Name: Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Scopri come generare idrogel 3D a base di collagene per studiare la guida assonale e la migrazione neuronale durante lo sviluppo del sistema nervoso. Questo metodo utilizza cellule COS-1 transfected e tessuto cerebrale di ratto embrionale.

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Gli autori ringraziano Tom Yohannan per la consulenza editoriale e M. Segura-Feliu per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal programma CERCA e dalla Commissione per le Università e la Ricerca del Dipartimento di Innovazione, Università ed Impresa della Generalitat de Catalunya (SGR2017-648). Questo lavoro è stato finanziato dal Ministero spagnolo della ricerca, dell'innovazione e dell'Università (MEICO) attraverso BFU2015-67777-R e rti2018-099773-B-100, la rete prione spagnola (Prionet Spagna AGL2017-90665-REDT), e l'Istituto Carlos III, CIBERNED ( PRY-2018-2).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati secondo le linee guida e i protocolli del Comitato Etico per la sperimentazione animale (CEEA) dell'Università di Barcellona, e il protocollo per l'uso dei roditori in questo studio è stato rivisto e approvato dalla CEEA del Università di Barcellona (approvazione CEEA #276/16 e 141/15).
1. Purificazione del collagene coda di ratto
<ol><li>Raccogli le code di ratto Sprague-Dawley adulti (8-9 settimane) dopo aver sacrificato l'animale seguendo le linee guida etiche e risciacqualo nel 95% di etanolo. Mettere 2-4 code sul ghiaccio (4 gradi centigradi) e tenerle coperte di ghiaccio durante il processo.</li>
	<li>Per ottenere i tendini della coda, fissare la coda alle vertebre più caudali della coda utilizzando un emostatore e comprimere la coda con un secondo emostatorio posizionato intorno a 5-7 mm dal primo. Rompere la coda torcendola bruscamente con entrambi gli hemostats. Per fare questo, piegare / aprire le vertebre più volte fino a quando non si rompe.</li>
	<li>Tirare le vertebre lentamente con l'emotoma per staccare i tendini dalla loro guaina come esce. In questo momento, tagliare i tendini con piccole forbici. Conservare questi pezzi di tendine in una parabola Petri sterile da 100 mm sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere la serlatura e lo scorrimento per il resto della coda fino a quando i tendini sono completamente estratti.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 1.2-1.4 per tutte le code ottenute.</li>
	<li>Osservare i tendini al microscopio. Scartare i vasi sanguigni tagliando con piccole forbici e tenendo con pinze fini dritte per migliorare la purezza del tendine e risciacquare i tendini 3 volte con acqua ultrapura.</li>
	<li>Raccogliere 3-4 g di tendini bagnati. Sciogliere i tendini in 150 mL di 3% di acido acetico glaciale a 4 gradi centigradi in una fiaschetta conica di vetro da 200-250 mL per 24-36 h, sotto agitazione delicata.</li>
	<li>Centrifuga a 20.000 x g per 1 h. Parallelamente, preparare la membrana del tubo di dialisi tagliando un pezzo di circa 10-15 cm di lunghezza e farla bollire in acqua ultrapura contenente 1 mM di acido etilenediaminetraatico (EDTA) per 15 min. Successivamente, sciacquare delicatamente la membrana di dialisi accuratamente con acqua ultrapura.</li>
	<li>Dopo la centrifuga, raccogliere il supernatante nella membrana di tubazione di dialisi per decantazione. Il pellet contiene materiale acido insolubile (proteine non collagenose) e il supernatante contiene proteine di collagene solubili.</li>
	<li>Diallyze il supernatante contro 2 L di sterile 0.1x Minimo Essenziale Medio Aquila (MEM), pH 4.0 in un bicchiere di vetro da 2-5 L. Dialyze per 3 giorni. Modificare la soluzione MEM 0,1x almeno due volte al giorno controllando il pH ad ogni modifica prima dell'uso. Se il pH è diventato di base, modificarlo con qualche goccia di acido acetico 0,1 M fino a 4,0.</li>
	<li>Dopo la dialisi, aggiungere antibiotici (1,5 mL di penicillina/streptomicina (Pen-Strep)) alla soluzione di collagene dializzato. Fare 5 aliquote mL della soluzione di brodo di collagene e conservare a 4 gradi centigradi. NOT:</</c1> Da questo punto, tutte le procedure di movimentazione devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di flusso laminare.</li>
	<li>
Procedere con il test di gelazione della soluzione di brodo di collagene preparato seguendo i passaggi successivi.
	<ol>
<li>Poiché il collagene di stock è solitamente troppo concentrato, preparare 3 diluizioni di lavoro (75%, 50% e 25% soluzione di collagene) diluindo lo stock in 0.1x MEM, pH 4.0. Il volume finale consigliato per ogni diluizione di lavoro è di 5 mL. In ogni condizione, controllare la concentrazione proteica utilizzando un saggio colorimetrico della proteina.</li>
		<li>Posizionare diversi tubi di centrifuga conicali da 1,5 ml vuoti (uno per ogni diluizione di lavoro), 10 volte tubi MEM, soluzione di bicarbonato di sodio 7,5% e diverse diluizioni di lavoro di collagene sul ghiaccio. Attendere che questi siano raffreddati.</li>
		<li>Aggiungete 40-50 l una di 10 volte il MEM ad un tubo di centrifuga freddo (4 gradi centigradi). Successivamente, mescolare delicatamente con 7-8 - L di soluzione di bicarbonato di sodio.</li>
		<li>Aggiungere 310-330 l di uno dei diversi diluizioni di collagene in questo tubo e mescolare delicatamente con la pipetta evitando qualsiasi formazione di bolle. Conservare la miscela di bicarbonato di collagene-MEM-sodio sul ghiaccio (4 gradi centigradi) per almeno 5 min.</li>
		<li>Pipetta 10-25 - L della miscela in una piastra Petri da 35 mm.</li>
		<li>Collocare la parabola Petri nell'incubatrice di CO2 fissata a 37 gradi centigradi fino a quando non si osserva la gelata dell'idrogel (15-20 min).</li>
		<li>Ripetere i passaggi da 1.12.3-1.12.6 per le restanti diluizioni di collagene in diversi piatti Petri.</li>
		<li>Selezionare la diluizione di lavoro collagene che rende i migliori risultati. NOT:</</c5> Il miglior idrogel gelato dovrebbe avere una texture traslucida uniforme, colore grigio e non deve essere grumoso o filante. Nella nostra esperienza, una diluizione di 3:1 (Collagen: 0.1x MEM) genera i migliori risultati sperimentali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparazione delle cellule (COS1) Aggrega geneticamente modificata per secernere una molecola candidata in idrogel di collagene 3-D
<ol><li>Piastra 2 x 106 cellule COS1 in un piatto Petri 35 mm e incubare con mezzo di coltura completo composto da 100 mL di D-MEM contenente 10% (vol/vol) siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,5% (wt/vol) glutammina e 1% (wt/vol) Pen/Strep in una coltura cellulare incubatrice, al fine di raggiungere 70-80% confluenza durante la notte. Preparare una piastra Petri per ogni procedura di trasfezione.</li>
	<li>
Il giorno seguente trasfecare le cellule COS1 con il DNA che codifica la molecola candidata (Netrin-1 o Sema3E) utilizzando il metodo di trasfezione a base di liposoma seguendo le istruzioni del produttore.
	<ol>
<li>Per fare questo, mescolare 250 l di mezzo senza siero e DNA (1-2 g per condizione) in un tubo di centrifuga di 1,5 mL (tubo di DNA) e mescolare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min. Preparare un secondo tubo (tubo liposomico) aggiungendo 240 L del mezzo senza siero e 10 L del reagente di trasfezione liposomica. Incubare a RT per 5 min.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, aggiungere il contenuto del tubo del DNA al tubo liposomico e mescolare delicatamente. Ora incubare a RT per 15 min. Sostituire il mezzo sulle cellule coltivate con 1,5 mL del mezzo senza siero e aggiungere la miscela di DNA-liposomi al piatto Petri lentamente goccia. Incubare per 3 h nell'incubatore di coltura cellulare CO 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo 3 h di incubazione trasfezione, sostituire il mezzo con il mezzo di coltura completo e incubare durante la notte nell'incubatrice.</li>
	<li>Il giorno successivo, sciacquare le cellule con 0,1 M di Soffato bufferizzato salina (D-PBS), trattare le colture con Trypsin-EDTA (800 dollari per ogni piatto per 5-15 min nell'incubatrice di CO 2) e raccogliere le cellule staccate con 15 mL di mezzo di coltura completo.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 4 gradi centigradi a 130 x g per 5 min. Dopo la centrifuga, rimuovere i supporti e conservare il pellet contenente le cellule COS1 sul ghiaccio.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 1.12.3-1.12.6 per preparare la miscela di lavoro del collagene.</li>
	<li>Aggiungete 100-150 l di miscela di collagene al pellet delle cellule trasfetate e mescolate delicatamente pipetting su e giù e stendete 45-50 l di questa miscela su una piastra Petri (di35 mm di diametro) per formare una banda uniforme di collagene di circa 1-1,5 cm di lunghezza. Collocare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi centigradi (5% CO2) fino a quando non si osserva la gelazione (15-20 min).</li>
	<li>Preparare una seconda striscia contenente le celle di controllo (trasfezione simulata) in una seconda parabola di coltura e piattarlo nell'incubatrice (15-20 min) e quando la gelazione è completata aggiungere 3-4 mL di misura di coltura completa cos1 riscaldata (37 gradi centigradi) ad ogni piatto contenente il piatto gelledo strisce di cellule di collagene e tenerli nell'incubatore di coltura cellulare CO 2. Successivamente, tagliare le strisce di collagene-cellule per generare piccoli pezzi quadrati (400 a 500 m di lunghezza) utilizzando un bisturi fine o un chopper di tessuto.</li>
	<li>Trasferire tutte le sezioni dalla stessa condizione di trasfezione a una parabola Petri contenente 3-3,5 mL di mezzi di coltura neuronale (NCM) e controllare sotto un microscopio di dissezione la qualità dei pezzi. Ancora una volta, tenerli nell'incubatore di coltura cellulare CO 2. NOT:</</c9> Il mezzo di coltura neuronale è costituito da un mezzo Neurobasal contenente 1-5% (vol/vol) di siero di cavallo inattivato dal calore, 2 mM glutammina, 0,5% di glucosio (wt/vol), soluzione Pen-Strep (wt/vol) e 0,044% (wt/vol) NaHCO3. Assicurarsi che il pH sia compreso tra 7,2 e 7,3.</li>
</ol>3. Generazione di espiante embrionali per la cultura
<ol><li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, maniglia della lama del bisturi, pinze dritte e curve) automatizzando seguendo le linee guida di sterilizzazione di routine. In parallelo preparare 500 mL del buffer di glucosio bilanciato della soluzione sale di Hank e 4-5 piatti Petri (100 mm di diametro) contenenti 10 mL di HBSS-G. Collocare queste piastre sul ghiaccio (4 gradi centigradi).</li>
	<li>Sacrificare il ratto femminile incinta (giorno embrionale 16.5) al di fuori dell'area sterile, seguendo le procedure etiche approvate. Tagliare le corna degli embrioni con le forbici dalla cavità addominale e metterle in una grande tegame Petri contenente HBSS-G freddo.</li>
	<li>Posizionare il piatto nel cofano a flusso laminare ed estrarre gli embrioni con pinze dritte. Metteteli in un nuovo piatto contenente HBSS-G freddo. Successivamente, rimuovere la pelle dell'embrione utilizzando piccole pinze e sezionare attentamente il cervello utilizzando le pinze curve e dritte. Metteteli in un piatto contenente HBSS-G freddo.</li>
	<li>Sotto un microscopio dissecinte, tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana per separare entrambi gli emisferi con il bisturi o forbici sottili e rimuovere il diencefalo, le meningi e i vasi sanguigni dai pezzi cerebrali con pinze sottili.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3,3 a 3,4 con il resto degli embrioni. Non ritardare la dissezione per più di 2 h per preservare la qualità del tessuto.</li>
	<li>Pulire tutte le parti dell'elicottero tissutale con la piastra di taglio 100% etanolo (soprattutto la piastra di taglio in politetrafluoroetilene (PTFE) e la lama del rasoio. Mantenere l'elicottero dei tessuti nel cappuccio del flusso laminare sotto illuminazione UV per 15 min.</li>
	<li>Trasferire ogni pezzo di tessuto (ad esempio, corteccia con ippocampo) alla piastra di taglio dell'elicottero di tessuto. Per l'ippocampo, posizionarlo perpendicolare alla lama del rasoio e ottenere sezioni di tessuto di 450-500 m di spessore.</li>
	<li>Preparare diversi piatti Petri da 35 mm con 3-4 mL di NCM completo e trasferire pezzi di tessuto dal piatto di tessuto chopper ai piatti Petri. Molti piatti possono essere necessari come regioni di interesse sono sezionati.</li>
	<li>Finire la dissezione dei tessuti nel NCM completo utilizzando aghi di tungsteno fini. Controllare la qualità delle fette ottenute al microscopio sezionato. Assicurarsi che gli strati siano chiaramente identificabili nell'ottica del campo scuro e sezionare la regione di interesse (ad esempio, la regione CA dell'ippocampo) con aghi di tungsteno. Eliminare le fette danneggiate. Conservare gli espianti ippocampali in un supporto NCM completo nell'incubatrice di CO 2.</li>
</ol>4. Preparazione di coculture 3D in idrogel di collagene
<ol><li>Mettere diverse piastre di coltura sterili a 4 pozze nella cappa di flusso laminare e preparare una miscela di lavoro di collagene come indicato in precedenza nei passaggi 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Collocare 15-20 l della miscela di idrogel sul fondo di un pozzo per produrre una base circolare di collagene. Ripetere questo passaggio per il resto dei pozzetto. Non preparare più di cinque piastre contemporaneamente per evitare un'eccessiva evaporazione liquida dalla base idrogel.</li>
	<li>Conservare i piatti nell'incubatrice fino a quando non viene osservata la gelazione completa (15-20 min) e togliere i piatti dall'incubatrice solo quando la gelazione è completata. Controllare la qualità del collagene gelificato.</li>
	<li>Trasferire un piccolo pezzo di aggregato di cellule COS1 con una pipetta. Posizionarlo sulla base idrogel e posizionare un pezzo di tessuto sulla stessa base con una pipetta vicino al pezzo di cellule aggregate in una dimensione di explant.</li>
	<li>Preparare una nuova miscela di collagene funzionante sul ghiaccio come nei passi 1.12.2-1.12.6.</li>
	<li>Delicatamente pipetta 15-20 - L di questa nuova miscela e coprire l'espianto e l'aggregato cellulare. Si osserverà una coltura di idrogel simile a un sandwich. In questo momento, riorientare l'espianto con un ago di tungsteno fine (non toccare l'aggregazione di celle COS1!), in modo che si trovi di fronte all'aggregato cellulare a 500-600 m.</li>
	<li>Riportare la piastra all'incubatrice fino a quando non si osserva la gelazione (10-15 min) e 0,5 mL di NCM completo integrato con 2% supplemento B27 e mantenere le colture per 36 a 48 h nell'incubatrice (37 , 5% CO2).</li>
</ol>5. Fissazione delle cocolture aggregate delle cellule espiantate e della procedura immunocitochimica
<ol><li>Dopo 36-48 h di incubazione, rimuovere il mezzo e risciacquare con 0,1 M fosfato buffered salina (PBS), pH 7.3. Successivamente, fissare le colture per 1 h con 4% paraformaldeide in buffer di fosfato da 0,1 M (PB), pH 7,3, a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Rimuovere il fissativo e sciacquare delicatamente le colture 3-4 volte (10-15 min ciascuna) in 0,1 M PB, pH 7.3.</li>
	<li>Staccare il panino idrogel dal fondo del pozzo con spatola o pinze. Trasferire il blocco di collagene con un pennello fine in una piastra di coltura a 6 piani contenente 0,1 M PBS con detergente non ionico dello 0,5%.</li>
	<li>Incubare idrogel galleggianti nella soluzione di blocco (10% siero, 0,5% surfactant non ionico e 0,2% gelatina in 0,1 M PBS) per 2-3 h a RT con agitazione delicata.</li>
	<li>Risciacquare 3 volte (10-15 min ciascuna) con 0,1 M PBS contenente lo 0,5% di sovrapfattimento non ionico.</li>
	<li>Incubazione con anticorpo primario diluito in PBS contenente 5% siero, 0.5% surfactant non-ionico, 0.2% gelatina, e 0.02% azide di sodio. Incubare con l'anticorpo primario per 36-48 h a 4 gradi centigradi su uno shaker. NOT:</</c0> Di solito un anticorpo contro la classe III tubulina (z-TUJ-1) (diluito 1:2,000) viene utilizzato per definire la crescita assonale nelle colture di idrogel 3D.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, risciacquare come nel punto 5.5.</li>
	<li>Incubare con anticorpo secondario per 4 h a RT (o 6-7 h a 4 gradi centigradi) su uno shaker diluito nel 5% di siero, 0,5% surfactant non-ionico e 0,2% gelatina. In questo esperimento viene utilizzato un anticorpo biotinylato antito-toepe (diluito 1:200) di cavallo.</li>
	<li>Risciacquare le culture come in 5.5.</li>
	<li>Incubare le colture per 2 giorni a 4 gradi centigradi con la soluzione complessa avidina-biotina (ABC) 1:100 diluita in PBS contenente il 5% di siero, lo 0,5% di surfactant non ionico e lo 0,2% di gelatina. In alternativa, utilizzare lo streptavidina con etichetta di rafano (HRP) (diluito 1:300-400) nello stesso buffer.</li>
	<li>Risciacquare le culture come descritto in 5.5.</li>
	<li>Risciacquare le colture più volte con buffer Tris-HCl da 0,1 M, pH 7,6 per 1 h.</li>
	<li>Incubare le colture con lo 0,03% della soluzione DAB (3,3-Diaminobenzidine tetraidrocchiride) in 0,1 M Tris-HCl, pH 7,6.</li>
	<li>Aggiungere 5-8 luna di 1% H2O2 e attendere 10-15 min. Monitorare lo sviluppo del DAB al microscopio utilizzando un obiettivo 4-10x.</li>
	<li>Interrompere la reazione rimuovendo la soluzione DAB con buffer Tris-HCl da 0,1 M, pH 7.6.</li>
	<li>Risciacquare le colture in PBS per 30 min (diversi cambiamenti).</li>
	<li>Montare gli idrogel su vetrini di vetro utilizzando un supporto di montaggio acquoso.</li>
	<li>Analizzare la lunghezza e la distribuzione degli assoni all'interno dell'idrogel utilizzando Sholl analysis plug-in o con NeuriteJ plug-in per il software ImageJ30.</li>
</ol>

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<li>Eyre, D. R., Weis, M., Hudson, D. M., Wu, J. J., Kim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-hydroxyproline+%283Hyp%29-rich+motif+marks+the+triple-helical+C+terminus+of+tendon+type+I+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel 3-hydroxyproline (3Hyp)-rich motif marks the triple-helical C terminus of tendon type I collagen.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (10), 7732-7736 (2011).</li>
<li>Garnotel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+blood+monocytes+interact+with+type+I+collagen+through+alpha+x+beta+2+integrin+%28CD11c-CD18%2C+gp150-95%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human blood monocytes interact with type I collagen through alpha x beta 2 integrin (CD11c-CD18, gp150-95).</a> Journal of Immunology. 164 (11), 5928-5934 (2000).</li>
<li>Montolio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semaphorin+3A+inhibitor+blocks+axonal+chemorepulsion+and+enhances+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A semaphorin 3A inhibitor blocks axonal chemorepulsion and enhances axon regeneration.</a> Chemistry and Biology. 16 (7), 691-701 (2009).</li>
<li>Garcia-Gareta, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+gels+and+the+%27Bornstein+legacy%27%3A+from+a+substrate+for+tissue+culture+to+cell+culture+systems+and+biomaterials+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Collagen gels and the 'Bornstein legacy': from a substrate for tissue culture to cell culture systems and biomaterials for tissue regeneration.</a> Experimental Dermatology. 23 (7), 473-474 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La crescita degli assoni in via di sviluppo è principalmente invasiva e comprende la degradazione e il rimodellamento dell'ECM. Utilizzando la procedura qui presentata, i ricercatori possono ottenere una matrice omogenea 3D formata dal collagene di tipo naturale I in cui gli assoni (o le cellule) possono rispondere a un gradiente chimico secreto da cellule geneticamente modificate come fanno in vivo. Diverse risposte assonali a gradienti di segnali attraenti o inibitori (proteine, lipidi, ecc.) possono essere facilmente ...

Gli assoni neuronali, che terminano con coni di crescita assonale, migrano lunghe distanze attraverso la matrice extracellulare (ECM) dell'embrione su percorsi specifici per raggiungere i loro obiettivi appropriati. Il cono di crescita è la porzione distale dell'assone ed è specializzato per percepire l'ambiente fisico e molecolare della cellula1,2. Da un punto di vista molecolare, i coni di crescita sono guidati da almeno quattro diversi meccanismi molecolari: attrazione del contatto, chemioattrazione, repulsione del contatto e chemorepulsione innescata da diversi segnali di guida assonali3,4 , 5 Del numero 3( , 6. I processi mediati dal contatto possono essere parzialmente monitorati in colture bidimensionali (2D) su substrati micromodellati (ad esempio, con strisce7,8 o macchie9 contenenti le molecole). Tuttavia, gli assoni possono navigare verso il loro bersaglio in modo non diffuso rilevando diverse molecole attraenti e ripugnanti dalle cellule guidepost nell'ambiente4,5,10. Qui, descriviamo un metodo semplice della coltura 3D per verificare se una molecola secreta induce effetti chemorepulsivi o chemioattraenti sullo sviluppo degli assoni.
I primi studi miravano a determinare gli effetti dei segnali di guida assonati utilizzavano colture espiante in matrici tridimensionali (3D) per generare gradienti che simulano condizioni in vivo11,12. Questo approccio, insieme agli esperimenti in vivo, ha permesso l'identificazione di quattro grandi famiglie di spunti di orientamento: Netrins, Slits, Semaphorins ed Ephrins4,5,6. Questi segnali molecolari e altri fattori13 sono integrati dagli assoni in crescita, innescando la dinamica dei complessi di adesione e trasducindo le forze meccaniche attraverso il citoscheletro14,15,16. Per generare gradienti molecolari in colture 3D per la navigazione assonale, ricercatori pionieri hanno usato17substrati di coaguli di plasma, che è stato utilizzato anche per preparazioni di fette organotipiche18. Tuttavia, nel 1958, un nuovo protocollo per generare idrogel di collagene 3D è stato segnalato per lo studio con i dispositivi di Maximow19, una piattaforma di coltura, utilizzata in diversi studi adatti per osservazioni microscopiche20. Un altro studio pionieristico ha riportato il gel di collagene come strumento per incorporare i fibroblasti umani per studiare la differenziazione dei fibroblasti nei miofibroblasti nei processi di guarigione delle ferite21. Parallelamente, Lumsden e Davies hanno applicato il collagene dal derma bovino per analizzare l'effetto putativo del fattore di crescita del nervo (NGF) sulla guida delle fibre nervose sensoriali22. Con lo sviluppo di nuove piattaforme di cultura (ad esempio, piatti multi-pozzi) da diverse aziende e laboratori, le colture di collagene sono state adattate a questi nuovi dispositivi6,23,24,25 ,26. Parallelamente, un estratto di materiale ECM derivato dalla linea di cellule tumorali Engelbreth-Holm-Swarm è stato reso disponibile in commercio per espandere questi studi27.
Recentemente, sono stati sviluppati diversi protocolli per generare gradienti molecolari con ruoli putativi nella guida degli assa utilizzando idrogel 3D (ad esempio, collagene, fibrina, ecc.) 28.In alternativa, la molecola candidata può essere immobilizzata a concentrazione diversa in una matrice porosa (ad esempio, NGF29) o generata dalla coltura in una piccola regione degli aggregati di cellule idrogel 3D che secerneno la molecola per generare un gradiente4,23,24,25,26. L'ultima possibilità sarà spiegata in questo protocollo.
La procedura qui presentata è un metodo facile, veloce e altamente riproducibile basato sull'analisi della crescita assonale nelle colture di idrogel 3D del cervello embrionale del topo. Rispetto ad altri metodi, il protocollo è adatto per i ricercatori non addestrati e può essere completamente sviluppato dopo una breve formazione (1-2 settimane). In questo protocollo, isoliamo prima il collagene dalle code di ratto adulto per generare ulteriormente matrici 3D in cui gli aggregati cellulari geneticamente modificati vengono coltivati davanti al tessuto neuronale embrionale. Questi aggregati cellulari formano gradienti chimici radiali di una molecola candidata che suscita una risposta per gli assoni in crescita. Infine, la valutazione degli effetti della molecola sugli assoni in crescita può essere facilmente eseguita utilizzando una microscopia a contrasto di fase o, in alternativa, metodi immunocitochimici.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg compresse (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>Adult Sprague-Dawley ratti (da 8 a 9 settimane)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lione, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>B27 integratore senza siero 50x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconninico (BCA)</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>vettori di plasmidi cDNA Linee</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellulari COS1</td><td>ATTC</td><td>CRL-1570</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma</td><td>16325</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio (soluzione al 45% in acqua) per il terreno neurobasale completo</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium 1x ) per terreno di coltura COS1</td><td>Invitrogen</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato 10x (senza Ca2+ e Mg2++) (D-PBS) per colture</td><td>Invitrogen</td><td>14200</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo&nbsp;</td><td>merck</td><td>108543</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Mezzi di montaggio a fluorescenza (ad esempio, Fluoromount-G o simili)</td><td>Scienze della microscopia elettronica (EMS)</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina in polvere&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale (Panreac, cat. n. 211008)</td><td>Panreac</td><td>211008</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s soluzione salina bilanciata&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>24020083</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino fetale inattivato termicamente</td><td>Invitrogen</td><td>10108-165</td><td></td></tr><tr><td>Siero di cavallo inattivato a caldo&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (H2O2, dal 32 al 33% in acqua)</td><td>Sigma</td><td>316989</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina 200 mM (100x) per un mezzo neurobasale completo e COS1</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000 Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Topi femmina incinta (giorno embrionale da 12,5 a 16,5; E12.5-16.5)&nbsp;</td><td>Criffa-Credo, Lione, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modified Minimum Essential Medium Eagle (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11012-044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale contro la classe III &beta;-tubulina (clone TUJ-1)</td><td>Biolegend</td><td>801201</td><td></td></tr><tr><td>N-2 integratore 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Terreno neurobasale&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Merck</td><td>1.040.051.000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina/streptomicina 100x&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15140-22</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato 10x (PBS) per immunocitochimica</td><td>Invitrogen</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario: anti-topo di cavallo biotinilato&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>BA-2000</td><td></td></tr><tr><td>Terreno senza siero (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Sodio azide&nbsp;</td><td>Panreac</td><td>162712</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di bicarbonato di sodio 7,5%&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Coltura sterile grado H2O&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>TritonTM X-100&nbsp;</td><td>Base Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (Tripsina (0,05% (peso / vol) con EDTA (1x)</td> <td>Invitrogen</td><td>25300-054 <</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 forbici curve grandi e 1 piccola per dissezione...</td><td>Strumenti di precisione Strumenti o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>provette da centrifuga coniche da 1,5 mL</td>Provette da centrifuga coniche <td>Eppendorf o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 15 mL</td><td>Corning o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 emostatici&nbsp; &nbsp;</td><td>Strumenti di precisione Strumenti o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 piccole forbici da dissezione diritte</td><td>Strumenti di precisione Strumenti o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga da 200 ml per centrifugazione</td><td>Nalgene o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palloni</td><td></td><td></td><td></td>conici di vetro sterili da 200 ml</tr> Bicchiere di <tr><td>vetro</td><td></td><td></td><td></td>da 2 litri</tr><tr><td>Piastre di coltura a 4 e 6 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>176740 e 140675</td><td></td></tr><tr><td>Pompe per pipette automatiche e pipette in plastica sterili monouso da 10 mL e 25 mL contenenti filtro.</td><td>Gilson, Brand, Eppendorf o simili&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette automatiche, puntali con filtro sterile e puntali sterili attuali.</td><td>Gilson, Eppendorf o similare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga da banco con rotore fisso ad angolo</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter o simile</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata da banco con rotore a secchiello oscillante (con adattatori per provette da 1,5, 15 e 50 mL)</td><td>Eppendorf, Beckman Coulter o simile</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari a 37 ° C, 5% CO2 e 95% aria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana in cellulosa</td><td>Sigma</td><td>D9402</td><td></td></tr><tr><td>Chiusure per tubi per dialisi...</td><td>Sigma</td><td>Z37101-7</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in vetro monouso Microscopio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>da dissezione con ottica a campo scuro&nbsp;</td><td>Olympus SZ51 o simile&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata ad alta velocità Beckman Coulter o similare con rotore</td><td></td><td></td><td></td>fisso ad angolo</tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td><td></td>a flusso laminare</tr><tr><td>Grande 100 mm, 60 mm e piccola 35 mm &Oslash; piastre per colture cellulari</td><td>Nunc</td><td>&nbsp; 150679 , 150288 e 150318, rispettivamente</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore magnetico e barre di rotazione magnetiche</td><td>IKA o simile</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tritatessuti McIlwain</td><td>Mickle Laboratory Engineering</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Un paio di pinze dritte fini e un paio di pinze curve&nbsp;</td><td>Strumenti fini Strumenti o simili</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio per il tritatessuti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bisturi (numero 15 e 11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Due paia di spatole sottili per trasferire pezzi di collagene e tessuto</td><td>Strumenti fini Strumenti o simili</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di idrogel 3d basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

Questo protocollo utilizza collagene di tipo naturale I per generare idrogel tridimensionale (3D) per il monitoraggio e l'analisi della crescita assonale. Il protocollo è incentrato sulla coltura di piccoli pezzi di cervelli embrionali o postnatali di roditori all'interno di un idrogel 3D formato dal tipo iderivato derivato dal tendine della coda di ratto con porosità specifica. I pezzi di tessuto sono coltivati all'interno dell'idrogel e confrontati con specifici frammenti cerebrali o aggregati cellulari geneticamente modificati per produrre e secernere molecole adatte per creare un gradiente all'interno della matrice porosa. I passaggi di questo protocollo sono semplici e riproducibili, ma includono passaggi critici da considerare attentamente durante il suo sviluppo. Inoltre, il comportamento degli assoni in crescita può essere monitorato e analizzato direttamente utilizzando un microscopio a contrasto di fase o un microscopio a fluorescenza mono/multifotonico dopo la fissazione mediante metodi immunocitochimici.

Qui, presentiamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare la crescita assonale nelle colture di collagene idrogel 3D del sistema nervoso murino embrionale. A tal fine, abbiamo isolato il collagene dalle code di ratto adulto per generare matrici 3D in cui abbiamo coltivato aggregati cellulari geneticamente modificati che esprimevano Netrin-1 o Sema3E di fronte al tessuto neuronale embrionale (ad esempio, ca regione dell'ippocampo). Questi aggregati cellulari formavano un gradiente distribuito radialmente della ...

Qui, forniamo un metodo per analizzare il comportamento degli assoni in crescita in matrici 3D, imitando il loro sviluppo naturale.

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Questo metodo è utile per analizzare il ruolo di alcune molecole nella guida assonale e nella migrazione neuronale durante lo sviluppo del neuro sistema. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'analisi dei risultati è rapida e semplice e non richiede software complesso che implicherebbe molta formazione per i ricercatori. A dimostrare la procedura sarà Mirian Segura-Feliu, un tecnico del nostro laboratorio e me stesso.Per iniziare la piastra 200,000 cellule COS-1 in 35 millimetri piastre di Petri e incubare con mezzo di coltura completo in un incubatore di coltura cellulare al fine di leggere la confluenza dal 70 all'80% durante la notte. Il giorno seguente, per trasfetto le cellule COS-1 con il DNA che codifica per la molecola candidata usando il metodo di trasfezione a base di liposoma. Mescolare prima 250 microlitri di mezzo privo di siero e da uno a 2 microgrammi di DNA in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Per preparare un tubo liposomiale, aggiungere 240 microlitri del mezzo privo di siero e 10 microlitri di reagente di trasfezione liposomiale e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere il contenuto del tubo del DNA al tubo lipsomico. Mescolare e incubare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti.Sostituire il mezzo sulle cellule coltivate con 1,5 millilitri del mezzo privo di siero. Aggiungere lentamente la miscela di liposomi del DNA e cadere saggiamente alle cellule. Incubare nell'incubatore di coltura cellulare di anidride carbonica per tre ore.Dopo aver completato l'incubazione, sostituire il mezzo con il mezzo di coltura completo e incubare durante la notte nell'incubatore. Il giorno seguente sciacquare le cellule con pbs molare 0,1 dulbecco. Aggiungere 800 microlitri tripside EDTA per ogni piatto e incubare per cinque o 15 minuti nell'incubatore di anidride carbonica.Raccogliere celle staccate con due millilitri di mezzo di coltura completo in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e aggiungere 10 millilitri dello stesso mezzo. Centrifugare le cellule a quattro gradi Celsius a 130 volte g per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e conservare il pellet contenente cellule COS-1 sul ghiaccio.Dopo aver preparato la miscela di lavorazione del collagene, aggiungere da 100 a 150 microlitri della miscela di collagene al pellet delle cellule trasfette e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Stendere da 45 a 50 microlitri di miscela di pellet di cellule di collagene su una piastra di Petri di 35 millimetri per formare una banda uniforme di cellule di collagene, lunga approssimativamente da uno a 1,5 centimetri. Posizionare il piatto nell'incubatrice a 37 gradi celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando non si osserva la gelazione.Preparare una seconda striscia contenente celle di controllo in un secondo piatto di coltura e posizionarla nell'incubatrice. Al termine della gelazione, aggiungere da tre a quattro millilitri di 37 gradi celsius warmed COS-1 mezzo di coltura completo per ogni piatto contenente le strisce di cellule di collagene gelate e metterli nell'incubatrice. Utilizzare un bisturi fine o un elicottero tissutale per tagliare le strisce cellulari di collagene per generare piccoli pezzi quadrati, lunghi da 400 a 500 micrometri.Trasferire tutte le sezioni dalla stessa condizione di trasfezione a una piastra di Petri contenente da tre a 3,5 millilitri di mezzi di coltura neuronali. Controllare al microscopio sezionato la qualità dei pezzi e posizionare i piatti nell'incubatrice. Usa le forbici per tagliare le corna embrionali il giorno embrionale 16.5 dalla cavità addominale di un ratto femmina incinta sacrificato e posizionarle in una grande piastra di Petri contenente tampone freddo HBSSg.Mettere il piatto nel cappuccio di flusso laminare e utilizzare le forcette dritte per estrarre gli embrioni e metterli in un nuovo piatto contenente HBBSg freddo. Con piccole forcette, rimuovere la pelle, quindi con forcette curve e dritte, sezionare attentamente il cervello e posizionare in un piatto contenente HBSSg freddo. Al microscopio sezionato, usando un bisturi o forbici fini, tagliare il cervello a metà lungo la linea mediana per separare entrambi gli emisferi.Quindi, rimuovere il diencefalo e con forcette fini, rimuovere le meningi e i vasi sanguigni dai pezzi cerebrali. Utilizzare 100%etanolo per pulire tutte le parti dell'elicottero tissutale, in particolare la piastra di taglio PTFE e la lama del rasoio e mantenere l'elicottero del tessuto nella cappa di flusso laminare sotto l'illuminazione UV per 15 minuti. Trasferire ogni pezzo di tessuto sulla piastra di taglio dell'elicottero tissutale.Dopo che il tessuto è stato tritato, trasferire i pezzi dalle piastre di Petri da 35 millimetri riempite con da tre a quattro millilitri di NCM completo. Utilizzando aghi di tungsteno fini, finire la dissezione tissutale in NCM completo. Controllare la qualità delle fette ottenute al microscopio di sezionazione, assicurandosi che gli strati siano chiaramente identificabili nell'ottica del campo scuro e sezionare la regione di interesse con aghi di tungsteno.Conservare i pezzi di buona qualità in un mezzo NCM completo nell'incubatore di anidride carbonica. La dimostrazione visiva è fondamentale nei passaggi relativi alla preparazione delle co-culture che facilitano le parole per comprendere il processo. Posizionare diverse piastre sterili di coltura del pozzo nel cappuccio del flusso laminare e preparare una miscela di lavoro di collagene come in precedenza.Aggiungere da 15 a 20 microlitri della miscela di idrogel nel fondo di ogni pozzo per produrre una base di collagene circolare. Posizionare i piatti nell'incubatrice fino a quando non si osserva una gelazione completa. E controlla la qualità del collagene gelato.Con una pipetta, trasferire un piccolo pezzo di aggregato cellulare COS-1 sulla base idrogel, quindi utilizzare una pipetta per posizionare un pezzo di tessuto sulla stessa base, vicino al pezzo di cellule aggregato a una distanza di una dimensione di espianto. Dopo aver preparato una nuova miscela di collagene funzionante sul ghiaccio, pipettare delicatamente da 15 a 20 microlitri di questa nuova miscela per coprire l'espianto e l'aggregato cellulare, facendo un panino come la coltura di idrogel. Utilizzare un ago di tungsteno fine per riorientare l'espianto in modo che affronti l'aggregato cellulare a 500-600 micrometri.Restituire la piastra all'incubatrice fino a quando non si osserva la gelazione e quindi aggiungere 0,5 millilitri di NCM completo integrato con integratore 2%B27 e mantenere le colture per 36-48 ore nell'incubatore. Quando gli assoni ippocampali si confrontarono con Netrin-1, crebbero preferenzialmente verso la fonte di Netrin-1, indicando che Netrin-1 agisce come una molecola chemio attraente per questi assoni. Nella condizione di controllo, o trasfezione fittizia, tutti gli assoni crescevano radialmente, senza alcuna preferenza direzionale.Quando gli assoni ippocampali si confrontarono con le cellule secernenti Sema3E, la maggior parte di esse cresceva di fronte all'aggregato cellulare, indicando che Sema3E agisce come una molecola chemio repulsiva per questi assoni. Questa rappresentazione schematica del metodo di risposta e quantificazione assionale mostra che in condizioni di controllo, gli assoni erano equamente distribuiti sia nei quadranti prossimali che distale, mostrati con crescita radiale. Ciò indicava un rapporto distale prossimale o PD di uno.Quando gli espianto mostravano un aumento del numero di assoni nel quadrante prossimale rispetto al distale, indicando l'attrazione chemio, il rapporto PD era maggiore di uno. Quando il numero di assoni era più alto nel quadrante distale che in quello prossimale, indicando la repulsione della chemio, il rapporto PD era inferiore a uno. Seguendo questo metodo, i ricercatori possono ottenere informazioni essenziali sul ruolo di alcune molecole durante lo sviluppo neuronale, che ci consente di stabilire un punto di partenza per esplorare ulteriormente le funzioni.Sebbene questa tecnica sia utile nello sviluppo neuronale così com'è, potrebbe anche essere applicata nello screening farmacologico, nell'angiogenesi e nell'ingegneria tissutale come strategie.

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Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso (Video) | JoVE Journal

Generazione di idrogel 3D basati su collagene per analizzare la crescita e il comportamento assonali durante lo sviluppo del sistema nervoso

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