBS-T) con agitazione delicata a 4 gradi centigradi durante la notte.</li>
			<li>Lavare la membrana 3 volte in 1X TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Membrana di incubazione con anti-topo (1:10.000 nel 5% NFDM, TBS-T) o anti-coniglio (1:5.000 nel 5% NFDM, TBS-T) anticorpo secondario accoppiato al rafano perossidase HRP (1 h a temperatura ambiente.)</li>
			<li>Lavare la membrana 2x in 1X TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio due volte con 1x TBS.</li>
			<li>Membrana di incubazione per 2 min con soluzione di substrato HRP secondo i protocolli del produttore e rilevamento della chemiluminescenza in un dispositivo di rilevamento della chemiluminescenza.</li>
			<li>Lavare la membrana 1x in 1X TBS per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente. Per il rilascio di anticorpi, striscia membrana in buffer di stripping disponibile in commercio per 15 min.</li>
			<li>Riblocco della membrana in 5% di latte essiccato, TBS-T per 1 h a temperatura ambiente. Lavare la membrana 3 volte in 1 TBS-T per 5-10 min ciascuno a temperatura ambiente e risondare con IK-F1, IK-F3 o tubulina secondo il passo 2.1.3.4.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Esperimenti di competizione con MG132, MLN4942 o pomalidomide NOTA: Per confermare se il CRBN è degradato attraverso il percorso onniquitina-proteasome, abbiamo effettuato esperimenti di competizione con l'inibitore proteasoso MG132 e un inibitore dell'enzima di attivazione della neddylation (NAE) MLN4942 (Figura7).<ol>
<li>Seme 1 x 106 celle MM1S per pozzo in una piastra di 6 pozzetti. Pretrattare le cellule con 10 m MG132, 10M MLN4942 o lenalidomide (100x) e incubare 1 h a 37 gradi centigradi, 5% DI CO2.</li>
		<li>Aggiungere 100 nM composto 8 per 3 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.</li>
		<li>Raccogliere le cellule per la macchia occidentale secondo il passo 2.1.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Saggi di sopravvivenza cellulare in più linee cellulari del mieloma NOTA: Questo test viene utilizzato per testare l'impatto sulla vitalità delle cellule e, inoltre, antagonizzare l'effetto di IMiD su più cellule di mieloma pretrattamento delle cellule con composto 8 (Figura 8, Figura 9A,B).<ol>
<li>Seme 5 x 104 MM1S cellule per pozzo in una piastra di 96 po in triplicati biologici per il saggio di fattibilità. Per l'analisi western blot, semi 1 x 106 cellule MM1S per bene in una piastra di 6 pozzetti in triplicati biologici.</li>
		<li>Trattare le cellule con DMSO o 100 nM, 1 M, o 10 M composto 8, composto 9 o pomalidomide e incubare per 24 h, 48 h, o 96 h a 37 c, 5% CO2. Per gli esperimenti di salvataggio, trattare le cellule con 100 nM composto 8 per 3 h, prima o dopo l'aggiunta di 1 M pomalidomide e incubare per 96 h.</li>
		<li>Misurare la luminescenza della piastra di 96 pozze con un saggio di vitalità delle cellule luminescenti, secondo il protocollo del produttore su un lettore di piastre o raccogliere cellule dalla piastra 6-po' per l'analisi delle macchie occidentali.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano un potenziale conflitto di interessi finanziario.

La progettazione di tali omo-PROTAC come descritto qui per CRBN si basa sulla specifica affinità della pomalimofilia con CRBN, che è stata utilizzata con successo in numerosi PROTAC eterobifunzionali e ha portato allo sviluppo di PROTAC 8 come degrado CRBN selettivo. La specificità della nostra molecola è già stata confermata dalle analisi proteomiche24. Per knockout geneticamente mediato, l'esclusione e la convalida degli effetti collaterali è impegnativo e richiede tempo. Inoltr...

I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti approvati per il trattamento del mieloma multiplo, si legano alla sigillante ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), un adattatore substrato per l'ubiereanzi a 2la-RING E3 (CRL4CRBN)1,2,3. L'associazione degli IMiD aumenta l'affinità di CRL4CRBN ai fattori di trascrizione linfoidi Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3), portando alla loro ubiquitazione e degradazione (Figura 1)4,5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8. Dal momento che iK-F1 e IK-F3 sono essenziali per le cellule multiple del mieloma, la loro inattivazione provoca inibizione della crescita. SALL4 è stato recentemente trovato come un ulteriore neo-substrato indotta da IMiD di CRBN che è probabilmente responsabile della teratogenicità e della cosiddetta catastrofe Contergan negli anni '50 causata dalla talidomide9,10. Al contrario, la cassicina 1 è un substrato di CRBN specifico di lenalidomide che è implicato nell'effetto terapeutico nella sindrome della mielodiplastico con cromosoma 5q eliminazioni11.
La capacità delle piccole molecole di indirizzare una proteina specifica per la degradazione è un'implicazione interessante per lo sviluppo di farmaci moderni. Mentre il meccanismo della talidomide e dei suoi analoghi è stato scoperto dopo il loro primo utilizzo negli esseri umani, la cosiddetta Proteolisi Targeting Chimeras (PROTAC) sono stati progettati per indirizzare specificamente una proteina di interesse (POI) (Figura 2)12,13,14,15,16,17,18. I PROTAC sono molecole eterobifunzionali costituite da un ligando specifico per il POI collegato tramite un linker a un ligando di una ligase ubiquitina E3 come CRBN o von-Hippel-Lindau (VHL)18,19,20, 21,22. I PROCAC inducono la formazione di un complesso ternario transitorio, dirigendo il POI alla ligase dell'ubiquitina E3, con conseguente ubiquitinazione e degradazione proteasomica. I principali vantaggi dei PROTAC rispetto agli inibitori convenzionali sono che il legame a un POI è sufficiente piuttosto che la sua inibizione e quindi i PROTAC possono potenzialmente indirizzare uno spettro molto più ampio di proteine, comprese quelle considerate infarmacibili come fattori di trascrizione15. Inoltre, le molecole chimetriche agiscono cataliticamente e quindi hanno un'alta potenza. Dopo il trasferimento dell'ubiquitina al POI, il complesso ternario si dissocia ed è disponibile per la formazione di nuovi complessi. Pertanto, concentrazioni molto basse di PROTAC sono sufficienti per la degradazione della proteina bersaglio23.
Qui descriviamo la sintesi di una pomalimide-pomalidomide coniugata homo-PROTAC (composto 8) che recluta CRBN per la degradazione di se stesso24. L'E3 ubiquitin ligase CRBN è sia il reclutatore che l'obiettivo contemporaneamente (Figura 3). Per convalidare i dati, abbiamo anche sintetizzato un controllo di rilegatura negativo (composto 9). I nostri dati confermano che l'omo-PROTAC appena sintetizzato è specifico per la degradazione CRBN e ha solo effetti minimi su altre proteine.

<table><tbody><tr><td>1,1'-Carbonildiimidazolo</td><td>TCI sostanze chimiche</td><td>C0119</td><td></td></tr><tr><td>2,2&prime;-(Etilendiossi)-bis(etilammina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>385506</td><td>Composto 6</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>3-Anidride fluoroftalica, 98 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12275</td><td></td></tr><tr><td>4-Dimetilamminopiridina, 99 %</td><td>Acros</td><td>148270250</td><td></td></tr><tr><td>acrilammidstamml tossico&ouml; cantato/ Bisacrilammide (30%/0,8%)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Aiolos (D1C1E) mAB</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>15103S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CRBN prodotto nel coniglio</td><td>Sigma</td><td>HPA045910</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-coniglio IgG HRP-linked Sigma</td><td></td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Gln-OH</td><td>TCI sostanze chimiche</td><td>B1649</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare luminescente</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>DMF, anidro, 99,8 %</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td>Extra secco su setaccio molecolare</td></tr><tr><td>DMSO, anidro, 99,7 %</td><td>Acros</td><td>348445000</td><td>Extra secco su setaccio molecolare</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo (HRP coniugato)</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>sc-2005</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteasi & Cocktail monouso con inibitore della fosfatasi (100X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Ikaros (D6N9Y) Mab</td><td>Cell signaling</td><td>14859S</td><td></td></tr><tr><td>Membrana di trasferimento ImmobilonP (0,45&micro; m)</td><td>Merck</td><td>IPVH000010</td><td></td></tr><tr><td>Iodomethane, 99 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8507</td><td>Metanolo altamente tossico</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Mg132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cella di trasferimento elettroforetica</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MLN4942</td><td>biomol (cayman)</td><td>Cay15217-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale anti-alfa;-tubulina prodotto nel topo (B512)</td><td>Sigma</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>N-etildiisopropilammina, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere scremato in polvere</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0830,0500</td><td></td></tr><tr><td>Nunc F96 MicroWell White Piastra in polistirene</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pomalidomide</td><td>Selleckchem</td><td>S1567</td><td></td></tr><tr><td>RestoreTM Western Blot Stripping Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>46430</td><td></td></tr><tr><td>sodio dodecil solfato</td><td>Carl Roth</td><td>183.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>terz-butil N-[2-[2-(2-amminoetossi)etossi]etil]carbammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89761</td><td>Composto 5</td></tr><tr><td>Tricina</td><td>Carl Roth</td><td>6977.4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>WesternBright ECL spray</td><td>Advansta</td><td>K-12049-D50</td><td></td></tr></tbody></table>

inattivazione chimica dell'e3 ubiquitin ligase cereblon da parte di homo-protac con sede a pomeredomide

Chemical Inactivation of the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon by Pomalidomide-based Homo-PROTACs

I farmaci immunomodulatori (IMid) e i suoi analoghi, lenalidomide e pomalidomide, tutti i farmaci approvati dalla FDA per il trattamento del mieloma multiplo, inducono l'ubiquitazione e la degradazione dei fattori di trascrizione linfoide Ikaros (IK-F1) e Aiolos (IK-F3) tramite il cereblon (CRBN) E3 ubiquitina ligase per degradazione proteasomica. Gli IMID sono stati recentemente utilizzati per la generazione di chimere di proteolisi bifunzionale targeting (PROTAC) per indirizzare altre proteine per l'ubiquitinazione e la degradazione proteasomica da parte della ligase CRBN E3. Abbiamo progettato e sintetizzato proTAC omobifunzionali basati su pomalidomide e analizzato la loro capacità di indurre l'ubiquitinazione e la degradazione di CRBN. Qui, CRBN serve come entrambi, l'E3 ubiquitin ligase e l'obiettivo allo stesso tempo. Il composto omo-PROTAC 8 degrada il CRBN con un'alta potenza con solo effetti residui minimi su IK-F1 e IK-F3. L'inattivazione di CRBN da parte del composto 8 non ha avuto alcun effetto sulla vitalità cellulare e sulla proliferazione di diverse linee cellulari multiple del mieloma. Questo omo-PROTAC abroga gli effetti degli IMID in più cellule del mieloma. Pertanto, i nostri composti omodimeri a base di pomalidomide possono aiutare a identificare i substrati endogeni e le funzioni fisiologiche del CRBN e a studiare il meccanismo molecolare degli IMID.

Qui abbiamo descritto la progettazione, la sintesi e la valutazione biologica di un PROTAC omodimerico basato su pomalidomide per la degradazione del CRBN. Il nostro PROTAC interagisce contemporaneamente con due molecole CRBN e forma complessi ternari che inducono l'auto-ubiquitinazione e la degradazione proteasomica del CRBN con solo effetti rimanenti minimi su neo-substrati indotti dalla pomalimofe IK-F1 o IK-F3.
Da una serie ...

Questo lavoro descrive la sintesi e la caratterizzazione di un omo-PROTAC bimalidomide a base di pomalimmide come un nuovo approccio per indurre l'ubiquitinazione e la degradazione della cereblon della ligase dell'ubiquitina E3 (CRBN), l'obiettivo degli analoghi di talidomide.

Inattivazione chimica dell'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide

The immunomodulatory drugs (IMiDs) thalidomide and its analogs, lenalidomide and pomalidomide, all FDA approved drugs for the treatment of multiple ...

I nostri PROTAC omodimerici sono i primi inibitori chimici di Cereblon e possono aiutare a chiarire ulteriormente il meccanismo molecolare degli analoghi di talidomide, nonché a studiare la funzione fisiologica di Cereblon. Questa nuova tecnologia di piattaforma PROTAC può essere molto utile per indirizzare specificamente le proteine di interesse che sono altrimenti considerate non tracciabili. L'inibizione del CRBN da sola non ha attività antitumorata.Tuttavia, i degradanti CRBN possono avere implicazioni cliniche in obesità, malattie infettive e altri disturbi. La sintesi è impegnativa ed è difficile trovare linker e attaccamenti ottimali per generare efficaci degradatori proteici durante la progettazione di un composto PROTAC. Per iniziare, posizionare 2,46 grammi di L-glutammina protetta da Boc e 50 millilitri di tetraidrofurano in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri e mescolare a 800 giri/min per un minuto.Quindi, aggiungere 1,95 grammi di 1, 1'carbonildiimidazolo e una quantità catalitica di 4-piridina. Continuare a mescolare per 10 ore a reflusso per ottenere una soluzione limpida e incolore di composto glutarimide. Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e rimuovere il solvente con un evaporatore rotante.Riassolvere il residuo in 200 millilitri di acetato di etile e versarlo in un imbuto separatore. Lavare lo strato organico con 50 millilitri ciascuno di acqua e salamoia deionizzata e asciugare lo strato organico sul solfato di sodio. Filtrare la soluzione per gravità attraverso il gel di silice per rimuovere l'essiccante, quindi sciacquare il gel di silice con 200 millilitri di acetato di etile.Rimuovere il solvente dal filtrato sotto vuoto per ottenere il composto 1 come solido incolore. Asciugare il prodotto sotto vuoto durante la notte prima di utilizzarlo. Successivamente, sciogliere 0,50 grammi di acetato di sodio in 20 millilitri di acido acetico glaciale in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri dotato di una barra di agitazione.Aggiungere 1,25 grammi di anidride 3-fluoroftalica e 1,14 grammi di glutarimide e mescolare a reflusso per sei ore per ottenere una soluzione viola del composto 3. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente, quindi versarla in 100 millilitri di acqua deionizzata e mescolare per 10 minuti per precipitare il composto 3. Raccogliere il solido per filtrazione, lavarlo con acqua ed etere di petrolio e asciugarlo sotto vuoto per due giorni.Quindi, mettere 0,83 grammi di composto tre e 20 millilitri di solfossido di dimetile secco in un pallone Schlenk da 50 millilitri e mescolare per due minuti. Aggiungere 0,22 grammi di legame alfa omega diammina Composto 6 e 1,05 millilitri di N, N-diisopropiletilammina e mescolare la miscela sotto argon a 90 gradi celsius per 18 ore per ottenere Homodimer 8 in una miscela verde scuro. Lasciare raffreddare la miscela a temperatura ambiente e versarla in 100 millilitri di acqua deionizzata.Estrarre il prodotto in tre porzioni da 50 millilitri di acetato di etile, unire gli strati organici e lavarli con 50 millilitri ciascuno di acqua e salamoia. Asciugare lo strato organico lavato sul solfato di sodio, filtrare l'essiccante e rimuovere il solvente sotto vuoto. Riissolvere il residuo in una quantità minima di solvente cromatografico e applicare su una colonna di gel di silice per la purificazione.Raccogliere le frazioni di prodotto fluorescenti, combinarle e rimuovere il solvente per ottenere Homodimer 8 come solido giallo. Per iniziare, sciogliere 2,28 grammi di glutarimide 1 in 25 millilitri di dimetilformamide in un pallone a fondo rotondo da 100 millilitri. Sospendere 2,76 grammi di carbonato di potassio macinato in questa soluzione.Quindi, disegnare 0,62 millilitri di iodometano in una siringa dotata di un ago calibro 20. Aggiungi l'iodometano per quanto riguarda il drop nel corso di 10 secondi. Fermare il pallone con un setto di gomma e aggiungere un ago di sfiato.Sonicare la miscela per due ore a temperatura ambiente per ottenere glutarimide composto 2. Diluire la miscela con 50 millilitri di acetato di etile e versarla in un imbuto separatore. Risciacquare il pallone nell'imbuto con altri 50 millilitri di acetato di etile.Lavorare il prodotto e purificarlo con cromatografia a colonna di gel di silice per ottenere la glutarimide 2 come solido incolore. Confrontare i tempi di ritenzione dei composti glutarimide 1 e 2 per confermare che la metilazione N ha avuto successo. Per iniziare la convalida, trattare più cellule del mieloma con i composti di interesse.Isolare le proteine rilevanti e preparare campioni per un'analisi western Blot della degradazione proteica. Quindi, preparare un sandwich di gel per SDS-PAGE e riempire il serbatoio del buffer anodo con una soluzione di pH 8.9 tris-HCl. Caricare i campioni proteici nel gel ed eseguito a 70 Volt per 20 minuti, seguito da 115 volt per 150 minuti.Quindi, preparare un buffer di trasferimento 1x per l'immunoblotting e spostare attentamente il gel dalla sua cassetta al buffer di trasferimento per equilibrare. Devi stare molto attento quando rimuovi il gel dalla cassetta per l'equilibrazione, perché può scoppiare e accartocciarsi molto rapidamente. Immergere una membrana di difluoruro di polivinilidene da 0,45 micrometri in metanolo puro per almeno 20 secondi per attivarla, quindi immergerla in un buffer di trasferimento 1x.Lasciare equilibrare il gel e la membrana per 10 minuti. Quindi, assemblare la cassetta western blotting e applicare 180 milliampere per 90 minuti per trasferire le proteine alla membrana. Successivamente, visualizzare le proteine immunosottenendo.Per valutare gli effetti sulla vitalità cellulare, in primo luogo, seme 50.000 cellule multiple di mieloma per pozzo di una piastra di 96 po 'in tripliceto biologico. Aggiungere a ciascun pozzo 100 microlitri di supporti contenenti DMSO, o uno 0,1, uno o 10 micromolare di composto 8, composto 9 o pomalidomide. Per eseguire l'esperimento di salvataggio della vitalità cellulare, trattare invece le cellule con una soluzione nanomolare 100 di composto 8 per tre ore, prima o dopo aver aggiunto una soluzione micromolare di pomalidomide.Incubare le cellule per 24, 48 o 96 ore a 37 gradi celsius in un'atmosfera di anidride carbonica del 5% e misurare la vitalità cellulare con un saggio luminescente. La struttura del PROTAC 8 omodimerico è stata confermata con NMR protonico e carbonio. Heterodimeric PROTAC 9 è stato sintetizzato come un controllo negativo, poiché la metilazione N all'interno della porzione di glutarimide comporta una perdita di cereblon, o CRBN, capacità di legame.L'homo PROTAC 8 ha indotto una degradazione CRBN proteosomica quasi completa con effetti minimi sui fattori di trascrizione linfoide IKZF1 e IKZF3. Al contrario, l'etero PROTAC 9 ha mostrato un comportamento simile ai pomalidomidi. La degradazione crbn indotta dal composto 8 potrebbe essere bloccata da un inibitore diretto del proteasome, o indirettamente bloccata dall'inibizione della netilazione.Le cellule pretrattate con il composto 8 hanno resistito significativamente agli effetti del pomalidomide su IKZF1 e IKZF3. La degradazione CRBN indotta dal composto 8 ha avuto molto meno effetto sulla vitalità della cellula del mieloma multiplo dopo 96 ore rispetto alla degradazione IKZF1 e IKZF3 dal composto 9 e dal pomalidomide. Più cellule del mieloma pretrattate con il composto 8 avevano una vitalità significativamente maggiore se esposte al pomalidomide rispetto alle cellule non trattate, suggerendo che il composto 8 poteva essere usato per imitare la resistenza ai farmaci immunomodulatori IMiD.Abbiamo scoperto che il composto 8 induce la completa degradazione proteasomale di Cereblon, non ha effetti collaterali sulla vitalità e proliferazione cellulare IKZF1 e IKZF3. L'estensione della tecnologia del progetto ad altri obiettivi ha il potenziale per inattivare e rintracciare le proteine legate al cancro e ad altre malattie. Quando si adatta questa tecnica per altri farmaci e proteine, si dovrebbero indagare attentamente le strutture molecolari del farmaco e il bersaglio proteico per scegliere i linker e gli allegati ottimali.Gli IMID non funzioneranno nei topi a causa di una mutazione puntile nel Cereblon, ma esiste un modello transgenico di topo knock-in che può essere utilizzato per ulteriori studi sugli animali. Poiché la pomalidomide è una talidomide analogica, che è altamente teratogena, non consigliamo alle donne incinte di lavorare con questi farmaci.

chemical-inactivation-e3-ubiquitin-ligase-cereblon-pomalidomide-based

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Chimica

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Cella della morte associata a mitosi anomalo osservato da Imaging confocale in cellule vive di cancro

Valutare la potenza dei prodotti chimici ambientali e farmaci, per essere enzimaticamente addotti bioactivated per intermedi generando covalente del DNA, è un campo importante nello sviluppo del cancro ed il relativo trattamento. Metodi sono descritti per l'attivazione di composto per formare che complessi del DNA, così come le tecniche per la loro rilevazione e quantificazione.

Formazione di covalente del DNA addotti da agenti cancerogeni enzimaticamente attivati e farmaci In Vitro e la loro determinazione di 32P-postlabeling

Questo documento utilizza un flusso cytometry-test per librerie di schermo di inibitori chimici per l'identificazione di inibitori e ai loro obiettivi che influenzano la segnalazione del ricevitore della T-cellula. I metodi descritti qui possono essere espanso per high throughput screening.

Identificazione dei mediatori del T-cell Receptor segnalazione tramite lo Screening di librerie chimiche inibitore

Questo protocollo mira a stabilire proteomi specifici di ubiquitina (Ub) e ubiquitina (Ubls) al fine di identificare alterazioni di questo tipo di modifiche post-traduzionali (PTM), associate a una condizione specifica come un trattamento o un fenotipo.

Profilazione delle modifiche post-traduzionali dipendenti da Ubiquitin e Ubiquitine e identificazione di alterazioni significative

Questo protocollo descrive la rilevazione luminescente quantitativa della cinetica di degradazione delle proteine in cellule viventi che sono state ingegnerizzate utilizzando CRISPR / Cas9 per esprimere il tag di rilevamento delle proteine endogene prive di anticorpi fuso a una proteina bersaglio. Sono incluse istruzioni dettagliate per calcolare e ottenere parametri quantitativi di degradazione, velocità, Dmax, DC 50 e Dmax50.

Profilazione cellulare ad alto rendimento di composti di degradazione proteica mirati utilizzando linee cellulari HiBiT CRISPR

Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

Il presente protocollo evidenzia un metodo modificato per rilevare e quantificare i legami incrociati DNA-proteina (DPC) e le loro modificazioni post-traduzionali (PTM), tra cui l'ubiquitilazione, la SUMOilazione e l'ADP-ribosilazione indotte da inibitori della topoisomerasi e dalla formaldeide, consentendo così lo studio della formazione e della riparazione delle DPC e dei loro PTM.

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

Questo articolo riporta la costruzione di cellule knockout della proteina E associata al centromero (CENP-E) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9 e tre strategie di screening basate sul fenotipo. Abbiamo utilizzato la linea cellulare knockout CENP-E per stabilire un nuovo approccio per convalidare la specificità e la tossicità degli inibitori CENP-E, utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca biologica.

Generazione di linee cellulari knockout CENP-E-/- associate al centromero della proteina E utilizzando il sistema CRISPR/Cas9

Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN).  I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Descriviamo dettagli sperimentali della sintesi di particelle fantasia e riconfigurabili da due dimensioni (2D) precursori. Questo metodo può essere utilizzato per creare particelle in una varietà di forme tra poliedri e dispositivi di presa a scale di lunghezza che vanno dalla micro alla scala centimetri.

Origami Ispirato auto-assemblaggio di particelle Fantasia e riconfigurabile

Scopri la sintesi di un homo-PROTAC bifunzionale basato su pomalidomide per indurre la degradazione della ligasi E3 ubiquitina Cereblon. Questo metodo innovativo permette di studiare meccanismi molecolari e funzioni fisiologiche di CRBN.

Inattivazione chimica dell'E3 Ubiquitin Ligase Cereblon da parte di Homo-PROTAC con sede a Pomeredomide

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