Name: Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Scopri come mappare la comunicazione tra piccole molecole in coculture cellulari e tissutali mediante spettrometria di massa di imaging. Questo metodo senza etichette preserva l'integrità spaziale e rivela nuovi bersagli terapeutici nel cancro ovarico.

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Finanziamento è stato fornito dal Consorzio biomedica di Chicago con il supporto dei fondi Searle a The Chicago Community Trust (C-076) (L.M.S.); University of Illinois at Chicago avvio fondi (L.M.S); Grant 543296 dall'alleanza di fondo di ricerca di cancro ovarico (M.D.); e UG3 ES029073 (J.E.B) e dal centro nazionale per avanzare traslazionale Scienze, Istituto nazionale di salute, attraverso la concessione UL1TR002003 (JEB & LMS).

Tutte le procedure di animali erano in conformità con gli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e approvato dal Comitato istituzionale animale uso e cura (IACUC) presso l'Università dell'Illinois a Chicago.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Mantenere cellule di epitelio oviduttali murino (MOE) a 37° C con 5% di CO2 in un incubatore alfa media minimo essenziale medio (αMEM) completati con 10% siero bovino fetale selenio (FBS), 2 mM L-Glutammina, 10mg/mL insulina, transferrina, (ITS) , 1,8 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), 100 U/mL di penicillina-streptomicina, la gentamicina 1mg/mL e 18,2 ng/mL estradiolo-17 β. Passare le cellule ogni 3 – 4 giorni, assicurando che non ci sono abbastanza cellule nello stesso giorno i topi saranno sacrificati.</li>
	<li>Preparare agarosio al 2% con 1 g di agarosio basso punto di fusione con 50 mL di acqua distillata. Autoclave l'agarosio, lasciarlo raffreddare e poi aliquota (1 mL) in 2 mL provette (Vedi Tabella materiali) prima dell'agarosi si solidifica. Dell'agarosi possono essere memorizzati a-20 ° C a tempo indeterminato.</li>
	<li>Preparare almeno 2 mL di media Medium (DMEM) dell'Aquila di 1 x Dulbecco per volta.</li>
	<li>Per la matrice per MALDI-TOF MS, preparare 10 mL di 5 mg/mL 1:1 l'acido alfa-ciano-4-hyroxycinnamic (CHCA): acido diidrossibenzoico (DHB) (Vedi Tabella materiali) in 90: 10 ACN:H2O + 0,1% acido trifluoroacetico (TFA). Sonicare soluzione fino a matrice è dissolto.</li>
</ol>2. mouse Colony e rimozione dell'ovaio
<ol><li>Mantenere le coppie riproduttrici di topi CD-1 utilizzando le procedure di custodia standard. Vicino il giorno del parto, controllare i topi ogni giorno in modo che l'età dei cuccioli è nota.</li>
	<li>Eutanasia cuccioli a 16 – 18 giorni di età per CO2 inalazione secondo le linee guida NIH. Consegnare la CO2 (100%) flusso di tasso del 10% – 20% volume al minuto della camera e continuare per due minuti dopo che aveva smesso di respirazione. Confermare l'eutanasia di dislocazione cervicale.</li>
	<li>Disinfettare tutte le apparecchiature chirurgiche immergendo in etanolo al 70%. Caldo L-15 media di Leibovitz con 1x penicillina-streptomicina a 37 ° C.</li>
	<li>Bagnare la superficie addominale con etanolo al 70% per disinfettare la zona e minimizzare la contaminazione con i capelli. Afferrare la pelle che copre la parete addominale utilizzando smussato forcipe e uso forbici chirurgiche per rendere una grande forma di V tagliata attraverso la pelle e la parete addominale, esponendo gli organi interni.</li>
	<li>Spostare gli organi interni al lato usando il forcipe. Individualmente, afferrare ogni corno uterino con una pinzetta e sollevare leggermente.</li>
	<li>Individuare l'ovario, che sarà alla fine del corno uterino, immediatamente di sotto del rene. Usare le forbici chirurgiche per sezionare l'ovario libero del tessuto connettivo. Quindi, tagliare il corno ovarico a metà.</li>
	<li>Spostare l'ovaia, ovidotto e circa una metà di ogni corno uterino di media L-15 di Leibovitz pre-riscaldato.</li>
	<li>Sotto un microscopio per dissezione muovere con cautela ogni ovaia da bursa circostante, liberandola dal ovidotto, bursa e qualsiasi tessuto adiposo. Spostare ogni ovaia un nuovo piatto di media L-15 di Leibovitz.</li>
	<li>Tagliare ogni ovaia a metà assialmente. Tenere i pezzi ovarici (ora chiamati espianti) mantenuti a 37 ° C fino al fasciame di agarosio.</li>
</ol>3. impostazione e incubando il vetrino ITO-trattati per Cocultures
<ol><li>
Cocultures indivisa
	<ol>
<li>Fluidifica l'agarosio a 70 ° C su una piastra calda.</li>
		<li>Posizionare il divisore 8 pozzetti in cima il tinoxide di Indio (ITO)-trattato diapositiva (Figura 1A). Il fondo in gomma sul divisore aiuta nella adesione alla diapositiva, ma assicurarsi di applicare continuo leggera pressione verso il basso durante la placcatura dell'agarosi per garantire nessuna colatura o miscelazione tra pozzetti.</li>
		<li>Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugare (5 min a 800 giri/min) e risospendere a 50K cellule per 150 µ l 1 x DMEM media. Se una cella diversa densità è ottima, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare è 2x la densità finale desiderata (ad esempio, per una concentrazione finale di 50.000 cellule a 300 µ l, densità delle cellule in questa fase è 50.000 cellule in 150 µ l).</li>
		<li>Prima coltura cellulare di placcatura, aggiungere explant ovarico al centro del pozzo (Figura 1B).</li>
		<li>Aggiungere dell'agarosi per ogni coltura cellulare in provette individuali 2 mL appena prima di placcatura. Per ciascun pozzetto, combinare 200 µ l di sospensione cellulare e 200 µ l di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzi, combinare 800 µ l di sospensione cellulare e 800 µ l di agarosio al 2%. Qualche miscela sarà lasciato, ma che rende un po' più del necessario evita bolle d'aria durante il pipettaggio.<ol>
<li>Aggiungere dell'agarosi per colture cellulari individuali immediatamente prima di tale coltura cellulare di placcatura. L'agarosio sarà freddo in meno di un minuto, quindi preparatevi a piastra rapidamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Immediatamente aggiungere 300 µ l di miscela delle cellule/agarosio in ciascun pozzetto (Figura 1). Figura 1 Mostra tre condizioni di cella e condizione uno dei media, che ognuno placcato con e senza un ovaio.</li>
		<li>Incubare il vetrino a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cocultures diviso.
	<ol>
<li>Tagliare i divisori in plastica sottile, liscia (Figura 2A). Nota: Questo esperimento utilizza i lati di un bacino di terreno sterile usa e getta, perché sono piatte e sottili. Tagliarli appena sufficientemente ampia per adattarsi comodamente l'ipotenusa del pozzo (~ 13 mm).</li>
		<li>Fluidifica l'agarosio a 70 ° C su una piastra calda.</li>
		<li>Posizionare il divisore 8 pozzetti in cima alla diapositiva di ITO-trattati (Figura 2B). Il fondo in gomma sul divisore aiuta nella adesione alla diapositiva, ma assicurarsi di applicare continuo leggera pressione verso il basso durante la placcatura dell'agarosi per garantire nessuna colatura o miscelazione tra pozzetti.</li>
		<li>Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL, centrifugare (5 min a 800 giri/min) e risospendere a 50K cellule per 150 µ l 1 x DMEM media. Se una cella diversa densità è ottima, assicurarsi che in questa fase la sospensione cellulare è 2 volte la densità finale desiderato (ad esempio per una concentrazione finale di 50.000 cellule a 300 µ l, densità delle cellule in questa fase è 50.000 cellule in 150 µ l).</li>
		<li>Inserire i divisori in plastica diagonalmente in pozzetti (Figura 2).</li>
		<li>Aggiungere dell'agarosi per ogni sospensione cellulare uno alla volta poco prima di placcatura. Per ciascun pozzetto, combinare 100 µ l di sospensione cellulare e 100 µ l di agarosio liquefatto in una provetta da 2 mL. Ad esempio, per quattro pozzi, combinare 400 µ l di coltura cellulare e 400 µ l di agarosio al 2%. Alcune cellule/agarosio miscela sarà lasciato ma rendendo un po' più del necessario evita bolle d'aria durante il pipettaggio.<ol>
<li>Aggiungere dell'agarosi per colture cellulari individuali immediatamente prima di tale coltura cellulare di placcatura. L'agarosio sarà freddo in meno di un minuto, quindi preparatevi a piastra rapidamente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Su un lato del divisore, piastra 150 µ l di miscela delle cellule/agarosio. Consentire l'agarosio a raffreddare e solidificare (circa un minuto) e poi rimuovere il divisore (Figura 2D).</li>
		<li>Posizionare al centro della metà vuota del pozzo espianto dell'ovaia. Miscela di media/agarosio posto 150 µ l sopra la parte superiore dell'ovaia e solo nel lato corretto del pozzo (Figura 2E).</li>
		<li>Incubare il vetrino a 37 ° C e 5% di CO2 in un incubatore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Slide di essiccazione e preparazione per MALDI-TOF MS
<ol><li>Dopo quattro giorni (o punto orario preferito), rimuovere il divisore camera dalle spine dell'agarosi e lo scivolo (Figura 1). Staccare delicatamente i lati dell'agarosi dalla camera con una spatola piatta e tirare delicatamente la camera verso l'alto, facendo attenzione a non spostare eventuali spine dell'agarosi. Se si muovono, delicatamente riposizionarli in modo che non toccano un l'altro.</li>
	<li>Porre il vetrino in un forno di 37 ° C per circa 4 h, rotazione di 90° ogni h. Nota: La rotazione della diapositiva è importante per garantire la distribuzione uniforme del calore in tutto il campione.</li>
	<li>Una volta asciutto, rimuovere il vetrino dal forno (Figura 1E).</li>
	<li>Applicare la soluzione di matrice usando lo spruzzatore (Figura 1F), con i seguenti parametri: temperatura = 30 ° C, portata = 0,2 mL/min, numero di passaggi = 8, direzione = CC e distanza dell'ugello = 40 mm. Nota: Al posto di uno spruzzatore di matrice, un aerografo artistico consente di applicare la matrice liquida. La stessa soluzione di matrice può essere utilizzata per spruzzare, ma circa due volte tanto soluzione è necessaria. Con lo scivolo bloccato affinché si blocca in verticale, spruzzare la diapositiva da un angolo di 90° da circa un piede di distanza (adattato da Hoffmann15) fino a quando la matrice di livello è visibile.</li>
	<li>Aggiungere 1 µ l di calibratore (fosforo rosso per obiettivi < 500 Da, una miscela di peptidi (Vedi Tabella materiali) per obiettivi < Da 5.000) a clear spot sulla diapositiva. Fosforo rosso non richiede nessuna mescolanza con matrice, ma la miscela peptidica miscela 1:1 con matrix per aiutare la ionizzazione. Attendere il calibratore a secco.</li>
	<li>Disegnare una X usando un pennarello indelebile in ogni angolo della diapositiva e prendere un'immagine ottica utilizzando una fotocamera o uno scanner a 1.200 dpi.</li>
</ol>5. acquisizione di dati di spettrometria di massa imaging
<ol><li>Aprire una nuova sequenza sul software di analisi dati IMS (Vedi Tabella materiali). Impostare la larghezza della trama per risoluzione spaziale desiderata, almeno 50 µm.</li>
	<li>Caricare l'immagine ottica della diapositiva per il software di analisi e insegnare set tre punti utilizzando le intersezioni nella x disegnata in ogni angolo.</li>
	<li>Designare le regioni di interesse per l'imaging del software di acquisizione e denominarli conseguenza.</li>
	<li>Calibrare lo strumento utilizzando il software di acquisizione dati (Vedi Tabella materiali) all'interno di errore di 5 ppm.</li>
	<li>Salvare il metodo ottimizzato e cominciare il funzionamento. Questo esperimento ottimizzato i seguenti parametri: polarità = positivo, rivelatore = Reflectron, dimensione Laser = 2, Potenza Laser = 50%, riflettore modalità rivelatore guadagno = 3x.</li>
</ol>6. elaborazione dati IMS
<ol><li>.Mis file di importazione in un software statistico (Vedi Tabella materiali) per l'analisi del significato.</li>
</ol>

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<li>Choi, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTERT+Mediates+Norepinephrine-Induced+Slug+Expression+and+Ovarian+Cancer+Aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness.</a> Oncogene. 34 (26), 3402(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

C'è un corpo crescente di prova che implica il ruolo di noradrenalina in HGSOC12,17,18, e questa tecnica ha contribuito più meccanicistici informazioni. Con almeno otto condizioni biologiche presenti nella stessa diapositiva, il metodo può rappresentare controlli biologici come gene e specificità delle cellule come pure i controlli multimediali in un singolo IMS eseguire. Mentre il metodo è stato ottimizzato per valutare scambia...

Spettrometria di massa (IMS) di imaging è stato ottimizzato per caratterizzare la distribuzione spaziale delle caratteristiche molecolari in tre applicazioni ampiamente usate: fettine di tessuto, sferoidi e colonie microbiche1,2,3. Fettine di tessuto possono essere utilizzati per valutare la localizzazione di metaboliti nel contesto di condizioni biologiche in un host, mirati o ciechi in uno specifico intervallo di massa. Tuttavia, le differenze tra le caratteristiche molecolari sono il più significativo ed evidente quando un tessuto sano è rispetto a una condizione di malato, ad esempio, un tumore. Questo approccio IMS è particolarmente adatto alla rilevazione di biomarcatori di malattia, tuttavia, l'acquisizione di campioni di tessuto alle fasi discrete in progressione di malattia (ad esempio, classi di tumore) esclude l'identificazione dei segnali che potrebbero essere importanti per l'inizio della malattia. Lo scambio di informazioni attraverso lo spazio è una caratteristica onnipresente di molti sistemi biologici, e fettine di tessuto non possono catturare questo relè chimico dinamico. Una tecnica che è in grado di visualizzare la diffusione e lo scambio chimico è IMS di colonie microbiche coltivate su piastre di agar; piccole molecole sono in grado di diffondere attraverso e l'agar e possono essere acquisiti tramite spettrometria di massa di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF)4. Questa configurazione di crescita può essere utilizzata per identificare le molecole scambiati tra entità biologiche discrete (colonie) e può anche determinare la direzionalità della produzione del metabolita. La piattaforma progettata originariamente per la crescita di colonie microbiche è stata adattata per esplorare il metabolismo primario degli espianti di tessuto coltivato con cellule di mammifero e IMS è stato usato per valutare lo scambio chimico dinamico in un sistema di mammiferi in vitro.
Negli ultimi anni, è diventato chiaro che il cancro ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) spesso ha origine nell'epitelio del tubo fallopian (FTE) e quindi si riproduce per metastasi all'ovaia durante malattia precoce sviluppo5,6, 7 , 8. il motivo che FTE tumorigeniche cellule diffusione all'ovaia, dove grandi tumori alla fine formano e riprodurrsi per metastasi ulteriormente, è attualmente poco chiaro. Precedenti ricerche si sono concentrate sul ruolo delle proteine ovariche nella metastasi primaria all'ovaia; Tuttavia, recentemente è stato dimostrato che la transizione da un sano ad un tessuto cancerogeno provoca enorme perturbazione del metabolismo cellulare e altera la produzione di piccole molecole9,10,11. Di conseguenza, abbiamo supposto che piccole molecole scambiati tra il FTE e l'ovaia possono essere parzialmente responsabile di metastasi primaria di HGSOC.
Utilizzando la nostra procedura IMS recente sviluppato, abbiamo determinato che coculture delle FTE tumorigeniche e tessuto ovarico sano induce la produzione di noradrenalina dall'ovaio. Tuttavia, in altri tipi cellulari o cellule normali FTE non hanno provocato questo effetto. Un beneficio straordinario di questo metodo è che la produzione molecolare e lo scambio di segnali che rappresentano molecole reali possono essere visualizzati, quindi anche in un coculture è possibile determinare l'origine di un segnale. Questo è un vantaggio sopra l'analisi dei campioni omogeneizzati, dove si perde tutte le informazioni spaziali. Nel nostro sistema modello, siamo stati in grado di assegnare chiaramente la produzione di noradrenalina all'ovaia. Noradrenalina è stata collegata alla metastasi e chemioresistenza dei cancri ovarici, e nostro rilevamento di questa molecola ha convalidato che il nuovo metodo IMS può scoprire molecole biologicamente rilevanti12,13, 14. questa convalida ci permette di proporre che questa nuova applicazione di IMS può essere particolarmente utile per ricercare gruppi che tentano di identificare piccole molecole in ambienti coculture e per comprendere i primi eventi che influenzano la trasformazione delle cellule e la metastasi. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di delucidare l'identità e la distribuzione spaziale di piccole molecole durante lo scambio tra tessuti e organi, rappresentati da in vitro colture cellulari 3D o ex vivo del tessuto.

<table><tbody><tr><td>Provette Falcon da 15 mL</td><td>Denville</td><td>C1017-O</td><td>Per raccogliere le cellule</td></tr><tr><td>Camera a 8 pozzetti (Millipore EZ-slide chamber)</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0816</td><td>Riproposto da Millipore Millicell EZ-slide chamber slide slide</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998-4L</td><td>Solvente per matrice spruzzata</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (&alpha; MEM)</td><td>Fisher</td><td>10-022-CV</td><td>Terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Velocità Autoflex MALDI-TOF LRF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Per l'analisi dei dati IMS</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5810 R</td><td>Per raccogliere le cellule e rimuovere il surnatante</td></tr><tr><td>CHCA Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201344</td><td>Matrix spruzzato su vetrino essiccato</td></tr><tr><td>DHB Matrix</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8201346</td><td>Matrix spruzzato su vetrino asciutto</td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Fisher</td><td>22-079-707</td><td>Per la rimozione delle ovaie</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Fisher</td><td>13-804-6</td><td>Per la rimozione delle ovaie</td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Terreno miscelato con agarosio</td></tr><tr><td>fattore di crescita epidermico</td><td>Peprotech Inc.</td><td>100-15</td><td>Integratore di terreni per colture cellulari</td></tr><tr><td>Provette Eppendorf</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-282</td><td>Per aliquote di agarosio</td></tr><tr><td>Estradiolo-17&beta;</td><td>Simga-Aldrich</td><td>E2758</td><td>Integratore per terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Denville</td><td>fb5001</td><td>Integratore per terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>FlexControl 3.4</td> Software <td>di acquisizione dati</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td> IMS</tr><tr><td>FlexImaging 4.1</td> Software <td>di analisi dati</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td> IMS</tr><tr><td>Pinze (fine)</td><td>Fsiher</td><td>22-327379</td><td>Per la rimozione del ovaie</td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Cellgro</td><td>30-005-CR</td><td>Integratore di terreni per colture cellulari</td></tr><tr><td>Insulina, transferrina, selenio (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11074547001</td><td>Supplemento per terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Vetrino rivestito in ITO</td><td>Bruker</td> 8237001 <td>Piattaforma per l'incubazione in co-coltura</td><td></td></tr><tr>Terreni di <td>11415064</td><td>Gibco</td><td>L-15 Medium di Leibovitz</td><td>utilizzati durante i tessuti dissezione</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Integratore di terreni per colture cellulari</td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>Miscelato con terreni per la placcatura</td></tr><tr><td>Bacino dei terreni</td><td>Corning</td><td>4870</td><td>Utilizzato per tagliare divisori in plastica per camere divise</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Supplemento</td></tr> <tr><td>ai terreni per colture cellulariCalibrazione dei peptidi Standard</td><td>Bruker Daltonic</td><td>8206195</td><td>Calibrante per gamma di massa media</td></tr><tr><td>Phophorus red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343-242-5G</td><td>Calibrante per gamma di massa bassa</td></tr><tr><td>SCiLS Lab 2015</td><td>Bruker Daltonic</td><td></td><td>IMS analisi statistica dei dati</td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche (smussate)</td><td>Fisher</td><td>08-875-8B</td><td>Per la rimozione delle ovaie</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Tecnologie</td><td>A116-50</td><td>Aggiunto alla soluzione</td></tr><tr><td>matrice TM Spruzzatore</td><td>HTX Tecnologie</td><td></td><td>Per l'applicazione della matrice</td></tr></tbody></table>

acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di imaging

Capturing Small Molecule Communication Between Tissues and Cells Using Imaging Mass Spectrometry

Spettrometria di massa (IMS) di imaging ordinariamente è stato applicato a tre tipi di campioni: sezioni di tessuto, sferoidi e le colonie microbiche. Questi tipi di campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo-di-volo del desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-TOF MS) per visualizzare la distribuzione di proteine, lipidi e metaboliti attraverso il campione biologico di interesse. Abbiamo sviluppato un metodo di preparazione del campione romanzo che unisce i punti di forza delle tre applicazioni precedenti per affrontare un approccio underexplored per l'identificazione di comunicazione chimica nel cancro, tramite la semina di colture di cellule di mammifero in agarosio in coculture con tessuti sani seguiti da essiccazione del campione. Cellule e tessuti di mammiferi sono cocultured nelle immediate vicinanze permettendo la comunicazione chimica tramite diffusione tra i tessuti e le cellule. Intervalli di tempo specifici, il campione basato su agarosio è asciugato nello stesso modo come colonie microbiche preparato per l'analisi IMS. Il nostro metodo è stato sviluppato per la comunicazione tra cancro ovarico sieroso di alta qualità derivata dal tubo fallopian come interagisce con l'ovaia durante metastasi di modello. Ottimizzazione della preparazione del campione ha portato alla identificazione di noradrenalina come componente chimico chiave nel microambiente ovarico. Questo metodo di recente sviluppato può essere applicato ad altri sistemi biologici che richiedono una comprensione della comunicazione chimica tra celle adiacenti o tessuti.

Una diapositiva in modo ottimale secca di ITO si tradurrà in un piatto campione essiccato con minima o nessuna rughe su tutta la superficie del agarosio e pezzi di agarosio che mantengono la separazione spaziale sulla diapositiva (Figura 3). Figura 3A Mostra asciugatura ottimale, mentre Figura 3B Mostra le rughe che dovrebbero essere evitate. Questa ottimizzazione richiede un'attenta sorveglianza del...

Un nuovo metodo di preparazione del campione è stato sviluppato per ospitare coculture delle cellule e del tessuto per rilevare cambio piccola molecola usando la spettrometria totale imaging.

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

Imaging mass spectrometry (IMS) has routinely been applied to three types of samples: tissue sections, spheroids, and microbial colonies. These sample ...

Il nostro protocollo può mappare la comunicazione chimica di piccole molecole tra cellule e tessuti, e lo abbiamo applicato specificamente per esplorare piccole molecole nella metatesi del cancro alle ovaie. Il principale vantaggio della nostra tecnica è la capacità di misurare piccole molecole in modo privo di etichette mantenendo l'integrità spaziale di cellule e tessuti in 2D. Questa tecnica ci ha permesso di interrogare il contributo di piccole molecole nelle metastasi tumorali ovariane in modo non mirato.Ciò potrebbe svelare nuovi obiettivi terapeutici e percorsi che sono stati precedentemente trascurati. Questa metodologia potrebbe essere facilmente estesa ad altri tumori che possono essere coltivati in agarosio e a qualsiasi altra malattia in cui una componente spaziale potrebbe essere importante per il fenotipo cellulare risultante. Garantire che tutte le cellule e i componenti siano in mano e la pazienza con il processo di asciugatura è essenziale per questo protocollo.Una fase di essiccazione affrettata può spesso portare a dati di spettrometria di massa di scarsa qualità. La dimostrazione visiva di questo metodo è utile per comprendere le nostre fasi di preparazione e essiccazione del campione, poiché queste si discostano notevolmente dai tipici esperimenti di spettrometria di massa di imaging che usano tessuti o microbi sull'agar. Per iniziare, liquefare l'agarosio a 70 gradi Celsius su una piastra calda.Posizionare il divisore a otto pozzi sopra la diapositiva trattata con ITO. Attraverso il trattamento standard della tripsina, raccogliere le cellule MOE in un tubo conico da 15 millilitri, centrifugare e aggiungere un supporto DMEM uno per resuspend per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule per 150 microlitri, che è due volte la densità finale desiderata. Per le coculture indivise, utilizzare le flesse per aggiungere espianto ovarico al centro dei quattro pozzi.Poco prima della placcatura, unire 200 microlitri di sospensione cellulare e 200 microlitri di agarosio liquecificato in singoli tubi a due millilitri. Evitare bolle d'aria durante la pipettazione. Immediatamente, aggiungere 300 microlitri della miscela cellula-agarosio ad ogni pozzo e applicare una pressione discendente delicata continua sul divisore per garantire che non perda o mescola tra i pozzi.Assicurati che non ci siano bolle d'aria e che l'ovaio rimanga al centro del pozzo. Se l'agarosio pipettato disturbava l'ovaio, utilizzare delicatamente la punta della pipetta per centrarla prima che l'agarosio si raffredda. Quindi, incubare lo scivolo a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato.Per coculture divise, tagliare divisori da plastica sottile e liscia. Vengono utilizzati i lati di un bacino multimediale sterile e monouso. Tagliarli abbastanza larghi da adattarsi perfettamente all'ipotenusa del pozzo.Posizionare il divisore a otto pozzi sopra lo scivolo trattato con ITO e inserire divisori di plastica diagonalmente nei pozzi. Preparare le colture cellulari come fatto in precedenza e combinare 100 microlitri di sospensione cellulare e 100 microlitri di agarosio liquecificato in un tubo a due millilitri. Immediatamente, piastra 150 microlitri di miscela cellula-agarosio su un lato del divisore mantenendo la pressione verso il basso sul divisore.Lasciare raffreddare e solidificare l'agarosio per circa un minuto, quindi rimuovere il divisore. Utilizzare le forcep per posizionare l'espianto dell'ovaio al centro della metà vuota del pozzo. Aggiungere 150 microlitri di miscela cellula-agarosio sopra la parte superiore dell'ovaio.Incubare lo scivolo a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato. Dopo quattro giorni, rimuovere il divisore a camera dalle spine di agarosio. Con una spatola piatta, staccare i lati dell'agarosio dalla camera e tirare delicatamente la camera verso l'alto.Se le spine di agarosio vengono spostate, riposizionarle delicatamente in modo che non si tocchino a vicenda. Posizionare lo scivolo in un forno Celsius di 37 gradi per circa quattro ore e ruotare di 90 gradi ogni ora per garantire una distribuzione uniforme del calore in tutto il campione. Lo scivolo deve essere completamente asciugato.Altrimenti, può portare a un'esplosione del campione nell'ambiente ad alto vuoto dello spettrometro di massa MALDI-TOF. Asciugare lo scivolo e monitorare i progressi è il passo più critico per ottenere spettri di massa ad alta risoluzione spaziale e qualità. Se si verificano sfaldamento o rughe eccessive, si sconsiglia di raccogliere i dati della spettrometria di massa.Con i parametri impostati sull'spruzzatore a matrice, applicare la soluzione a matrice alla diapositiva. Per utilizzare Phosphorus Red come calibante, aggiungere un microlitro di Phosphorus Red in una punto chiara sullo scivolo. Per utilizzare la miscela peptidica come calibante, mescolarla con matrice su Parafilm in un rapporto uno a uno per aiutare la ionizzazione e individuare da 0,5 a un microlitro sullo scivolo.Attendere che il calibrant si asciughi prima di ottenere l'acquisizione di dati di spettrometria di massa. Disegna una X usando un marcatore permanente in ogni angolo della diapositiva e scatta un'immagine ottica usando una fotocamera o uno scanner a 1200 dpi. In questo esperimento, un attento monitoraggio dello scivolo nel forno è essenziale per garantire uno scivolo ITO essiccato ottimale, che si traduce in un campione piatto essiccato con rughe minime o nessuna sulla superficie dell'agarosio.Questa figura mostra le rughe che dovrebbero essere evitate. Le rughe possono influenzare leggermente l'altezza e quindi la precisione di massa dei segnali di spettrometria di massa di imaging. Lievi rughe non influiranno sulla qualità dei dati.Un tessuto situato in modo ottimale dovrebbe essere il più vicino possibile al centro. Il tessuto utilizzato dovrebbe essere al centro del pozzo se è indiviso o al centro del mezzo triangolo se è diviso in modo che l'acquisizione di dati IMS non sia contaminata da effetti sui bordi. Il tessuto mal posizionato, quando viene immaginato, può causare falsi segnali di massa dagli effetti del bordo.L'immagine di scorrimento essiccata viene utilizzata per insegnare allo spettrometro di massa MALDI-TOF quali regioni image. Piccole regioni intorno al tessuto ovarico sono state selezionate per l'IMS a 50 micrometri. Un'immagine rappresentativa di un segnale m-over-z viene mostrata per le coculture indivise, così come per la configurazione della camera divisa.La cosa più importante da ricordare è che i dati risultanti sono buoni solo quanto la preparazione del campione. Prestare particolare attenzione al processo di asciugatura. L'aspetto più eccitante è convalidare le piccole molecole scoperte in questo modo usando altri esperimenti, come test di invasione o test di colonizzazione, per informare sull'effettiva concentrazione e tradurre in biologia umana.Ci aspettiamo che questo apra la porta alla scoperta di nuovi percorsi di potenziali obiettivi terapeutici per il cancro alle ovaie comprendendo meglio i processi nella metatesi primaria del cancro alle ovaie.

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Desorbimento elettrospray ionizzazione spettrometria di massa (DESI-MS) è un metodo di ambiente da cui i campioni, tra cui i tessuti biologici, possono essere esposte con preparazione del campione minima. Con rastering il campione al di sotto della sonda di ionizzazione, questa tecnica a spruzzo a base fornisce sufficiente risoluzione spaziale di discernere le caratteristiche molecolari di interesse all'interno di sezioni di tessuto.

Imaging dei tessuti biologici per desorbimento Electrospray ionizzazione Spettrometria di Massa

Qui, presentiamo i protocolli per eseguire sia l'imaging con spettrometria di massa ambientale (MSI) dei tessuti che l'analisi in situ di MS a singola cellula viva (SCMS) utilizzando la sonda singola, che è un dispositivo multifunzionale miniaturizzato per l'analisi MS.

Applicazioni del singolo-probe: Mass Spectrometry Imaging e analisi singola cella in condizioni ambientali

Una piattaforma di manipolazione cellulare integrata è sviluppata per l'uso in combinazione con una configurazione di spettrometria di massa a singola sonda per l'analisi on-line delle singole cellule delle sospensioni in condizioni ambientali.

Piattaforma di manipolazione cellulare integrata accoppiata con la sonda singola per l'analisi della spettrometria di massa di farmaci e metaboliti in singole cellule di sospensione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una guida dettagliata sulla preparazione del campione quando si pianificano esperimenti utilizzando MALDI MSI per massimizzare il rilevamento metabolico e molecolare in campioni biologici.

Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

Nell'era dell'immunoterapia del cancro, l'interesse nel chiarire le dinamiche del microambiente tumorale è aumentato in modo sorprendente. Questo protocollo descrive in dettaglio una tecnica di imaging con spettrometria di massa rispetto alle sue fasi di colorazione e imaging, che consentono un'analisi spaziale altamente multiplexata.

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Viene dimostrato un nuovo metodo di preparazione del campione per l'analisi di macrocolonie batteriche a base di agar mediante spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice.

Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

È stato sviluppato un metodo avanzato per l'imaging con spettrometria di massa (MSI) di organoidi cerebrali che consente di mappare le distribuzioni dei metaboliti all'interno di questi modelli. Questa tecnologia offre informazioni sulle vie metaboliche cerebrali e sulle firme dei metaboliti durante lo sviluppo precoce e nella malattia, promettendo una comprensione più profonda della funzione cerebrale umana.

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Questo protocollo delinea l'uso della microMS per la spettrometria di massa MALDI-2 a cellula singola guidata dalla fluorescenza, consentendo una migliore profilazione molecolare delle cellule neuronali primarie di ratto.

Desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice guidata da fluorescenza con spettrometria di massa di postionizzazione indotta da laser di singole cellule neurali di ratto

Questo protocollo mira a preservare i metaboliti cellulari per la spettrometria di massa a singola cellula (SCMS) combinando il lavaggio con soluzione salina volatile, l'estinzione rapida dell'azoto liquido, la liofilizzazione e lo stoccaggio a -8 °C. Dimostra che l'estinzione dell'azoto liquido è essenziale per mantenere i profili dei metaboliti, mentre la conservazione prolungata del freddo dovrebbe essere ridotta al minimo per prevenire alterazioni metaboliche.

Preparazione del campione per la spettrometria di massa a singola cellula Studi di metabolomica: lavaggio, tempra, essiccazione e conservazione combinati delle cellule

Questo protocollo descrive l'imaging di spettrometria di massa a singola cella delle celle OVCAR-8 utilizzando ionizzazione elettrospray a desorbo accoppiata a spettrometri di massa Orbitrap per analisi metabolomiche ad alta risoluzione spaziale.

Imaging con spettrometria di massa a singola cella utilizzando ionizzazione elettrospray da desorbiamento accortata agli spettrometri di massa Orbitrap

Scopri come mappare la comunicazione tra piccole molecole in coculture cellulari e tissutali mediante spettrometria di massa di imaging. Questo metodo senza etichette preserva l'integrità spaziale e rivela nuovi bersagli terapeutici nel cancro ovarico.

Acquisizione di piccola molecola comunicazione tra tessuti e cellule mediante spettrometria di massa di Imaging

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