Registrazione dell'elettroretinogramma in Zebrafish larvale con elettrodo di spugna-punta conica A romanzo

Questo protocollo aiuta a semplificare le misurazioni di elettroretinogrammi o ENG nel pesce zebra larvale che fornisce un'importante lettura funzionale dello sviluppo visivo e dei modelli di malattie genetiche. Le punte di spugna morbida degli elettrodi di registrazione utilizzati in questo protocollo sono facili da produrre utilizzando materiali economici e prontamente disponibili ed evitano potenziali danni agli occhi larvali. L'elettrodo con punta in spugna più morbido può facilitare ripetute misurazioni ERG dello stesso occhio.

Gli individui nuovi a questa procedura potrebbero avere difficoltà a lavorare sotto l'illuminazione rossa fioca utilizzata durante tutta la procedura. Ma è importante che l'adattamento oscuro sia mantenuto. Per preparare l'elettrodo di registrazione della spugna a forma di cono, tagliare l'estremità da un'estensione del piombo dell'elettrodo di platino e utilizzare un bisturi per rimuovere 10 millimetri del rivestimento isolante esterno in politetrafluoroetilene dalla nuova estremità dell'estensione.

Tagliare un pezzo di 40 millimetri di un filo d'argento di 0,3 millimetri di diametro e intrecciare il filo d'argento con il filo interno esposto per fissare saldamente il filo al piombo dell'elettrodo. Racchiudere il giunto con nastro isolante lasciando esposta una lunghezza di circa 15 millimetri di filo d'argento. Collegare un altro filo al terminale negativo della batteria e immergere l'altra estremità del filo nella salina.

Immergere il filo d'argento esposto in soluzione salina normale e collegare l'altra estremità al terminale positivo di una sorgente di corrente diretta a nove volt. Dopo 60 secondi, posizionare il filo sul tessuto assorbente per asciugare. Nel frattempo, tagliare un quadrato di 20 per 20 millimetri di spugna di acetato di polivinile a forma di cono e saturare la spugna in una volta il tampone di Ringer.

Al microscopio leggero con una barra di scala sull'oculare, utilizzare una lama bisturi per modellare l'apice del cono a un diametro di circa 40 micrometri. Asciugare all'aria la spugna a forma di cono su carta velina assorbente fino a quando non è solida. Prima di inserire il filo d'argento nella spugna di acetato di polivinile a forma di cono solido essiccato attraverso la base del cono, utilizzando il nastro adesivo per isolare qualsiasi metallo esposto in eccesso per ridurre gli artefatti fotovoltaici.

Il giorno dell'esperimento, immergere l'elettrodo con punta di spugna nel tampone di Ringer per 15 minuti per saturare completamente la spugna. Almeno otto ore prima delle registrazioni, posizionare non più di 20 larve di zebrafish in un unico tubo da 15 millilitri senza coperchio e avvolto in un foglio di alluminio in un'incubatrice scura. Alla fine dell'incubazione, versare il pesce zebra adattato al buio in una piastra di Petri sotto un'illuminazione rossa fioca da un diodo che emette luce.

Per preparare la piattaforma di spugna, tagliare un pezzo di spugna di acetato di polivinile approssimativamente uguale di spessore alla profondità di una piastra di Petri di 35 millimetri in modo che la spugna si adatti perfettamente all'interno della piastra. Effettuare un piccolo taglio verticalmente attraverso un'estremità della spugna per ospitare il filo d'argento dell'elettrodo di riferimento e immergere la spugna nel tampone del pesce rosso Ringer fino a quando la spugna non è satura. Quindi posizionare la spugna in una piastra di petri pulita di 35 millimetri e utilizzare un tovagliolo di carta per assorbire il liquido extra fino a quando nessuna soluzione trasuda dalla spugna in risposta a una leggera pressione delle dita.

Per posizionare l'animale per l'esperimento, utilizzare una pipetta Pasteur di tre millimetri per trasferire una larva anestetizzata su un quadrato di carta assorbente di tre per tre centimetri e utilizzare le forcette per posizionare il quadrato sulla spugna inumidita. Utilizzando un pennello fine imbevuto nel tampone di Ringer, regolare la posizione della larva con un occhio rivolto verso l'alto e lontano da qualsiasi liquido sull'asciugamano sotto la larva. Glassare il corpo larvale con gel oculare idratante per mantenere l'animale idratato durante la registrazione dell'elettroretinogramma.

E metti il piatto su una piccola piattaforma riscaldata ad acqua di fronte allo stimolo leggero della ciotola di Ganzfeld situato all'interno di una gabbia di Faraday. Inserire l'elettrodo di riferimento nel taglio realizzato nella spugna della piattaforma. E collegare un elettrodo di terra ottenuto commercialmente alla gabbia di Faraday.

Fissare l'elettrodo di registrazione a un portaelettro e fissare il supporto al braccio stereotassico di un micromanipolatore. Utilizzando una pipetta Pasteur di tre millimetri, rivendere la punta della spugna dell'elettrodo con una goccia della soluzione di Ringer e posizionare il microscopio nella gabbia di Faraday sulla piattaforma elettroretinogramma. Utilizzare la punta di un tessuto assorbente per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso dalla punta della spugna dell'elettrodo e al microscopio, posizionare l'elettrodo attivo in modo che la punta della spugna tocchi delicatamente la superficie corneale centrale dell'occhio larvale zebrafish.

Quindi spostare la ciotola di Ganzfeld verso la piattaforma di spugna facendo attenzione che la larva sia coperta dalla ciotola e chiudere la gabbia per ridurre il rumore elettromagnetico estraneo. La sensibilità della retina larvale di zebrafish a dimmer lampeggia aumenta con l'età. Poiché le onde a e b non sono riconoscibili a intensità inferiori a meno 1,61 log candela seconda al metro al quadrato a quattro giorni dopo la fecondazione, mentre segnali chiari sono rilevabili a queste intensità nelle larve più vecchie.

L'ampiezza dell'onda B aumenta notevolmente tra i quattro e i cinque post fecondazione. A sette giorni, il segnale a 2,48 log candela secondo al metro al quadrato è maggiore rispetto ai giorni cinque e sei dopo la fecondazione. I tempi impliciti dell'onda A e b diventano significativamente più veloci dopo cinque giorni dopo la fecondazione.

Nel complesso, questi risultati dimostrano una maturazione nella funzione retinica del pesce zebra tra i quattro e i sette giorni dopo la fecondazione. Per eseguire con successo questo protocollo è fondamentale che le spugne siano completamente sature di fluido che aiuta a mantenere la conducibilità dell'elettrodo di registrazione e abbassa i livelli di rumore. Se l'onda a è di particolare interesse, i trattamenti farmacologici possono essere applicati per bloccare la componente dell'onda b esponendo così l'onda a completa.