Name: Combinando analisi SDS-PAGE non riducenti e reticolazione chimica per rilevare complessi multimerici stabilizzati dai legami disolfuro nelle cellule di mammiferi nella cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Scopri come analizzare complessi multimerici stabilizzati da legami disolfuro nelle cellule di mammiferi utilizzando SDS-PAGE non riducente e reticolazione chimica. Questo metodo rapido ed economico permette di identificare interazioni proteiche in vivo.

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Apprezziamo con gratitudine gli sforzi compiuti dalla Dott. ssa Jennifer Fischer per la purificazione dell'anticorpo policlonale dUTPase e Kerri Ciccaglione per tutti i suoi sforzi per aiutare a modificare questo manoscritto. Questa ricerca è stata parzialmente sostenuta da una sovvenzione della New Jersey Health Foundation (Grant #PC 11-18).

1. blocco dei residui di cisteina liberi utilizzando iodoacetamide
<ol><li>Crescere le cellule U-2 OS in un 6 cm2 piatto al 50%-60% confluenza in mezzo essenziale minimo con alto glucosio contenente 10% siero bovino fetale e 1% piruvato di sodio a 37 ° c in 5% Co2.</li>
	<li>Fare un nuovo stock di 10 mM iodoacetamide appena prima dell'uso, quindi scartare il reagente non utilizzato.</li>
	<li>Aggiungere 0,1 mM di concentrazione finale iodoacetamide direttamente al supporto di coltura cellulare. Delicatamente la pietanza a temperatura ambiente per 2 min.</li>
</ol>2. raccolta delle cellule
<ol><li>Aspirare il supporto dalle cellule.</li>
	<li>Lavare le cellule con 5 mL di soluzione salina tampone al fosfato freddo (PBS) tre volte. Aspirare la soluzione finale di lavaggio PBS poi aggiungere 1 mL di PBS freddo.</li>
	<li>Raschiare le cellule dal fondo del piatto usando un raschietto cellulare. Utilizzando una pipetta da 1 mL, aspirare il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Girare le cellule a 7.500 x g per tre min a 4 ° c. Aspirare il PBS, lasciando dietro il pellet cellulare. Il pellet cellulare può essere conservato a-80 ° c fino all'elaborazione</li>
</ol>3. estrazione di proteine
<ol><li>Preparare 100 μL di tampone di lisi 1x diluito in ddH2O (vedere tabella dei materiali). Aggiungere il fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale di 1 mM.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di tampone di lisi 1x direttamente al pellet cellulare e sospendere. Incubare questo su ghiaccio per 5 min.</li>
	<li>Sonicare per 8 s utilizzando la modalità a impulsi costante a 40% (vedere tabella dei materiali per SONICATOR; regolare come necessario per i diversi sonicators), mantenendo l'estratto sul ghiaccio.</li>
	<li>Girare l'estratto a 4 ° c per 5 min a 16.000 x g. Il supernatante è la frazione proteica solubile. L'analisi di Bradford può essere eseguita per determinare la concentrazione proteica se lo si desidera.</li>
</ol>4. preparazione del campione
<ol><li>Prenda 10 μL dell'estratto proteico solubile e aggiunga 10 μL di un tampone di campionamento di 1 Laemmli SDS (4% SDS, 20% glicerolo, 0,004% di bromopfenolo e 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8). Non aggiungere alcun reagente riducente.</li>
	<li>Conservare i campioni su ghiaccio se l'analisi SDS PAGE verrà eseguita quel giorno; per lo stoccaggio a lungo termine,-20 ° c è appropriato. A destra prima di eseguire il gel, riscaldare il campione per 5 minuti a 85 ° c.</li>
</ol>5. in vivo formaldeide cross-linking delle proteine endogene nelle cellule OS U-2
<ol><li>Far crescere le cellule U-2 OS in un 175 cm2 Flask al 70% – 80% confluenza (vedere paragrafo 1).</li>
	<li>
Eseguire la reazione di reticolazione della formaldeide
	<ol>
<li>In una cappa di fumi, aliquota una soluzione di formaldeide 37% acquistata da fonti commerciali. Aggiungere il fissativo di formaldeide direttamente al mezzo ad una concentrazione finale dell'1% e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 min.</li>
		<li>Per placare la reazione, aggiungere 1,25 M di glicina ad una concentrazione finale di 0,125 M e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata su un bilanciere per 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavare le cellule con 5 mL di PBS freddo tre volte. Aspirare la soluzione finale di lavaggio PBS e aggiungere 10 mL di PBS. Raschiare le cellule dal fondo del pallone usando un raschietto cellulare.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta da 10 mL, aspirare il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Girare le cellule a 500 x g per 2 min a 4 ° c. Aspirare il PBS, lasciando dietro il pellet cellulare.</li>
</ol>6. frazione dei nuclei
<ol><li>Preparare 10 mL di tampone di omogeneizzazione: 0,25 M saccarosio, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES e 0,5% BSA a pH 7,4. Aggiungere PMSF immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale di 1 mM e 3 ml di tampone di sospensione dei nuclei (0,1% Triton X-100 in PBS).</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di omogeneizzazione tampone direttamente al pellet cellulare e sospendere completamente. Centrifugare la sospensione a 500 x g per 2 min a 4 ° c, quindi gettare il surnatante.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 5 mL di tampone di omogeneizzazione. Utilizzare un omogeneizzatore di vetro-teflon aderente, Dounce omogeneizzare le cellule a 10 colpi/500 rpm.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione a 1.500 x g per 10 min a 4 ° c, quindi scartare il supernatante. Nota: Utilizzare il supernatante per l'isolamento dei mitocondri mediante centrifugazione a 10.000 x g per 10 min.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 1 mL di tampone di sospensione nuclei e incubare su ghiaccio per 10 min.</li>
	<li>Centrifugare a 600 x g per 10 min scartare il supernatante.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 1 mL di tampone di sospensione dei nuclei e centrifugare nuovamente. Scartare il supernatante. Il pellet finale sarà isolato nuclei.</li>
</ol>7. estrazione di proteine
<ol><li>Ripetere la sezione 4, eccetto aggiungendo 25 μL del tampone di lisi 1x direttamente al pellet cellulare, quindi sospendendo.</li>
</ol>8. preparazione del campione
<ol><li>Preparare due campioni per SDS-PAGE prendendo 10 μL ciascuno dell'estratto proteico solubile e aggiungere 10 μL di 2x Laemmli SDS-Sample buffer e 1 μL di 2-mercaptoetanolo (BME).</li>
	<li>Riscaldare un campione per 5 min a 37 ° c e il secondo campione per 15 min a 98 ° c per invertire il collegamento a croce di formaldeide.</li>
</ol>9. analisi SDS-PAGE
<ol><li>Preparare 1 L di 1x tampone di corsa tris-glicina (tris da 25 mM, 192 mM glicina, 0,1% (p/v) SDS).</li>
	<li>
Impostare l'apparecchiatura da corsa SDS-PAGE. Nota: questo protocollo utilizza un 16% prefabbricati SDS-page di TGX. Di nota, qualsiasi percentuale di gel può essere utilizzato.<ol>
<li>Per il protocollo del produttore, aprire la confezione in cui il gel è conservato e rimuovere la cassetta.</li>
		<li>Rimuovere il pettine che sta allineando i pozzi e il nastro dal fondo della cassetta.</li>
		<li>Collocare il gel nell'apparato di corsa.</li>
		<li>Riempire la camera con il tampone di corsa 1x fino a quando i pozzi sono sommersi in liquido. Utilizzando un Pipet di plastica, risciacquare i pozzetti con il tampone di corsa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caricare i campioni sul gel insieme a 10 μL di marcatore standard precolorato.</li>
	<li>Eseguire il gel a 200 V fino a quando il colorante anteriore è di circa 1 cm dal fondo del gel.</li>
</ol>10. Western blot
<ol><li>Preparare 1 L di tampone di trasferimento 1x (tris da 25 mM, 192 mM glicina, 20% metanolo) e conservare a 4 ° c fino all'uso.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il gel e aprire la cassetta. Utilizzando un rasoio, tagliare e scartare accuratamente il gel di impilamento. Raccogliere il gel utilizzando un angolo e posizionarlo in un vassoio con tampone di trasferimento, permettendo di Rock delicatamente per 5 min.</li>
	<li>Mentre il gel è a dondolo, posizionare un blocco di ghiaccio (memorizzato in-20 ° c) nel serbatoio di trasferimento e aggiungere il buffer di trasferimento per 3/4 pieno.</li>
	<li>Bagnare la membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) ammollo in 100% metanolo per 30 s.</li>
	<li>Una volta che i 5 minuti sono passati, prepararsi a impostare il trasferimento in un vassoio con tampone di trasferimento. Il buffer di trasferimento deve essere sufficiente per immergere completamente la macchia. Impostare il trasferimento blot come segue: in basso, la parte inferiore del supporto della cassetta (nero); poi una spugna spessa, carta assorbente extra spessa, il gel di poliacrilammide, una membrana in PVDF, carta assorbente extra spessa e una spugna spessa; quindi infine la parte superiore del cassetto (bianco) in alto.</li>
	<li>Bloccare la cassetta e posizionare l'unità nel serbatoio di trasferimento con la membrana in PVDF verso l'anodo positivo e il gel verso il negativo. Top off l'unità con tampone di trasferimento fino a quando il trasferimento è completamente sommerso.</li>
	<li>Collocare l'unità sopra una piastra di agitazione. Aggiungere una barra di agitazione all'unità e iniziare a mescolare a 125 giri/min.</li>
	<li>Correre a 100 V per 60 min.</li>
	<li>Mentre il trasferimento è in funzione, preparare una soluzione di latte in polvere al 5% disciolto in soluzione salina tris-tamponata, con Tween-20, pH 7,5 (TBST).</li>
	<li>Smontare l'unità e rimuovere la membrana, rilevando quale lato era in contatto con il gel; Assicurarsi che questo lato rimanga nel cassetto per i passaggi rimanenti.</li>
	<li>Immergere la membrana per 2 minuti in soluzione salina con tamponata di tris (TBS) seguita bloccando la membrana incubando in 5 mL di 5% latte-TBST per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sostituire il latte con un fresco 4 mL di 5% latte-TBST soluzione e aggiungere l'anticorpo primario alla diluizione corretta (in questo caso, la nostra diluizione è 1:2000 per l'anticorpo dUTPase) e incubare durante la notte con dolce dondolo a 4 ° c.</li>
	<li>Il giorno seguente, rimuovere la macchia dal rocker 4 ° c a un rocker di temperatura ambiente, scartando la soluzione anticorpale primaria.</li>
	<li>Fai tre Lavini rapidi con TBST, usando abbastanza liquido per immergere completamente la macchia, seguita da 3 Lavini, 5 min ciascuno, dondolando lentamente.</li>
	<li>Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 5 mL del 5% latte-TBST soluzione e roccia la macchia per 15 minuti poi scartare.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo secondario diluito in 5% latte-TBST alla concentrazione desiderata. (In questo caso, 1:5000 diluizione di capra anti-coniglio diluito in 5 mL di 5% latte-TBST soluzione)</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente, dondolo per 1 h, quindi scartare la soluzione.</li>
	<li>Fare tre lavaggi rapidi con TBST seguiti da 3 lavaggi, 5 min ciascuno, oscillare lentamente, poi scartare il lavaggio finale e aggiungere 5 mL di TBS.</li>
	<li>Preparare una miscela 1:1 di una soluzione di rilevazione chemiluminescente ECL (1 mL di ogni reagente per un volume finale di 2 mL) e aggiungerlo direttamente alla macchia incubando per 1 min.</li>
	<li>Rimuovere la membrana utilizzando le pinzette e tamponare l'angolo con un panno di laboratorio, rimuovendo qualsiasi soluzione in eccesso. Posizionare la membrana in involucro termoretraibile e posizionare il lato proteico in una cassetta radiografica.</li>
	<li>Esporre la membrana alla pellicola a raggi x. Il tempo di esposizione varierà.</li>
</ol>

<ol><li>Klomsiri, C., Karplus, P. A., Poole, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine-based+redox+switches+in+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Cysteine-based redox switches in enzymes.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1065-1077 (2011).</li>
<li>Antelmann, H., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based+redox+switches+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Thiol-based redox switches and gene regulation.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 14 (6), 1049-1063 (2011).</li>
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<li>Gorman, J. J., Wallis, T. P., Pitt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+bond+determination+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide bond determination by mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 21 (3), 183-216 (2002).</li>
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<li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 927585(2010).</li>
<li>Gavrilov, A., Razin, S. V., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formaldehyde+cross-linking%3A+it+is+time+for+black+box+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 163-165 (2015).</li>
<li>Rotoli, S. M., Jones, J. L., Caradonna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+residues+contribute+to+the+dimerization+and+enzymatic+activity+of+human+nuclear+dUTP+nucleotidohydrolase+%28nDut%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Cysteine residues contribute to the dimerization and enzymatic activity of human nuclear dUTP nucleotidohydrolase (nDut).</a> Protein Science. , (2018).</li>
<li>Caradonna, S., Muller-Weeks, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+of+enzymes+involved+in+uracil-DNA+repair%3A+isoform+characteristics+of+proteins+responsible+for+nuclear+and+mitochondrial+genomic+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">The nature of enzymes involved in uracil-DNA repair: isoform characteristics of proteins responsible for nuclear and mitochondrial genomic integrity.</a> Current Protein and Peptide Science. 2 (4), 335-347 (2001).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+compounds+activate+TRPA1+ion+channels+through+covalent+modification+of+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Noxious compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines.</a> Nature. 445 (7127), 541-545 (2007).</li>
<li>Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con il contenuto di questo manoscritto.

Il metodo qui delineato fornisce un protocollo diretto per l'analisi di complessi multimerici stabilizzati attraverso legami disolfuro. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre linee di coltura cellulare, tessuti e organismi che consentono una vasta gamma di applicazioni.
Un passo importante in questa procedura è quello di garantire che i legami disolfuro non sono una conseguenza della procedura di estrazione. Eventuali residui di cisteina liberi possono essere bloccati utiliz...

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traslazionale reversibile, agendo come un "interruttore redox" a base di cisteina che consente la modulazione della funzione proteica, la posizione e l'interazione1,2, 3,4. Pertanto, è importante essere in grado di studiare questa modifica. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso l'analisi non-riduzione SDS-PAGE5. L'analisi SDS-PAGE è una tecnica utilizzata in molti laboratori, dove i risultati possono essere ottenuti e interpretati in modo rapido, semplice e con costi minimi, ed è vantaggioso rispetto ad altre tecniche utilizzate per identificare i legami disolfuro come la spettrometria di massa6 ,7 e dicroismo circolare8.
Un passo importante nel determinare se questo metodo è una tecnica appropriata per aiutare in uno studio è quello di esaminare accuratamente la sequenza primaria della proteina di interesse per assicurare che ci sono residui di cisteina (s) presenti. Un altro passo utile è quello di ricercare le precedenti strutture cristalline pubblicate o utilizzare un'applicazione bioinformatica per esplorare la struttura tridimensionale della proteina di interesse per visualizzare dove possono essere localizzati i residui di cisteina. Se il residuo (s) è presente sulla superficie esterna può essere un candidato migliore per formare un legame disolfuro piuttosto che un residuo di cisteina sepolto all'interno della struttura. Tuttavia, è importante notare che le proteine possono subire cambiamenti strutturali sulle interazioni del substrato o sulle interazioni proteina-proteina permettendo che questi residui diventino poi esposti anche all'ambiente.
I complessi multimerici identificati possono quindi essere verificati con il cross-linking chimico usando la formaldeide. La formaldeide è un cross-linker ideale per questa tecnica di verifica a causa dell'elevata permeabilità alle cellule e della breve estensione di ~ 2-3 Å, assicurando il rilevamento di interazioni proteina-proteina specifiche9,10. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l'isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma ossea umana U-2 OS11. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato per altre linee cellulari, tessuti e organismi.

<table><tbody><tr><td>16% gel TGX prefabbricati</td><td>ThermoFisher</td><td>Xp00160</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 Flask</td><td>Cell star 658175</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18CO</td><td>ATCC</td><td>CRL-1459</td><td></td></tr><tr><td>6 cm2 piatto</td><td>VWR</td><td>10861-588</td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Kit di rilevamento ECL</td><td>GE</td><td></td><td></td>16817200</tr><tr><td>Apparecchio di trasferimento Blot</td><td>Biorad</td><td>153BR76789</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>Aldrich M3148</td><td></td></tr><tr><td>Reagente proteico</td><td>Bradford Biorad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Blu</td><td></td><td></td><td></td>di bromofenolo</tr><tr><td>BSA</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>99985</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di lisi cellulare</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>9803</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendor</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Trapano</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M101</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>Carta assorbente occidentale extra spessa</td><td>ThermoFisher</td><td>88610</td><td></td></tr><tr><td>Fetale siero bovino</td><td>Gibco</td><td>1932693</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>ThermoFisher</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Omogeneizzatore</td><td></td><td></td><td></td>in vetro-teflon</tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>65516</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>RPI</td><td>636050</td><td></td></tr><tr><td>Blocco termico</td><td>Denville</td><td>10285-D</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0527</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>VWR</td><td>2018010431</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>ThermoFisher</td><td>90034</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Pharmco</td><td>339000000</td><td></td></tr><tr><td>Latte secco scremato</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>99995</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Posi-click</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore</td><td>Biorad</td><td>200120</td><td></td></tr><tr><td>Marker pregiato</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Biorad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Reliable Scientific</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>Saos2</td><td>ATCC</td><td>HTB-85</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>70748</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto per piccole cellule</td><td>Tygon</td><td>S-50HL classe VI</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore</td><td>Branson</td><td>450</td><td></td></tr><tr><td>Tampone in spugna per tamponamento</td><td>Invitrogen</td><td>E19051</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agitazione</td><td>Corning</td><td>PC353</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>Aldrich S-1888</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>RPI</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Tris Soluzione salina tamponata, con Tween 20, pH 7,5</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRE0031</td><td></td></tr><tr><td>tampone di corsa Tris-Glicina</td><td>VWR</td><td>J61006</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola radiografica</td><td>ThermoFisher</td><td>34090</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando analisi sds-page non riducenti e reticolazione chimica per rilevare complessi multimerici stabilizzati dai legami disolfuro nelle cellule di mammiferi nella cultura

Combining Non-reducing SDS-PAGE Analysis and Chemical Crosslinking to Detect Multimeric Complexes Stabilized by Disulfide Linkages in Mammalian Cells in Culture

Le strutture di molte proteine sono stabilizzate attraverso legami di disolfuro covalenti. Nel recente lavoro, questo legame è stato anche classificato come una modifica post-traduzionale. Così, è importante essere in grado di studiare questa modifica nelle cellule viventi. Un metodo semplice per analizzare questi complessi multimerici stabilizzati con cisteina è attraverso un metodo a due fasi di analisi SDS-PAGE non-riduzione e cross-linking di formaldeide. Questo metodo a due fasi è vantaggioso come il primo passo per scoprire complessi multimerici stabilizzati da legami disolfuro a causa della sua facilità tecnica e basso costo di funzionamento. Qui, la linea cellulare di osteosarcoma osseo umano U-2 OS viene utilizzata per illustrare questo metodo analizzando specificamente l'isoforma nucleare di dUTPase.

L'Dutpasi nucleare forma un legame disolfuro intermolecolare formando una configurazione di dimero stabile attraverso l'interazione di due residui di cisteina posizionati al terzo aminoacido di ogni proteina monomerica11. Ciò è dimostrato in Figura 1a, B. Per garantire che questo legame disolfuro non fosse un'interazione non specifica a causa di anomalie migratorie nell'ambiente non ridotto, l'inclusione di un controll...

I legami disolfuro sono stati a lungo conosciuti per stabilizzare la struttura di molte proteine. Un metodo semplice per analizzare complessi multimerici stabilizzati da questi legami è attraverso l'analisi di SDS-PAGE non-riduzione. Qui, questo metodo è illustrato analizzando l'isoforma nucleare di dUTPase dalla linea cellulare osteosarcoma dell'osso umano U-2 OS.

Combinando analisi SDS-PAGE non riducenti e reticolazione chimica per rilevare complessi multimerici stabilizzati dai legami disolfuro nelle cellule di mammiferi nella cultura

The structures of many proteins are stabilized through covalent disulfide linkages. In recent work, this bond has also been classified as a ...

È stato ben stabilito che le strutture di molte proteine sono stabilizzate in collegamenti covalenti disolfuro. In recenti lavori questo legame è stato classificato come una modifica post-traslazione. Pertanto, è importante essere in grado di identificare complessi multimeri stabilizzati dalla cisteina nelle cellule viventi utilizzando un metodo rapido e semplice.Il vantaggio principale di questa tecnica è che i risultati possono essere ottenuti e interpretati rapidamente, facilmente e con il minimo costo. Per iniziare, far crescere le cellule del sistema operativo U-2 in un piatto di sei centimetri quadrati in Minimum Essential Medium High Glucose, integrato con 10%FBS e 1%piruvato di sodio a 37 gradi Celsius in 5% di anidride carbonica. Fare uno stock fresco di iodoacetamide da 10 millimolare appena prima dell'uso.Dopo che le cellule hanno raggiunto il 50-60% di confluenza, aggiungere 0,1 millimolare la concentrazione finale iodoacetamide direttamente al supporto di coltura cellulare. Scuotere delicatamente il piatto a temperatura ambiente per due minuti. Successivamente, aspirare il supporto dalle cellule e lavare le cellule con cinque millilitri di PBS freddo tre volte.Aspirare la soluzione di lavaggio PBS finale e aggiungere un millilitri di PBS freddo. Raschiare le cellule dal fondo del piatto usando un raschietto per cellule. Utilizzando una pipetta da un millilitro, redigere il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Ruotare le cellule a 7.500 volte g in quattro gradi Celsius per tre minuti. Aspirare il PBS lasciandosi alle spalle il pellet cellulare. Il pellet di cella può essere conservato a meno 80 gradi Celsius fino alla lavorazione.Per estrarre la proteina, preparare 100 microlitri di un tampone di lysis 1X diluito in acqua doppia distillata. Aggiungere il PMSF immediatamente prima dell'uso a una concentrazione finale millimolare. Quindi aggiungere 50 microlitri del tampone di lisi 1X direttamente al pellet cellulare e sospendere di nuovo.Incubare l'estratto sul ghiaccio per cinque minuti. Sonicare per otto secondi utilizzando la modalità impulso costante al 40% mantenendo l'estratto sul ghiaccio. Ruotare l'estratto a quattro gradi Celsius e 16.000 volte g per cinque minuti.Eseguire l'analisi di Bradford per determinare la concentrazione proteica, se lo si desidera. Per preparare il campione prendere 10 microlitri dell'estratto proteico solubile e aggiungere 10 microlitri di un tampone campione 1X Laemmli SDS. Tieni i campioni sul ghiaccio.Scaldare il campione a 85 gradi Celsius per cinque minuti prima di eseguire il gel. Per iniziare il cross-linking della formaldeide, far crescere le cellule del sistema operativo U-2 in un pallone da 175 centimetri quadrati al 70-80% di confluenza. In una cappa aspirante aggiungere la formaldeide fissativa direttamente al mezzo ad una concentrazione finale dell'1% e incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 15 minuti.Per spegnere la reazione aggiungere 1,25 glicina molare ad una concentrazione finale di 0,125 molare e incubare a temperatura ambiente con delicata agitazione su un rocker per cinque minuti. Lavare le cellule con cinque millilitri di PBS freddo tre volte. Aspirare la soluzione di lavaggio PBS finale e aggiungere 10 millilitri di PBS.Raschiare le cellule dal fondo del pallone usando un raschietto per cellule. Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, redigere il PBS e la sospensione cellulare e erogare tutto il liquido in un tubo di centrifuga conico da 15 millilitri. Ruotare le cellule a 500 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti.Aspirare il PBS lasciandosi alle spalle il pellet cellulare. Preparare 10 millilitri del tampone di omogeneizzazione aggiungendo 0,25 saccarosio molare, un EDTA millimolare, 10 HEPES millimolare e 0,5%BSA a pH 7,4. Immediatamente prima dell'uso, aggiungere PMSF a una concentrazione finale millimolare e tre millilitri del tampone di sospensione dei nuclei.Aggiungere cinque millilitri del tampone di omogeneizzazione direttamente al pellet cellulare e rimospendare completamente. Centrifugare la sospensione a 500 volte g e quattro gradi Celsius per due minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e rimescolare il pellet in cinque millilitri del tampone di omogeneizzazione.Quindi con un omogeneizzatore in teflon in vetro aderente omogeneizzare le cellule a 10 colpi per 500 giri/min e centrifugare la sospensione a 1,500 volte g e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Dopo la centrifugazione scartare il supernatante. Resuspend il pellet in un millilitro del tampone di sospensione dei nuclei e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare a 600 volte g per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante, rimescolare il pellet in un millilitro del tampone di sospensione dei nuclei e centrifugare di nuovo. Il pellet finale saranno i nuclei isolati.Estrarre le proteine come descritto prima di aggiungere 25 microlitri del tampone di lisi 1X direttamente al pellet cellulare. Quindi preparare due campioni per SDS PAGE prelevando 10 microlitri ciascuno dell'estratto proteico solubile e aggiungere 10 microlitri di tampone campione 2X Laemmli SDS e un microlitri di BME. Riscaldare un campione a 37 gradi Celsius per cinque minuti e il secondo campione a 98 gradi Celsius per 15 minuti per invertire il collegamento incrociato della formaldeide.Preparare un litro di tampone di corsa tris-glicina 1X mescolando tris millimolare, 192 millimolare glicina e 0,1% di peso per volume SD. Quindi impostare l'apparecchio di funzionamento SDS PAGE. Aprire il pacchetto TGX SDS-PAGE prefabbricato del 16% in base al protocollo del produttore e rimuovere la cassetta. Rimuovere il pettine che rivestono i pozzi e il nastro dal fondo della cassetta e posizionare il gel nell'apparato in esecuzione.Riempire la camera con il tampone di corsa 1X fino a quando i pozzi non sono immersi nel liquido. L'uso di una pipetta di plastica risciacqua i pozzi con tampone di corsa. Caricare i campioni sul gel insieme a 10 microlitri del marcatore standard pre-macchiato.Infine, eseguire il gel a 200 volt fino a quando la parte anteriore del colorante è a circa un centimetro dal fondo del gel. Un'analisi western degli estratti totali di cellule in assenza di agente riducente del BME ha dimostrato una formazione complessa multimerica in diverse popolazioni di cellule umane. Il complesso scomparve con l'aggiunta di BME in tutte e quattro le linee cellulari esaminate, indicando la presenza di un collegamento disolfuro.La conferma monomerica della dUTPasi nelle cellule umane al momento della raccolta è una combinazione di almeno tre delle isoforme della dUTPasi:l'isoforma mitocondriale, l'isoforma nucleare e una versione troncata notata a M24. L'isoforma mitocondriale usata come controllo non formava un legame disolfuro e migrava al peso molecolare previsto per la proteina monomerica. Il cross-linking della formaldeide della dUTPasi nucleare ha dimostrato una formazione complessa multimerica.Quando il collegamento incrociato è stato invertito incubando il campione a 95 gradi Celsius per 15 minuti, il complesso è stato destabilizzato e potrebbe essere visualizzato nel suo stato monomerico. L'aggiunta di iodoacetamide è un passo importante in questa procedura per bloccare i residui liberi di cisteina e per garantire che i collegamenti disolfuro non siano una conseguenza della procedura di estrazione. È importante ricordare di non aggiungere alcun agente riducente, ad esempio BME o DDT ai campioni SDS-PAGE in quanto questi ridurranno eventuali collegamenti disolfuro presenti nel campione.

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