Name: Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Scopri come misurare la tensione dell'integrina con sensibilità picoNewton usando il sensore ITS basato su DNA. Questo metodo consente l'imaging diretto delle forze cellulari in tempo reale con alta risoluzione spaziale.

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Questo lavoro è stato supportato dal fondo di avvio fornito da Iowa State University e dal National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso (IACUC, 8-16-8333-I) della Iowa State University e istituzionali Animal Care.
1. sintesi del sensore tensione integrativa
<ol><li>Personalizzare e ordinare ssDNAs (Vedi la Tabella materiali). Nota: Le sequenze di ssDNA sono come segue. Il filo superiore è /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. I fili inferiori sono come segue. 12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/ 23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC 33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC 43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC pN 54 ITS: /5Biosg/iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC Qui, /5ThioMC6-D / rappresenta un modificatore del tiolo C6 S-S (disolfuro) all'estremità 5'. /3BHQ_2/ rappresenta un buco nero Quencher 2 all'estremità 3'. 3Bio /, / 5Biosg/e /iBiodT/ sono biotinylation all'estremità 3' estremità 5' e sulla timina del DNA interno, rispettivamente. /iCy3/ rappresenta un Cy3 inserita nel backbone del interna di ssDNA. Questi codici sono utilizzati dal fornitore commerciale specifico usato qui e potrebbero essere diversi in altre società di DNA.</li>
	<li>Peptide RGD coniugato ad SH-ssDNA-quencher. Nota: I reagenti impiegati sono tampone fosfato salino (PBS), Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (sulfo-SMCC), peptide RGD e tris-(2-carboxyethyl) cloridrato di fosfina, noto anche come TCEP-HCl.<ol>
<li>DEPROTECT il modificatore del tiolo sul DNA strand superiore utilizzando TCEP soluzione. Nota: Tiolo-modificato DNAs ordinato da una fonte commerciale vengono spediti in forma ossidata, con gli atomi di zolfo protetti da un ponte disolfuro che deve essere ridotta prima coniugazione RGD-DNA. TCEP è un reagente di riduzione inodore usato per la deprotezione del tiolo.<ol>
<li>Sciogliere 14,3 mg di TCEP-HCl in 300 µ l di acqua. Regolare il pH della soluzione TCEP a ~7.2–7.4 con una soluzione di NaOH 1 M (circa 150 µ l), utilizzando documenti di test del pH. Aggiungere acqua pura per rendere un volume finale di 0.5 mL. La concentrazione finale di TCEP è 100 mM. Nota: Si consiglia di rendere TCEP soluzione fresca ogni volta per deprotezione del tiolo del DNA. Evitare lo stoccaggio soluzione TCEP per lungo tempo.</li>
			<li>Aggiungere 100 µ l di soluzione di 0,5 M Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) e 400 µ l di acqua alla soluzione TCEP.</li>
			<li>Aggiungere 10 µ l della soluzione TCEP + EDTA a 20 µ l di 1 mM del tiolo-DNA-BHQ2 in PBS. Lasciare reagire per 30 min a temperatura ambiente. Nota: Il legame disolfuro di 5' modificatore del tiolo coniugazione C6 S-S a questo ssDNA sarà essere clivato da TCEP, lasciando il gruppo tioalcool pronta per reazione con maleimide nei passaggi successivi. Il TCEP non interferisce con la seguente reazione tiolo-maleimide; così, non è necessario di passivare TCEP dopo questo passaggio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coniugato RGD-NH2 con sulfo-SMCC.<ol>
<li>Sciogliere 5 mg di RGD-NH2 in 100 µ l di PBS per ottenere 11 mM RGD-NH2.</li>
			<li>Aggiungere 200 µ l di acqua pura al tubo con 2 mg di sulfo-SMCC (predosate dal fornitore). Smash il sulfo-SMCC solido con un puntale e pipettare vigorosamente allo stesso tempo per facilitare la dissoluzione del SMCC in acqua. La concentrazione di sulfo-SMCC sarà 23 mM. Nota: Poiché l'estere NHS in sulfo-SMCC è soggetto a idrolisi e ha una durata di pochi minuti, questo passaggio dissoluzione dovrebbe essere completato entro 1 min per evitare un'eccessiva perdita dell'estere NHS a causa di idrolisi. Utilizzare acqua pura per sciogliere sulfo-SMCC perché la relativa solubilità in PBS o altri buffer è povero.</li>
			<li>Aggiungere 40 µ l di soluzione di sulfo-SMCC alla soluzione di2 RGD-NH 100 µ l e incubare per 20 minuti. Nota: L'estere NHS in sulfo-SMCC reagirà con il gruppo amminico in RGD-NH2, formando un legame dell'ammide che collega RGD e sulfo-SMCC.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Coniugato RGD-SMCC con il SH-ssDNA-quencher.<ol>
<li>Mescolare le soluzioni elaborate in punti 1.2.1 e 1.2.2 e incubare la miscela per 1 h a temperatura ambiente. Spostare la soluzione su un set di frigorifero a 4 ° C e lasciar reagire ulteriormente durante la notte. Il tiolo coniugato sul DNA strand superiore reagirà con maleimide su sulfo-SMCC, formando un gruppo tioetere che collega RGD con il filo superiore del DNA.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire la precipitazione dell'etanolo per purificare RGD-ssDNA-quencher da non reagito sulfo-SMCC, RGD e TCEP.<ol>
<li>Chill 10 mL di etanolo al 100% in una provetta conica da 15 mL in un congelatore a-20 ° C per almeno 30 min.</li>
			<li>Mescolare una soluzione di NaCl di M 3, una soluzione di DNA e refrigerato etanolo a un rapporto volumetrico di 01:10:25. Tenere il liquido misto in un congelatore di-20 ° C per 30 minuti o fino a quando il DNA è precipitato.</li>
			<li>Centrifugare il liquido a 10.000 x g per 30 min. eliminare il supernatante.</li>
			<li>Aggiungere PBS al pellet di DNA. Misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrometro.</li>
		</ol>
</li>
		<li>(Opzionale) Eseguire l'elettroforesi del DNA per ottenere una maggiore purezza di RGD-ssDNA. Nota: Con il protocollo di cui sopra, circa il 70 – 90% del ssDNA saranno coniugati con RGD. Se si desidera maggior purezza, elettroforesi del DNA può essere eseguita anche per separare il DNA coniugato dal DNA non coniugato.<ol>
<li>Assemblare un sistema di elettroforesi verticale.</li>
			<li>Preparare una soluzione di gel di poliacrilammide del 10% con 50 mL di acqua pura, 20 mL di gel dell'acrilamide 40%, 8 mL di tris-borato-EDTA (TBE) tampone 10x e 800 µ l di 10% ammonio persolfato (APS).</li>
			<li>Aggiungere 80 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione di gel. Versare la soluzione nella camera di vetro del sistema elettroforesi. Inserire un pettine di singolo-pozzo per creare un pozzo sulla superficie del gel. Attendere 10 minuti fino a quando il gel è reticolato.</li>
			<li>Miscelare la soluzione di DNA con glicerolo 100% con un rapporto di volume di 1:1. Togliere il pettine e caricare la soluzione di DNA al gel bene.</li>
			<li>Esegua il gel ad una tensione di 200 V. osservare due fasce del DNA in cui il lagging uno è il DNA coniugato.</li>
			<li>Tagliare la banda di gel con il DNA coniugato e tagliatela a dadini piccoli pezzetti.</li>
			<li>Raccogliere il gel a dadini in due provette da centrifuga da 1,5 mL con filtri. Aggiungere 500 µ l di PBS in ogni provetta.</li>
			<li>Mettere il gel PBS-imbevuto in un luogo buio a temperatura ambiente per 1 giorni. DNA si diffonderà fuori i pezzi di gel in PBS.</li>
			<li>Raccogliere la soluzione di DNA mediante centrifugazione le provette a 1.000 x g per 2 min.</li>
			<li>Eseguire un altro ciclo di precipitazione dell'etanolo (punto 1.2.4) per raccogliere il DNA.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizzare l'ITS di ibridare RGD-ssDNA-quencher e colorante-ssDNA-biotina.<ol>
<li>Mescolare le soluzioni del filo superiore e il filo inferiore DNAs con un rapporto molare di 1.1:1. Mantenere la miscela a 4 ° C durante la notte per produrre il suo tramite l'ibridazione del DNA. Nota: Un rapporto molare di 1.1:1 per l'ibridazione del DNA viene utilizzato invece di 1:1. Eccessiva RGD-ssDNA-quencher viene utilizzato per garantire che tutte le tinture-ssDNA-biotina sarà ibridare con RGD-ssDNA-quencher. RGD-ssDNA-quencher senza ibridazione saranno lavate durante il rivestimento superficiale, che non influirà sulla qualità del rivestimento superficiale di ITS.</li>
		<li>Aliquotare e conservare la soluzione ITS a-20 ° C per la conservazione a lungo termine. Nota: Il buffer di memoria è PBS e la concentrazione di deposito generalmente deve essere superiore a 10 µM. Per un uso regolare, la soluzione può essere conservata a 4 ° C per un paio di settimane senza deterioramento della qualità evidente.</li>
	</ol></li>
</ol>2. preparazione delle superfici da immobilizzare l'ITS su piastre di Petri con fondo di vetro
Nota: I reagenti impiegati sono biotinilati albumina di siero bovino (BSA-biotina), la proteina avidina e ITS. Chill tutti i reagenti e tampone PBS a circa 0 ° C sul ghiaccio con un secchio di ghiaccio.
<ol><li>Caricare 200 µ l di 0,1 mg/mL BSA-biotina in PBS sul pozzetto di una piastra Petri con fondo di vetro (29 mm di diametro, con ben 14 mm). Incubare per 30 min a 4 ° C in frigorifero. BSA-biotina è fisicamente adsorbita sulla superficie del vetro.</li>
	<li>Aspirare la soluzione dal bene utilizzando una pipetta e aggiungere 200 µ l di PBS torna al pozzo per lavare la superficie. Ripetere questo x 3 per completare il lavaggio.</li>
	<li>Incubare 200 µ l di proteina di avidina 50 µ g/mL nel pozzo per 30 min a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS. Dopo questo passaggio, la proteina avidina si lega a BSA-biotina e diventa immobilizzata sulla superficie del vetro.</li>
	<li>Incubare 200 µ l di 0,1 µM ITS nel pozzo per 30 min a 4 ° C. Lavare il piatto con 3 volte con PBS. Lasciare PBS nel pozzo fino la placcatura di cella. Dopo questo passaggio, l'ITS con l'etichetta di biotina si lega alla proteina avidina e diventa immobilizzato sulla superficie. Nota: Una precauzione critica per la sua qualità di rivestimento e omogeneità durante l'immobilizzazione di ITS è di non lasciare mai la superficie della piastra di Petri asciugare. Mantenendo tutti i reagenti e PBS a 4 ° C o 0 ° C sul ghiaccio con un secchiello per il ghiaccio aiuta a ridurre il tasso di evaporazione dell'acqua durante le fasi di lavaggio, quando PBS è tirato fuori dal pozzo.</li>
</ol>3. cellula placcatura sulle sue superfici
<ol><li>Cultura pesci keratocytes. Nota: Qui, ciprino dorato (Carassius auratus) viene utilizzato come un esempio, ma potrebbero funzionare anche altre specie di pesci.<ol>
<li>Strappare un pezzo di pesce scala da un pesce con una pinzetta piatto-punta. Spingere delicatamente la scala il pozzo di una capsula di Petri con fondo di vetro, con il lato interno della scala contattando il vetro. Attendere circa 30 s per la scala di pesce di aderire bene alla superficie del vetro del piatto.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di Iscove per volta medio (IMDM) completa medio di Dulbecco per coprire completamente la scala di pesce. Tenere la piastra di Petri in una scatola buia e umida per 6 – 48 h a temperatura ambiente. Nota: Terreno completo IMDM contiene 79% IMDM + 20% siero bovino fetale (FBS) + 1% di penicillina. Non è necessaria alcuna alimentazione supplementare di ossigeno o CO2 . Alcuni rotoli di carta velina, inumiditi con acqua e possono essere lasciati nella casella a mantenere alta umidità nella casella. Pesce keratocytes migrerà fuori la scala di pesce come un foglio delle cellule dopo poche ore. Questo può essere osservato con un microscopio di coltura del tessuto. Le cellule sono generalmente praticabile a 48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Staccare e le cellule di cheratociti su ITS superfici della lastra.<ol>
<li>Togliere il mezzo di Petri in cui la scala di pesce è stata coltivata. Lavare il bene 1x con cella disconnessione soluzione e aggiungere soluzione distaccante per coprire la scala di pesce ed incubare per 3 min. Nota: La ricetta per la cella disconnessione EDTA soluzione è la seguente: 100 mL di 10 x Hanks' bilanciato sale soluzione (HBSS) + 10 mL di 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL di bicarbonato di sodio 7,5% + 2,4 mL di 500 mM EDTA + 1 L di H2O. Il pH è regolato a 7,4.</li>
		<li>Aspirare tutti i cellulare disconnessione soluzione e aggiungere il terreno completo IMDM. Disperdere i cheratociti pipettando delicato. Regolare la densità della soluzione di cella al livello desiderato (1 x 104– 1 x 105/ml). Piastra le cellule sulla superficie ITS (preparato secondo la sezione 2). Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 min prima di formazione immagine. Nota: Conta cellulare può essere fatto con un emocitometro dopo lo scollegamento delle cellule con disconnessione soluzione. La cella placcatura densità è relativamente bassa, affinché i keratocytes hanno un sacco di superficie per la migrazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cellule di CHO-K1 piastra e cellule NIH 3T3 sulle sue superfici. Nota: Il supporto per le cellule di CHO-K1 è del 89% Ham F12 + 10% FBS + 1%, penicillina. Il mezzo per cellule NIH 3T3 è medio dell'Aquila di 89% Dulbecco modificato (DMEM) + 10% siero bovino di vitello (CBS) + 1% di penicillina. Le condizioni di coltura sono 37 ° C e 5% CO2.<ol>
<li>Cellule di CHO-K1 cultura o cellule NIH 3T3 alla confluenza di 80 – 100% in una capsula di Petri (o matraccio di cultura).</li>
		<li>Riscaldare la cellula lo scollegamento soluzione e terreno di coltura a 37 ° C.</li>
		<li>Rimuovere tutti i terreno di coltura di Petri con una pipetta. Lavare le cellule 1 x cella disconnessione soluzione. Coprire le cellule con disconnessione soluzione e incubare a 37 ° C per 10 min.</li>
		<li>Disperdere le cellule pipettando. Raccogliere la soluzione di cella ed e centrifugare a 300 x g per 3 min.</li>
		<li>Aspirare il supernatante e aggiungere terreno completo o medium senza siero.</li>
		<li>Regolare la densità della soluzione di cella al livello desiderato (1 x 105 – 1 x 106/ml). Piastra le cellule sulle superfici ITS (preparate secondo la sezione 2). Incubare le cellule a 37 ° C per 1 – 2 h prima di imaging, o 30 min prima della registrazione dei video.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. formazione immagine, registrazione video e in tempo reale delle integrine tensione mapping
<ol><li>
Quasi-Real-Time imaging di tensione delle integrine in cellule vive
	<ol>
<li>Incubare keratocytes sulle sue superfici (preparati conformemente al punto 2) per 30 min a temperatura ambiente, o incubare le cellule CHO-K1 o cellule NIH 3T3 per 1 h sulle sue superfici in un incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>Montare la piastra di Petri su una fase di microscopio di fluorescenza. Eseguire imaging cellulare forza con un tempo di esposizione di 1 s. L'ingrandimento è 40 x o x 100.</li>
		<li>Fare un video di sue immagini con un intervallo di fotogrammi di 20 s per keratocytes, o 1 – 2 min per cellule CHO-K1 o cellule NIH 3T3.</li>
		<li>È possibile utilizzare MATLAB o un altro strumento di analisi di immagine per sottrarre un fotogramma precedente del video ITS da un fotogramma corrente per calcolare il segnale ITS appena prodotto nell'ultimo intervallo di fotogrammi. Il segnale ITS recentemente prodotto rappresenta la tensione di integrina generata nell'ultimo intervallo di fotogrammi, quindi segnalazione la forza cellulare in maniera quasi-real-time.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coimaging di tensione di integrina e struttura cellulare in cellule immunostained
	<ol>
<li>Dopo passaggio 3.2.2 o 3.3.6, eseguire immunostaining per contrassegnare le proteine strutturali di destinazione. Nota: Utilizzare coloranti diversi per evitare il crosstalk fluorescenza tra integrina tensione imaging e formazione immagine strutturale delle cellule. In questo manoscritto, Cy5 fluoroforo è stato usato per falloidina e Alexa 488 è stato utilizzato per la colorazione del vinculin. Concentrazione di anticorpi primari e secondari è 2,5 µ g/mL. La concentrazione per la falloidina è di 1,5 unità / µ l.</li>
		<li>Eseguire multifluorescent canale imaging per acquisire una mappa tensione integrina e la formazione immagine strutturale delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Stick-Slip+Motion+Revealed+by+Opening+DNA+with+Piconewton+Forces%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces.</a> Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).</li>
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<li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+pull+out+force+on+DNA+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%E2%80%99Acad%C3%A9mie+des+Sciences+-+Series+IV+-+Physics%22%5BJournal%5D)">Maximum pull out force on DNA hybrids.</a> Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).</li>
<li>Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+the+shear+force+required+to+separate+short+double-stranded+DNA+does+not+increase+significantly+with+sequence+length+for+sequences+longer+than+25+base+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs.</a> Physical Review E. 78 (1), 011920(2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'ITS è un altamente accessibile ma potente tecnica per cellulare mappatura in termini sia di sintesi e di applicazione della forza. Tutti i materiali pronti, l'ITS può essere sintetizzato entro 1 giorno. Durante gli esperimenti, sono necessari solo tre passaggi di rivestimento superficiale prima della placcatura di cella. Recentemente, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura di rivestimento per un passo collegando direttamente il suo di albumina di siero bovino, che consente di adsorbimento fisico diretto dell'I...

Le cellule si basano sulle integrine di aderire ed esercitano forze cellulare alla matrice extracellulare. Trasmissione di adesione e forza di integrina-mediata delle cellule sono cruciali per cella diffusione1,2, migrazione3,4e sopravvivenza5,6,7. A lungo termine, integrina biomeccanico segnalazione influenza anche cellula proliferazione8,9,10 e differenziazione11,12. I ricercatori hanno sviluppato diversi metodi per misurare e cellulare di integrina-trasmessa mappa forze all'interfaccia cellula-matrice. Questi metodi sono basati su substrato elastico13, matrice di micropost14, o atomico forza microscopia (AFM)15,16. Elastico substrato e micropost metodi si basano sulla deformazione di substrati per segnalare lo stress cellulare e hanno limitazioni in termini di risoluzione spaziale e forzare la sensibilità. AFM ha forza elevata sensibilità, ma non può rilevare la forza in più punti contemporaneamente, rendendo difficile la mappa cellulare forza trasmessa da integrine.
Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate per studiare la forza cellulare a livello molecolare. Un insieme di sensori di tensione molecolare basato su polietilene glicole17,18, ragno seta peptide19e DNA20,21,22,23 sono stati sviluppati per visualizzare e monitorare la tensione trasmessa dalle proteine molecolari. Tra queste tecniche, DNA fu adottato come il materiale di sintesi nella tensione gauge tether (TGT), un linker rupturable che modula il limite superiore delle tensioni delle integrine in cellule vive22,24. Più tardi, tecnica di trasferimento di risonanza di fluorescenza e di DNA sono stati combinati per creare tornante sensori basati sul DNA fluorescente tensione prima gruppo23 di Chen e gruppo20 di Salaita. Il sensore di tensione basati sul DNA tornante segnala integrina tensione in tempo reale e ha applicato con successo per lo studio di una serie di funzioni cellulari21. In seguito, laboratorio di Wang combinato un TGT con la coppia di fluorophore-quencher per tensione di integrin di relazione. Questo sensore è denominato un ITS25,26. L'ITS è basato sul DNA a doppia elica (dsDNA) e ha una gamma dinamica più ampia (pN 10-60) per la calibrazione di tensionamento di integrina. A differenza dei sensori basati sul DNA di tornante, l'ITS non segnala forza cellulare in tempo reale ma registra tutti gli eventi di integrina storico come l'impronta della forza cellulare; Questo processo di accumulazione di segnale migliora la sensibilità per forza cellulare imaging, rendendo così possibile alla forza cellulare immagine anche con un microscopio a fluorescenza di fascia bassa. La sintesi dell'ITS è relativamente più conveniente in quanto è creato da ibridare due DNAs singola elica (ssDNA).
L'ITS è un dsDNA 18-base-accoppiato coniugato con biotina, un fluoroforo e un quencher (buco nero Quencher 2 [BHQ2])27un ciclico arginylglycylaspartic acido (RGD) peptide28 come un ligando di peptide integrina (Figura 1). Il filo inferiore è coniugato con il fluoroforo (Cy3 è usato in questo manoscritto, mentre altri coloranti, come serie di Cy5 o Alexa, inoltre sono stati dimostrati fattibile nel nostro laboratorio) e il tag di biotina, con cui l'ITS è immobilizzato su un substrato di legame biotina-avidina. Il filo superiore è coniugato con il peptide RGD e il Quencher di buco nero, che disseta Cy3 con circa 98% dissetante efficienza26,27. Con il protocollo presentato in questa carta, la densità di rivestimento dell'ITS su un substrato è circa 1.100/µm2. Questa è la densità che abbiamo precedentemente tarati per 18 bp biotinilati dsDNA rivestito sul substrato neutrAvidin-funzionalizzate seguendo lo stesso protocollo29del rivestimento. Quando le cellule aderiscono al substrato rivestito con l'ITS, integrina associa l'ITS attraverso RGD e trasmette tensione per l'ITS. L'ITS ha una tolleranza di tensione specifico (Ttol) che è definita come la soglia di tensione che separa meccanicamente il dsDNA dell'ITS entro 2 s22. SUA rottura da integrina tensione conduce alla separazione del quencher dal colorante che successivamente emette fluorescenza. Di conseguenza, la tensione di integrina invisibile viene convertita in un segnale di fluorescenza e la forza di cellulare possa essere mappata da formazione immagine di fluorescenza.
Per illustrare l'applicazione dell'ITS, utilizziamo pesce del keratocyte qui, un modello ampiamente usato cella per cella migrazione Studio30,31,32, CHO-K1 cellulare, una linea cellulare immobili comunemente utilizzati e dei fibroblasti NIH 3T3. Coimaging delle strutture di tensione e cella di integrina è anche condotto.

<table><tbody><tr><td>BSA-biotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>434301</td><td></td></tr><tr><td>filamento superiore DNA</td><td>Tecnologie DNA integrate</td><td>N/A</td><td>Progettato dal cliente. La sequenza del DNA è mostrata nella sezione PROTOCOLLO</td></tr><tr><td>filamento inferiore DNA</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>progettato dal cliente. Le sequenze di DNA sono mostrate nella sezione PROTOCOLLO.</td></tr><tr><td>sulfo-SMCC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A39268</td><td></td></tr><tr><td>Peptide ciclico RGD con un gruppo amminico</td><td>Peptidi Internazionale</td><td>PCI-3696-PI</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>ATCC</td><td>&lrm; </td><td></td>62996227</tr><tr><td>FBS</td><td>ATCC</td><td>302020</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina</td><td>gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td></td></tr><tr><td>200 uL piastra di Petri</td><td>Cellvis</td><td>D29-14-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Spettrometro N/A</td><td></td></tr><tr><td>SE410 Unità di elettroforesi proteica verticale raffreddata ad aria alta</td><td>Hoefer</td><td>SE410-15-1.5</td><td>Dispositivo per elettroporesi</td></tr><tr><td>Linea cellulare CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Linea cellulare NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-vincolina</td><td>EMD Millipore</td><td>90227</td><td>Anticorpo primario per l'immunocolorazione della vincolina</td></tr><tr><td>Anticorpo secondario superclonale IgG di capra (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A28175</td><td>Anticorpo secondario per l'immunocolorazione con vinculina</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Falloidina</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>microscopio</td></tr></tbody></table>

tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging

Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor

Molecolare tensione trasmessa dal ligando integrinico obbligazioni è il segnale meccanico fondamentale nella via dell'integrina che gioca un ruolo importante in molte funzioni cellulari e comportamenti. Per calibrare e integrina tensione della battuta con forza elevata sensibilità e risoluzione spaziale, abbiamo sviluppato un sensore di tensione integrativa (ITS), un sensore di tensione fluorescente basati sul DNA. L'ITS viene attivato per essere flourescente se sostenere una tensione molecolare, così convertire forza segnale fluorescente a livello molecolare. La soglia di tensione per l'attivazione di ITS è accordabile nell'intervallo di pN 10 – 60 che ben copre la gamma dinamica della tensione delle integrine in cellule. Su un substrato innestato con un ITS, la tensione di integrin di cellule aderenti è visualizzata tramite fluorescenza ed imaged a risoluzione di submicron. L'ITS è anche compatibile con formazione immagine strutturale delle cellule in cellule vive e cellule fissate. L'ITS è applicato con successo per lo studio della contrazione delle piastrine e migrazione cellulare. Questa carta in dettaglio la procedura per la sintesi e l'applicazione dell'ITS nello studio della forza cellulare integrina-trasmessa.

Con l'ITS, la mappa di tensione integrina dei keratocytes di pesce è stata catturata. Dimostra che un keratocyte migra e genera tensione integrina alle due tracce di forza (Figura 2A). La risoluzione della mappa forza è stata calibrata per essere 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensione si concentra sul margine posteriore (Figura 3A). L'ITS Mostra anche diversi modelli specifici di cellule diverse...

Tensione di integrina svolge i ruoli importanti in varie funzioni cellulari. Con un sensore di tensione integrativa, integrina tensione è calibrato con sensibilità picoNewton (pN) e ripreso a risoluzione di submicron.

Tensione di integrina e cellulare forza alla risoluzione di Submicron con un sensore di tensione integrativa di imaging

Molecular tension transmitted by integrin-ligand bonds is the fundamental mechanical signal in the integrin pathway that plays significant roles in many ...

Questo sensore di tensione integrativa basato sul DNA, o ITS, che converte il segnale di forza in fluorescenza localmente consente l'imaging diretto della forza cellulare con microscopia a fluorescenza. Its ha un'alta risoluzione spaziale e un'alta sensibilità. La soglia di attivazione è tonnibile, consentendo un'immagine selettiva della tensione dell'integrina a diversi livelli.Dopo aver ricevuto il DNA a singolo filamento personalizzato, o ssDNA, di interesse, per coniugare il peptide RGD al quencher di ssDNA tiolato, aggiungere prima 100 microlitri di EDTA 0,5 molare in 400 microlitri di acqua a circa 450 microlitri di soluzione TCEP appena preparata. Quindi, aggiungere 10 microlitri della soluzione TCEP-EDTA a 20 microlitri di quencher di DNA tiolo millimolare in PBS per un'incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente. Per coniugare l'ammina RGD con sulfo-SMCC, aggiungere 40 microlitri di solfato-SMCC da 23 millimolare appena preparato a 100 microlitri di soluzione di ammina RGD da 11 millimolare preparata al momento per un'incubazione di 20 minuti a temperatura ambiente.Per coniugare l'ammina RGD SMCC con il quencher di ssDNA tiolato, mescolare l'intero volume della soluzione di quencher di ssDNA tiolata con l'intero volume della soluzione SMCC di ammina RGD per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, trasferire la soluzione allo stoccaggio di quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina dopo, mescolare il cloruro di sodio trimolare con la soluzione di DNA coniugato al tiolo e meno 20 gradi Celsius, refrigerato, 100% etanolo con un rapporto uno-10-25, e posizionare la reazione a meno 20 gradi Celsius per circa 30 minuti.Quando il DNA è precipitato, raccogliere il DNA per centrifugazione e rimescolare il pellet nel PBS per misurare la concentrazione di DNA su uno spettrometro. Per la sintesi del sensore di tensione integrativo, o ITS, mescolare le soluzioni di DNA a filamento superiore e inferiore a un rapporto 1,1-molare e incubare la reazione durante la notte a quattro gradi Celsius prima di posizionare aliquote della miscela a meno 20 gradi Celsius per lo stoccaggio a lungo termine. Per l'immobilizzazione ITS, rivestire una piastra di Petri con fondo di vetro di 29 millimetri di diametro con 200 microlitri di albumina di siero bovino biotinilata da 0,1 milligrammi per millilitro, o BSA-biotina, per 30 minuti a quattro gradi Celsius.Quando la BSA-biotina si è fisicamente assorbita sulla superficie del vetro, lavare il piatto tre volte con 200 microlitri di PBS fresco per lavaggio, seguito da incubazione con 200 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di proteina avidina per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il piatto tre volte con PBS come dimostrato e aggiungere 200 microlitri di ITS 0,1 micromolare per un'altra incubazione di 30 minuti a quattro gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, lavare il piatto tre volte con PBS, lasciando l'ultimo lavaggio nel piatto fino alla placcatura cellulare.Per avviare una coltura di cheratociti di pesce, utilizzare una pinzetta a punta piatta per strappare un pezzo di scala da un pesce e premere delicatamente la bilancia sul pozzo di una piastra di Petri con fondo di vetro non modificato, con il lato interno della bilancia che contatta il vetro. Attendere circa 30 secondi affinché la scala del pesce aderisca alla superficie in vetro del piatto prima di coprire la bilancia con un millimetro di mezzo dulbecco modificato completo di Iscove. Quindi, incubare la bilancia in una scatola scura e umida per sei-48 ore a temperatura ambiente.Per placcare i cheratociti sulla superficie ITS, sostituire il mezzo dal piatto di coltura del cheratocita con una soluzione di staccamento cellulare 1X per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di distacco con un mezzo fresco e completo e dissociare le cellule con una tubazione delicata. Quindi, regolare le cellule alla concentrazione appropriata per la placcatura e seminarle sul piatto rivestito ITS per 30 minuti a temperatura ambiente prima dell'imaging.Per l'imaging della tensione dell'integrina quasi in tempo reale nelle cellule vive, trasferire le cellule allo stadio di un microscopio a fluorescenza e selezionare l'obiettivo 40 o 100 volte. Nel software di imaging, impostare il tempo di esposizione su un secondo e l'intervallo di fotogrammi di 20 secondi per ottenere un video delle immagini ITS. Quindi, utilizzare un programma software di analisi delle immagini appropriato per sottrarre un fotogramma precedente del video ITS da un fotogramma corrente per calcolare il segnale ITS appena prodotto nell'ultimo intervallo di fotogrammi.Il segnale ITS di nuova produzione rappresenta la tensione di integrina generata nell'ultimo intervallo di fotogrammi, segnalando così la forza cellulare in modo quasi in tempo reale. Qui, la mappatura della tensione dell'integrina dimostra l'induzione della tensione dell'integrina in due tracce di forza durante la migrazione dei cheratociti. La risoluzione della mappa di forza potrebbe quindi essere calibrata per essere di 0,4 micrometri.L'alta tensione dell'integrina si concentra sul margine posteriore nei cheratociti di pesce motile. Nelle cellule nonmotili si forma uno specifico schema di tensione dell'integrina che è molto diverso da quello osservato nel cheratocita migratore veloce. Le aderenze focali e la tensione dell'integrina dei cheratociti di pesce possono essere co-immagini per valutare la relazione tra tensione dell'integrina e struttura cellulare nelle cellule di interesse.Con l'ITS, la forza di adesione cellulare diventa visibile con una risoluzione e una sensibilità paragonabile all'imaging strutturale cellulare. Questa tecnica apre la strada allo studio di un'interazione forza-struttura nelle cellule.

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Recentemente sono stati sviluppati numerosi biosensori di forza basati su FRET, che consentono la risoluzione proteina-specifica della forza intracellulare. In questo protocollo, dimostriamo come uno di questi sensori, progettato per il linker della proteina del complesso nucleoscheletro-citoscheletro (LINC) Nesprin-2G, possa essere utilizzato per misurare le forze di actomiosina sul complesso nucleare LINC.

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