Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con Bioprinter fai da te

La biostampa 3D con batteri è una tecnica di nuova sviluppo. Questo protocollo fornisce un modo semplice per costruire biofilm ingegnerizzati stampati in 3D con batteri. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di produrre biofilm stampati in 3D utilizzando una stampante 3D costruita in casa economica.

Una possibile applicazione della nostra stampante 3D è quella di creare biofilm modello riproducibili che possono essere utilizzati per sviluppare nuove terapie antibatteriche. Il nostro approccio di stampa 3D può essere applicato a qualsiasi tipo di batterio compatibile con il nostro bioink a base di alginato. La preparazione del bioink e dei substrati di stampa sono procedure abbastanza standard, mentre il processo di stampa 3D, in particolare la calibrazione dell'asse Z è un passaggio cruciale che richiede una certa pratica.

La calibrazione dell'altezza di accesso impostata influenzerà la risoluzione della nostra stampante 3D e dipende fortemente dall'esperienza personale. Questa procedura richiede regolazioni manuali ed è difficile da descrivere in un formato scritto. Collegare una punta di pipetta da 200 microliter a una lunghezza di tubi in silicone e montare la punta della pipetta sulla testa dell'estrusore della stampante 3D in sostituzione dell'estrusore originale.

Successivamente, aggiungere quattro millilitri di una soluzione di cloruro di calcio molare a 400 millilitri di 1%agar sciolti nel brodo di Luria-Bertani e integrarlo con gli antibiotici e gli induttori appropriati. Quindi, erogare 20 millilitri della soluzione di agar LB in ogni piastra di Petri da 150 millimetri per 15 millimetri. Asciugare il piatto per 30 minuti a temperatura ambiente, con il coperchio semiaproto.

Preparare una soluzione di alginato di sodio al 3% e scaldarla al punto di ebollizione tre volte per sterilizzare la soluzione. Quindi, conservare la soluzione sterile a quattro gradi Celsius fino a quando non viene utilizzata. Per preparare la componente batterica del bioink, far crescere i batteri E.coli che trasportano plasmidi per l'espressione costitutiva della GFP in 50 millilitri di mezzo LB contenenti antibiotici.

Scuoti la cultura a 250 giri/min e 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo la crescita notturna della coltura, pellet i batteri per cinque minuti a 3.220 volte la gravità e quindi rimuovere il supernatante. Resuspend il pellet batterico in 10 millilitri di mezzo LB e aggiungere 10 millilitri di alginato di sodio al 3%.

Collegare la stampante 3D a un computer e aprire il software di stampa 3D. Fare clic sul pulsante Home per gli assi X, Y e Z per spostare la testina di stampa nella posizione iniziale. Per ogni stampa, posizionare un substrato di stampa preparato su una particolare posizione sul letto di stampa.

Sollevare la testina di stampa a un'altezza di oltre 22 millimetri sotto controllo manuale, in modo che non si scontri con il bordo della piastra di Petri durante il movimento. Posizionare la testina di stampa sopra la parte superiore della piastra e spostarla verso il basso fino a quando la punta della pipetta non contatta la superficie di stampa. Assegnate questa posizione dell'asse Z come Z1, l'altezza della superficie di stampa.

Quindi, sollevare la testina di stampa e spostarla manualmente all'esterno dell'area della piastra. Se la distanza di lavoro tra la testina di stampa e la superficie della lastra è definita come Z2, immettere l'altezza della superficie di stampa più la distanza di lavoro nel programma di stampa come valore Z durante la stampa. Caricare un file di codice G pre-programmato contenente i comandi per la stampa della forma desiderata.

Ad ogni riga di comando, la posizione della testina di stampa può essere modificata negli assi X, Y e Z. Assicurarsi di inserire il valore Z durante tutti i passaggi di stampa come altezza della superficie di stampa più la distanza di lavoro. Caricare il bioink liquido nelle siringhe e montarlo nella pompa della siringa del biostampa 3D.

Quindi, impostare la velocità di estrusione su 0,3 millilitri all'ora. Stampare il bioink sul substrato di stampa facendo clic sul pulsante Stampa. Attendere l'avvio della pompa della siringa fino a quando la stampa non è iniziata e prima che la testina di stampa venga a contatto con la superficie di stampa.

Durante la stampa, controllare completamente il movimento della testina di stampa da parte del software. Arrestare la pompa della siringa non appena la testina di stampa arriva all'ultimo punto di stampa, altrimenti il bioink in eccesso scenderà sul substrato di stampa e ridurrà la risoluzione di stampa. Per la costruzione di strutture 3D, tutti i movimenti della testina di stampa sono controllati nell'editor del codice G.

Per aumentare l'altezza di stampa per il secondo livello, digitare l'altezza di stampa del primo livello e aumentare il valore Z nel codice di 0,2 millimetri. Successivamente, aumentare il valore Z di 0,1 millimetri, quando ci si sposta su uno strato superiore. Incubare i campioni stampati a temperatura ambiente per tre o sei giorni per consentire la produzione dei componenti del biofilm come le fibre di Curli.

Quindi, posizionare la piastra su uno scanner fluorescente e immagini le piastre. Per sciogliere la matrice di alginato, aggiungere 20 millilitri di una soluzione di citrato di sodio molare 0,5 a pH 7, al substrato stampato. Incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore tremando a 30 giri/min.

Quindi, scartare il liquido e immaginere nuovamente le piastre, da confrontare con le immagini delle piastre prima e dopo il trattamento del citrato. Il biostampa 3D può creare batteri che incapsulano idrogel in una varietà di forme bidimensionali e tridimensionali. Queste forme stampate possono quindi essere utilizzate per valutare se la formazione di biofilm ha avuto successo o se la matrice di alginato è completamente sciolta usando una soluzione di citrato di sodio.

Nel caso del bioink senza il plasmide di produzione curli inducibile, il motivo stampato è stato completamente sciolto dopo il trattamento con citrato di sodio, a significare che non si era formata alcuna rete di biofilm Curli. I batteri contenenti il plasmide di produzione curli induttibile non sono stati sciolti dopo il trattamento con citrato di sodio, indicando che i batteri stampati erano in grado di formare una rete Curli abbastanza estesa da stabilizzare il modello stampato di batteri. Per costruire strutture multistrato, è possibile stampare livelli aggiuntivi controllando l'editor del codice G.

L'aumento del numero di livelli stampati in un campione ha causato un aumento incrementale della larghezza e dell'altezza delle strutture stampate. Quando E.coli ingegnerizzava per produrre induttibilmente proteine Curli furono stampate in strutture multistrato, il trattamento con citrato di sodio non dissolse i campioni, mentre le strutture multistrato contenenti E.coli non produttori di Curli furono sciolte. Le parti più critiche della procedura di stampa 3D sono la calibrazione dell'asse Z e la coordinazione dell'avvio della stampa e dell'avvio della pompa della siringa.

Il bioink sviluppato per questo processo è abbastanza morbido, con bassa tenacità. Ulteriori modifiche potrebbero essere apportate al bioink, al fine di fornire e migliorare la stabilità meccanica. Questa tecnica di stampa 3D consente la produzione di biofilm con eccellenti proprietà meccaniche, che possono consentire la fabbricazione di materiali biomimetici.

Quando si maneggiano questi batteri, indossare una protezione adeguata, come i guanti.