Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare
20 settembre 2019
Qui descriviamo i protocolli per l'applicazione di carichi meccanici definiti ai vitelli del topo e per il monitoraggio dei concomitanti cambiamenti di pressione intramuscolare. I sistemi sperimentali che abbiamo sviluppato possono essere utili per studiare il meccanismo alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico e del massaggio.
Il nostro protocollo può essere utile nei sistemi e nel meccanismo. E le giuste informazioni mostrano l'effetto dello stress fisico e del massaggio. Il nostro sistema di completamento ciclico locale è molto più semplice.
I metodi convenzionali non sono necessari per l'inserimento locale. Applicare il nastro chirurgico sugli arti posteriori bilaterali in posizione supina con le articolazioni del ginocchio estese e le articolazioni della caviglia plantare flesso. Posizionare un filo di alluminio sul tronco al livello della colonna vertebrale L4-5 e avvolgere il filo in una configurazione a spirale intorno agli arti posteriori con spazi vuoti di cinque millimetri tra ogni giro della spirale.
Per ridurre al minimo la possibilità di fuga dal cablaggio, regolare manualmente la configurazione del filo per immobilizzare le articolazioni dell'anca in una posizione di sottrazione di 90 gradi. Quindi riportare il mouse nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Per misurare la pressione muscolare gastrocnemio intramuscolare posizionare il topo anestetizzato nella posizione prona e radersi, depilato e semi-sterilizzare la pelle del polpaccio posteriore.
Utilizzare un bisturi per fare un'incisione di due millimetri nella pelle disinfettata. E inserire un ago gonfiante calibro 20 nel muscolo gastrocnomio con un angolo da 150 a 170 gradi rispetto alla superficie della pelle. Successivamente, usando la torcia di plastica dell'ago come guida, posizionare un sensore telemetro della pressione sanguigna nella pancia media del muscolo gastrocnomio.
Racchiudere la pelle con una sutura in nylon 4-O. Quindi, utilizzare diversi pesi unitari cilindrici per applicare la compressione cilindrica locale al muscolo del polpaccio per un minuto. E monitorare la pressione intramuscolare utilizzando il software appropriato per l'analisi biologica del segnale.
Per il trattamento di compressione ciclico locale disinnestare il mouse anestetizzato dal cablaggio dell'arto posteriore. E metti l'animale nella posizione incline. Regolare gli arti posteriori in modo che le articolazioni del ginocchio siano estese e le articolazioni della caviglia siano plantari flesso con i polpacci rivolti verso l'alto.
E spostare verticalmente un'unità di peso cilindrica, coperta da un cuscinetto ammortizzato, sul muscolo del polpaccio a un hertz per 30 minuti al giorno per sette giorni. Dopo ogni attacco giornaliero di compressione ricollegare gli arti posteriori del topo prima di riportare l'animale nella sua gabbia domestica. Alla fine dell'esperimento depilate la superficie posteriore del polpaccio e fate un'incisione cutanea per consentire la separazione dei muscoli gastrocnemi dall'osso tibiofibulare.
Congelare rapidamente il tessuto muscolare raccolto in una soluzione composta ottimale per la temperatura di taglio. E usa un criostato per ottenere sezioni dei muscoli gastrocnemio su scivoli di vetro. Per l'etichettatura immunoistochimica il disgelo e la disidratazione delle sezioni mediante essiccazione ad aria a temperatura ambiente prima di utilizzare una penna idrofobica per disegnare un anello attorno alle sezioni tissutali su ogni scivolo.
Quindi, posizionare gli scivoli nella camera di umidità. E aggiungere 100 microlitri di buffer di blocco su ciascun lato. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente sciacquare gli scivoli con due lavaggi di 5 minuti in PBS-T, prima di etichettare le sezioni con 100 microlitri dell'anticorpo primario di interesse durante la notte a temperatura ambiente.
La mattina successiva lavare gli scivoli 3 volte in PBS-T per 5 minuti per lavaggio. Ed etichettare i campioni con un anticorpo secondario appropriato per 1 ora a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli 3 volte in PBS-T fresco come dimostrato.
E macchiare i nuclei con 100 microlitri di DAPI per tre minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, lavare la diapositiva altre tre volte. E montare i campioni con un mezzo di montaggio compatibile e scivolare di copertura.
Per l'analisi istomorfometrica, posizionare le diapositive sullo stadio di un microscopio a fluorescenza e visualizzare i campioni sotto una soggettività 20-X nei filtri appropriati. Quindi, nel software di analisi delle immagini misurare l'area della sezione trasversale di ogni miofibra e contare il numero di celle che esprimono i marcatori sperimentali di interesse. L'area sezionale trasversale della miofibra gastroclio è significativamente diminuita dall'immobilizzazione degli arti posteriori.
Inoltre, l'analisi della colorazione immunofluorescente rivela che le cellule che esprimono MCP-1 e TNF-alfa sono significativamente aumentate nei tessuti muscolari gastrocnemio degli arti posteriori immobilizzati. Insieme, con l'aumento delle cellule positivamente macchiate di F4/80, l'immobilizzazione degli arti posteriori sembra istigare l'atrofia muscolare del polpaccio, coinvolgendo risposte infiammatorie locali, incluso l'accumulo di macrofagi. Tra le diverse grandezze di compressione ciclica locale testate cambiando il peso dell'unità cilindrica, la compressione corrispondente a 50 millilitri di onde di pressione intermuscolari di mercurio, sembra alleviare nel modo più efficiente la diminuzione indotta dall'immobilizzazione nell'area della sezione trasversale del miofiber e aumentare l'accumulo di macrofagi nei muscoli gastrocnemio.
Una compressione ciclica locale da 66 grammi, applicata a 1 hertz per 30 minuti al giorno per 7 giorni, allevia significativamente le diminuzioni indotte dall'immobilizzazione osservata nell'area della sezione trasversale della miofibra dei muscoli gastrocnemio. Inoltre, la compressione ciclica locale tempera parzialmente le diminuzioni indotte dall'immobilizzazione nella forza contrattuale dei muscoli surae tricipiti. Inoltre, la compressione ciclica locale tempera l'aumento di F4/80 positivo, TNF-alfa positivo e MCP-1 una cellule positive nel tessuto muscolare gastrocnemio degli arti posteriori immobilizzati.
Il nostro approccio fornirà una base scientifica per l'aumento muscolare del paziente e la nostra potenziale strategia per la procedura preventiva. Il topo ha trovato il limitato dell'inattività fisica. Usando il nostro sistema, abbiamo iniziato a valutare la maggior parte dei pazienti che i muscoli mancano di meccanica nel paziente.
Un modo industriale locale moderato per farlo rende una perfetta atrofia muscolare indotta dall'immobilizzazione.
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Panoramica
Questo articolo descrive i protocolli per applicare carichi meccanici ai vitelli di topo e monitorare i cambiamenti di pressione intramuscolare. Questi sistemi sperimentali sono progettati per studiare i meccanismi alla base degli effetti benefici dell'esercizio fisico e del massaggio.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biomeccanica
- Fisiologia
Sfondo
- Comprendere gli effetti dei carichi meccanici sulla fisiologia muscolare.
- Indagare il ruolo dello stress fisico e del massaggio.
- Sviluppare metodi più semplici per monitorare la pressione intramuscolare.
- Migliorare la conoscenza dei benefici dell'esercizio.
Obiettivo dello studio
- Stabilire protocolli per applicare carichi meccanici ai vitelli di topo.
- Monitorare i cambiamenti di pressione intramuscolare durante queste applicazioni.
- Esplorare i meccanismi alla base dei benefici dell'esercizio fisico e del massaggio.
Metodi utilizzati
- Applicazione di carichi meccanici utilizzando nastro chirurgico sugli arti posteriori.
- Posizionamento dei topi in posizione supina con articolazioni del ginocchio estese.
- Avvolgimento di filo di alluminio intorno agli arti posteriori per monitorare la pressione.
- Utilizzo di sistemi di completamento ciclico locale per semplicità.
Risultati principali
- Applicazione di successo di carichi meccanici definiti ai vitelli di topo.
- Monitoraggio efficace dei cambiamenti di pressione intramuscolare.
- Dimostrazione della semplicità del nuovo metodo rispetto alle tecniche convenzionali.
- Incontri sugli effetti dello stress fisico e del massaggio sulla fisiologia muscolare.
Conclusioni
- I protocolli sviluppati possono far progredire la ricerca sui benefici dell'esercizio.
- Nuovi metodi forniscono un approccio più semplice allo studio delle risposte muscolari.
- Ulteriori indagini sono giustificate per comprendere pienamente i meccanismi coinvolti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Mechanical perturbation models, such as consistent massage-like compression in murine systems, enable biopharma teams to interrogate the mechanistic basis of muscle inflammation and atrophy. Quantitative monitoring of intramuscular pressure and inflammatory markers supports predictive confidence in target validation for musculoskeletal and inflammation-modulating therapeutics. This approach strengthens translational continuity from early discovery through preclinical model optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of mechanical regulation in muscle homeostasis and inflammation.
- Supports functional target validation by linking pressure modulation to macrophage and cytokine responses.
- Facilitates biological de-risking for anti-inflammatory and muscle-preserving drug candidates.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible system for generating and measuring defined intramuscular pressure changes.
- Standardizes quantifiable outputs such as myofiber cross-sectional area and inflammatory cell counts.
- Enables assay readiness for evaluating compound effects on mechanically induced muscle atrophy and inflammation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of immobilization-induced muscle atrophy and local inflammation.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical efficacy assessment in muscle and inflammation research.
- Improves predictive value for interventions targeting physical inactivity or rehabilitation settings.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical validation, supporting mechanistic de-risking and translational biomarker development in musculoskeletal and inflammation-focused pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies the impact of mechanical stress on inflammatory pathways and muscle atrophy.
- Screening: Delivers standardized, reproducible pressure and histological readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of pressure thresholds, cellular markers, and muscle morphology.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to disease-relevant preclinical models of muscle loss and inflammation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse muscle and inflammation research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of muscle inflammation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of mechanical perturbation and pressure measurement.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for anti-inflammatory and muscle-preserving therapeutic candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of programs targeting muscle atrophy and inflammation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal handling, pressure measurement, and immunohistochemistry.
- Needs access to pressure sensors, telemeter systems, and fluorescence microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of compression parameters and histological analysis.
- Adaptable to other muscle groups or disease models with protocol optimization.
- Limitations include the need for further development for broader mechanistic studies as noted by the authors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Mouse Bilateral Hindlimb Immobilization
2:20
Local Cyclical Compression (LCC) Treatment
1:20
Intramuscular Mouse Gastrocnemius Muscle Pressure Measurement
5:14
Results: Representative Effects of LCC on Mouse Calf Muscle
7:01
Conclusion
3:01
Immunohistochemical Preparation and Histo-Morphometric Analysis
