Isolamento e valutazione quantitativa delle celle pennello dalle trachea del topo
June 12th, 2019
Le cellule pennello sono rare cellule epiteliali colinergiche chesidiche che si trovano nella trachea del topo ingenuo. A causa del loro numero limitato, la valutazione ex vivo del loro ruolo funzionale nell'immunità e nel rimodellamento delle vie aeree è impegnativa. Descriviamo un metodo per l'isolamento delle cellule del pennello tracheale dalla citometria di flusso.
Abbiamo sviluppato una procedura per l'isolamento delle cellule a pennello tracheali, rare cellule epiteliali chemiosenoriali specializzate da topi reporter fluorescenti acetiltransferasi colina. Questo metodo si basa su una separazione iniziale dell'epitelio tracheale dalla sottomucosa che consente una successiva incubazione più breve del foglio epiteliale con papaina. Ciò consente un robusto recupero delle celle a pennello tracheale ed è stato utilizzato con successo per l'isolamento e l'analisi trascrizionale delle cellule pennello mediante sequenziamento dell'RNA.
La lunga incubazione con enzimi digestivi può ridurre la vitalità cellulare e alterare il profilo trascrizionale delle cellule isolate dai tessuti. Qui separiamo l'epitelio tracheale con la dispasi e successivamente lo incubamo con la papaina per un breve periodo di tempo producendo alte rese di cellule di pennello vitali. Il nostro metodo può contribuire agli studi sull'epitelio delle vie aeree superiori.
Lo stesso protocollo può essere applicato all'isolamento delle cellule pennello da altri siti mucosi come il tessuto nasale. La dimostrazione della nostra tecnica altamente riproducibile consentirà agli scienziati pari di isolare e indagare ulteriormente le cellule del pennello tracheale. Per iniziare questa procedura, aggiungere la dispasi e la DNasi I al PBS alle concentrazioni finali qui mostrate per preparare la soluzione di digestione della dispasi.
Assicurarsi che la polvere dispasi sia completamente sciolta prima di riscaldare la soluzione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Aggiungere quindi FBS inattivato al 5% a DMEM per preparare una soluzione di arresto. Per preparare il tampone Tyrode I, aggiungere papaina e L-cisteina al tampone di HEPES Tyrode senza calcio.
Per preparare il tampone Tyrode II, aggiungere la leupeptina al tampone di HEPES Tyrode senza calcio ad una concentrazione di due microlitri per millilitro. Per preparare il tampone FACS, utilizzare la soluzione di sale bilanciato di Hank senza calcio, magnesio e rosso fenolo integrata con due EDTA millimolare e 2%FBS. Dopo aver eutanasiato il mouse, utilizzare aghi calibro 21 per fissarlo su una scheda chirurgica in posizione supina con estremità superiore e inferiore estese.
Spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo per sanificare l'area. Usando le forcette dritte, sollevare la pelle e la pelliccia dell'addome e utilizzare forbici sezionanti per fare un'incisione al centro. Usando le forbici, separare la pelle dal tessuto sottocutaneo dall'addome alla mandibula.
Tenendo il tessuto sottocutaneo con le forcep, fare una piccola incisione con le forbici al centro della parete addominale. Quindi aprire il peritoneo con un'incisione a forma di V. Usando le forcep, spostare delicatamente l'intestino tenue di lato.
Individuare l'aorta addominale e la vena cava e fare un'incisione con le forbici dissezionanti per consentire una rapida dissanguamento. Individuare il diaframma. Usando un ago calibro 18, fai un'apertura nel diaframma appena sotto lo sterno per sgonfiare i polmoni.
Utilizzando forbici dritte affilate, tagliare lungo la base delle costole per separare accuratamente il diaframma dalla gabbia toracica. Utilizzare le forcep per sollevare l'estremità esposta dello sterno e tagliare lo sterno longitudinalmente dalla base della gabbia toracica al collo. Utilizzare forbici corte dritte per fare un'incisione cervicale centrale e separare i due lobi della ghiandola sottomandibolare.
Successivamente, utilizzare un paio di forcelle ad alta precisione a punto fine per rimuovere con cura il tessuto connettivo circostante e il timo sovrascrivono la carena. Sezionare la trachea libera separando prima l'estremità prossimale a livello dell'epiglottide e poi sezionando l'estremità distale a livello della biforcazione della trachea. Individuare l'epiglottide e tagliare la trachea longitudinalmente dall'epiglottide alla carena.
Per iniziare, posizionare la trachea in un tubo da 1,5 millilitri contenente 750 microlitri di soluzione di digestione della dispasi pre-riscaldati a 37 gradi Celsius. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta e incubare su uno shaker a 200 giri/min e a temperatura ambiente per 40 minuti. Quindi aggiungere 750 microlitri di DMEM con 5%FBS per interrompere la reazione e posizionare il tubo sul ghiaccio.
Trasferire la trachea in una piastra di Petri. Orientare la trachea con il lato epiteliale rivolto verso l'alto. La trachea sezionata longitudinalmente ha una forma semicilindrica mantenuta dagli anelli cartilaginei.
L'epitelio si trova sulla superficie concava. Utilizzando le forcette dritte, incollare l'area dell'epiglottide della trachea alla piastra di Petri e utilizzare un bisturi di smaltimento di dimensioni 22 per raschiare l'epitelio dalla trachea. Lo strato epiteliale si separerà come foglio traslucido.
Utilizzare il bisturi per tritare l'epitelio e trasferire lo strato epiteliale in un tubo da due millilitri. Risciacquare la piastra di Petri con 750 microlitri di tampone Tyrode I e trasferirlo nel tubo contenente lo strato epiteliale. Coprire il tubo con un foglio di alluminio per ridurre l'esposizione alla luce diretta e incubare a 37 gradi Celsius su uno shaker a 200 giri/min per 30 minuti.
Quindi aggiungere 750 microlitri di tampone Tyrode II freddo. Vortice vigorosamente il tessuto digerito per 20-30 secondi. Utilizzando una siringa attaccata a un ago calibro 18, triturare l'omogeneato 10 volte.
Successivamente, passare a un ago calibro 21 e triturare da 10 a 20 volte in più. Filtrare le celle attraverso un colino da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere il buffer FACS freddo con un rapporto volumetrico di 30 a uno.
Centrifuga a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet nel tampone FACS freddo. Trasferire questa sospensione su un tubo di polistirolo da 12 per 75 millimetri.
Centrifugare di nuovo a 350 volte g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Aggiungere quindi un microlitro di anticorpo bloccante CD1632 anti-mouse per bloccare il legame non specifico e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.
Quindi aggiungere anticorpi nei rispettivi controlli isotipo come delineato nel protocollo di testo. Incubare sul ghiaccio per 45 minuti mentre è protetto dalla luce diretta. Dopo questo, aggiungere 4,5 millilitri di tampone FACS freddo e mescolare.
Centrifuga a 350 volte g e a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet in 300 microlitri di tampone FACS freddo. Aggiungere lo ioduro di propidio immediatamente prima dell'ordinamento citometrico del flusso.
In questo studio, le cellule a pennello tracheali dei topi reporter fluorescenti acetilcolina ChAT eGFP sono isolate con successo per il sequenziamento dell'RNA. Le cellule sono identificate dai detriti dall'angolo di dispersione avanti e laterale. I doppietti sono esclusi utilizzando l'altezza e la larghezza di dispersione in avanti e l'altezza e la larghezza della dispersione laterale.
I doppietti sono le celle con valori di larghezza elevata. All'interno delle singole cellule, le cellule vive sono identificate come la popolazione che è propidio ioduro negativo. All'interno delle singole cellule vive, le cellule da basse a negative del CD45 sono identificate in base al controllo dell'isotipo.
All'interno delle cellule negative basse CD45, le cellule positive EpCAM che sono anche eGFP positive nel canale FITC sono la popolazione di cellule pennello. I numeri delle cellule spazzolate sono alterati dall'esposizione a metaboliti microbici e protozoi e quindi riflettono la variabilità del microbiota istituzionale. Pertanto, suggeriamo di stimare il numero di celle a pennello mediante microscopia a fluorescenza per misurare il numero previsto di celle di pennello isolate mediante smistamento citometrico del flusso.
Assicurarsi di separare correttamente lo strato epiteliale della trachea in quanto determina le rese delle cellule di pennello isolate. Le celle a pennello tracheale isolate possono essere utilizzate in un'ampia gamma di saggi come il sequenziamento dell'RNA, la coltura cellulare e l'analisi funzionale.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per isolare le cellule ciliate trachee, che sono rare cellule epiteliali colinergiche chemiosensoriali nella trachea del topo. La tecnica migliora il recupero di queste cellule per l'analisi funzionale nell'immunità e nel rimodellamento delle vie aeree.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Fisiologia respiratoria
Sfondo
- Le cellule ciliate trachee sono cellule epiteliali specializzate.
- Giocano un ruolo nell'immunità delle vie aeree.
- L'isolamento di queste cellule è difficile a causa della loro rarità.
- I metodi esistenti possono compromettere la vitalità delle cellule.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per isolare le cellule ciliate trachee.
- Migliorare la comprensione dei loro ruoli funzionali.
- Facilitare l'analisi trascrizionale attraverso il sequenziamento dell'RNA.
Metodi utilizzati
- Separazione dell'epitelio trachea dalla sottomucosa.
- Breve incubazione con papaina per mantenere la vitalità cellulare.
- Uso di dispase per una separazione epiteliale efficace.
- Alto rendimento nel recupero di cellule ciliate vitali.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule ciliate trachee.
- Alti tassi di vitalità delle cellule isolate.
- Il metodo consente una successiva analisi trascrizionale.
- Contribuisce agli studi sull'epitelio delle vie aeree superiori.
Conclusioni
- Il metodo sviluppato è efficace per l'isolamento delle cellule ciliate.
- Preserva la vitalità cellulare e l'integrità trascrizionale.
- Questa tecnica può far progredire la ricerca nella biologia delle vie aeree.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Isolation of rare chemosensory epithelial cells enables mechanistic de-risking of airway biology targets by providing a validated biological system for functional interrogation. This method supports target validation and assay development in respiratory disease research by delivering viable, transcriptionally intact brush cells for downstream analysis. The procedure enhances predictive confidence in early discovery by reducing biological variability associated with enzymatic dissociation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cholinergic chemosensory pathways in airway epithelial cells for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible source of viable brush cells for functional validation of airway targets.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through transcriptional profiling of isolated brush cells via RNA sequencing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized epithelial sheets for consistent preparation of brush cell suspensions in assay workflows.
- Operational Value: Short papain incubation preserves cell viability and transcriptional integrity for reliable functional readouts.
- Scientific Value: Enables quantitative evaluation of brush cell responses to microbial metabolites and protozoa exposure.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system modeling of upper airway epithelium for preclinical target validation.
- Operational Value: Offers a transferable protocol applicable to brush cell isolation from nasal and other mucosal tissues.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by linking brush cell variability to institutional microbiota exposure.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling isolation of rare epithelial cells for hypothesis-driven target validation and pathway clarification prior to screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of airway targets through viable brush cell isolation and transcriptional analysis.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions suitable for compound screening and functional assay development.
- Analytics: Provides quantitative outputs via flow cytometry and RNA sequencing for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through disease-relevant upper airway epithelium modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for brush cells across multiple mucosal sites and respiratory disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preservation of cell viability and transcriptional profiles.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined enzymatic dissociation steps and buffer preparations.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early functional analysis of rare chemosensory cells.
- Portfolio Impact: Informed go/no-go decisions based on brush cell response variability to microbial metabolites.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epithelial dissection and enzymatic tissue processing.
- Dependent on access to dispase, papain, and flow cytometry instrumentation.
- Necessitates standardization of epithelial sheet separation for consistent brush cell yields.
- Involves adaptation considerations for applying the protocol to nasal or other mucosal tissues.
- Limited by the rarity of brush cells, necessitating fluorescence microscopy for yield estimation prior to sorting.
