Name: Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Scopri la coltura ex vivo di ossa lunghe fetali e neonatali di topo per studiare lo sviluppo osseo e cartilagineo in condizioni controllate. Questo metodo consente imaging in vivo e manipolazione farmacologica diretta.

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Vorremmo ringraziare Alexandra Joyner per il suo sostegno quando questo protocollo è stato istituito, Edwina McGlinn e Yi-Cheng Chang per la condivisione di acido retinoico. L'Istituto australiano di medicina rigenerativa è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano.

Tutti gli esperimenti devono essere svolti seguendo le linee guida governative e istituzionali locali di manipolazione etica degli animali da laboratorio.
1. preparativi prima del giorno della coltura ossea
<ol><li>Impostare le accoppiamenti temporizzate del mouse per ottenere feti e cuccioli dal giorno embrionale 14,5 (e 14.5) e successivi. Nota: La cultura delle ossa lunghe può essere applicata con successo a diversi ceppi di topo; nel presente protocollo vengono utilizzati topi wild-type svizzeri di tipo Webster.</li>
	<li>Preparare il mezzo di dissezione (adattato da Houston et al.15): diluire α-minimo il mezzo essenziale (α-MEM) o il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (dmem) 1/13 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) e sterilizzare il filtro attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm, 33 mm di diametro. Conservare le aliquote a-20 ° c.</li>
	<li>Il giorno prima dell'estrazione dei feti, preparare il mezzo di coltura ossea privo di siero composto da DMEM contenente 0,2% BSA, 0,5 mM L-Glutammina, 40 U/mL penicillina/streptomicina, 0,05 mg/mL di acido ascorbico e 1 mM di betaglicofosfato. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm, 33 mm di diametro e conservare a 4 ° c per un massimo di 1 mese.</li>
	<li>Il giorno della cultura e prima dell'abbattimento del topo, preparate piatti da 24 pozzetti e 60 mm con mezzo di dissezione e mantenete il ghiaccio freddo. Preriscaldare il terreno di coltura ossea in un bagnomaria a 37 ° c. Spray 80% (v/v) etanolo sugli attrezzi (pinzette e piccole forbici) da utilizzare per la manipolazione del feto. Trasferire un mirino binoculare ad un armadietto di biosicurezza di classe II.</li>
</ol>2. cultura del feto e neonato tibia e femore
<ol><li>Cull il topo incinta attraverso la lussazione cervicale alla fase gestazionale desiderata (che vanno da E 14.5 a E 18.5). Se vengono utilizzati cuccioli neonati, rimuoverli dalla madre uno per uno e Cull da decapitazione.</li>
	<li>Posizionare il mouse sulla schiena e sterilizzare la regione addominale spruzzando 80% (v/v) di etanolo sulla sua superficie.</li>
	<li>Tagliare la pelle e il muscolo addominale con piccole forbici per accedere alle corna uterina.</li>
	<li>Estrarre l'utero dalla cavità addominale con l'aiuto di pinzette e piccole forbici, rimuovendo il Mesometrio e tagliando la base delle corna. Posizionare l'utero in una piastra di Petri da 60 mm con un mezzo di dissezione ghiacciato e mantenere il piatto di coltura sul ghiaccio durante l'intera procedura.</li>
	<li>Trasferire la capsula di Petri con l'utero nel mobile di biosicurezza e lavorare lì da ora in poi.</li>
	<li>Separare i singoli feti con le forbici tagliando tra le sacche.</li>
	<li>Trasferire il sacco individuale sotto uno stereomicroscopio di dissezione in un piatto pulito da 60 mm con mezzo di dissezione e aprirli con delle pinzette per separare i feti dai placenta e pulirlo dalle membrane. Nota: Lavorare con un embrione alla volta, mantenendo il resto sul ghiaccio.</li>
	<li>Decapitate i feti e trasferite il corpo a un nuovo piatto 60 mm pulito con una pipetta sterile tagliata da 1 mL.</li>
	<li>Rimuovere la pelle dei feti o cuccioli con pinzette a partire dalla parte posteriore e staccarlo fino alle dita dei piedi.</li>
	<li>Separare gli arti posteriori dal corpo tagliando con le pinzette vicino alla colonna vertebrale e trasferirli in un piatto pulito con mezzo di dissezione ghiaccio-freddo.</li>
	<li>Separare la tibia dal femore con le pinzette, introducendole con attenzione tra la cartilagine superficiale del femore distale e la tibia prossimale.</li>
	<li>Rimuovere le ossa dell'anca dal femore prossimale e l'osso del calcagno e la fibula dalla tibia.</li>
	<li>Rimuovere con cautela il tessuto molle dal femore e la tibia da nipping e tirando fuori. Nota: È importante rimuovere quanto più tessuto molle possibile, facendo particolare attenzione a rimuovere il tessuto che collega i due pali della cartilagine, ma evitando di danneggiare la cartilagine, il perichdri, e le ossa.</li>
	<li>Posizionare le quattro ossa (tibia e femori sinistra e destra) nel primo pozzo della piastra 24-Well con una pipetta sterile in plastica da 1 ml. In alternativa, per confrontare l'effetto di diversi trattamenti sugli arti sinistro e destro, posiziona gli arti controlaterali in pozzi diversi. Nota: Prestare maggiore attenzione quando le ossa vengono trasferite ai pozzi, in quanto possono facilmente aderire alla pipetta.</li>
	<li>Procedere allo stesso modo con il maggior numero di feti se necessario. Nota: Cambiare il piatto con il mezzo di dissezione non appena diventa troppo offuscato, in quanto è importante vedere chiaramente le ossa dissezionate.</li>
	<li>
Quando tutte le ossa desiderate vengono trasferite ai pozzi, rimuovere il mezzo di dissezione con una pipetta sterile in plastica da 1 mL e prestare attenzione a non aspirare le ossa.
	<ol>
<li>A seconda dello scopo dell'esperimento, le immagini possono essere scattate delle ossa prima di rimuovere il mezzo di dissezione, come punto zero dell'esperimento. Scattare foto con un microscopio collegato a una fotocamera digitale e annotare l'esposizione e la scala utilizzata. Per garantire misurazioni semplici e affidabili, scattare foto con un buon contrasto per distinguere la parte mineralizzata.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a ogni pozzo. Se qualsiasi trattamento è destinato alle ossa (doxiciclina, tamoxifene, fattori di crescita, ecc.), dovrebbe essere aggiunto ora.</li>
	<li>Per osservare l'effetto dell'inibizione della crescita nelle condizioni di coltura, trattare la tibia sinistra con acido retinoico (RA, 500 Nm), mentre incubando la tibia destra con un volume equivalente di veicolo (dimetilsolfossido [DMSO], concentrazione finale 0,1%) come un controllo.</li>
	<li>Lasciare che le ossa crescano per due giorni o più in un incubatore di colture cellulari in condizioni di coltura cellulare standard (a 37 ° c in un incubatore 5% CO2 ).</li>
	<li>Per valutare la proliferazione, aggiungere 5-ethynyl-2'-deossiuridina (EdU) o 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) al fluido ad una concentrazione finale di 10 μM 1 − 2h prima della fissazione. Nota: La concentrazione di stock di EdU è di 20 mM. Attenzione: EdU e BrdU sono analoghi della timidina e possono essere tossici e mutageni.</li>
	<li>Scongelare 4% paraformaldeide (PFA) e fissare le ossa per immersione in PFA in singoli tubi da 2 mL. Attenzione: PFA è tossico e designato come un probabile cancerogeno umano. Evitare di respirare la polvere e i vapori di paraformaldeide. EdU e BrdU sono analoghi della timidina e possono essere tossici e mutageni.</li>
	<li>Dopo una breve fissazione di 10 minuti in PFA a temperatura ambiente, trasferire le ossa in PBS per l'acquisizione di immagini al punto finale. Poi riposiziona le ossa in PFA per il fissaggio notturno a 4 ° c.</li>
	<li>Dopo che le ossa di fissazione possono essere elaborate per le applicazioni downstream desiderate.</li>
</ol>3. misurazione e analisi dell'intera lunghezza dell'osso e della regione mineralizzata
<ol><li>Utilizzare un software di editing di immagini per misurare la lunghezza delle ossa, tenendo conto della scala dell'immagine. Misurare sia la lunghezza totale dell'osso e la regione mineralizzata. Avviare le misurazioni dalle prime celle scure ad una estremità fino a quelle dell'ultimo all'altra estremità. Nota: La regione mineralizzata è caratterizzata dal colore più scuro e si distingue facilmente dalla cartilagine.</li>
	<li>Per calcolare il tasso di crescita, definito come l'aumento medio di lunghezza al giorno, dividere la differenza tra la lunghezza finale dell'osso e quella iniziale per il numero di giorni in coltura.</li>
</ol>

<ol><li>Long, F., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+endochondral+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of the endochondral skeleton.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334(2013).</li>
<li>Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endochondral+ossification%3A+how+cartilage+is+converted+into+bone+in+the+developing+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).</li>
<li>Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The control of chondrogenesis.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).</li>
<li>Kronenberg, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+the+growth+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of the growth plate.</a> Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).</li>
<li>Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skeleton%3A+a+multi-functional+complex+organ%3A+the+growth+plate+chondrocyte+and+endochondral+ossification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification.</a> The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).</li>
<li>Maes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast+precursors%2C+but+not+mature+osteoblasts%2C+move+into+developing+and+fractured+bones+along+with+invading+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels.</a> Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+pathways+to+endochondral+osteoblasts%3A+a+novel+chondrocyte-derived+osteoprogenitor+cell+identified+in+hypertrophic+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage.</a> Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).</li>
<li>Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+chondrocytes+can+become+osteoblasts+and+osteocytes+in+endochondral+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrocytes+transdifferentiate+into+osteoblasts+in+endochondral+bone+during+development%2C+postnatal+growth+and+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice.</a> PLoS Genetics. 10 (12), e1004820(2014).</li>
<li>Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+and+pattern+of+the+onset+of+differential+growth+among+growth+plates+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%3A+Official+Publication+of+the+Orthopaedic+Research+Society%22%5BJournal%5D)">Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).</li>
<li>Cooper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+phases+of+chondrocyte+enlargement+underlie+differences+in+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions.</a> Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).</li>
<li>Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+1alpha%2C+25-dihydroxyvitamin+D3+and+transforming+growth+factor-beta3+on+bone+development+in+an+ex+vivo+organotypic+culture+system+of+embryonic+chick+femora%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora.</a> PloS One. 10 (4), e0121653(2015).</li>
<li>Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+coordinates+oriented+cell+division+and+cell+rearrangement+in+clonally+expanding+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+for+studying+the+temporal+modulation+of+embryonic+skeletal+development+using+organotypic+bone+cultures+and+microcomputed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).</li>
<li>Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+Murine+Embryonic+Metatarsals%3A+A+Physiological+Model+of+Endochondral+Ossification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).</li>
<li>Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+rats+and+mice+as+animal+models+in+ex+vivo+bone+growth+and+development+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+%26+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies.</a> Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).</li>
<li>Lui, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+aging+of+growth+plate+cartilage+underlies+differences+in+bone+length+and+thus+helps+determine+skeletal+proportions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions.</a> PLoS Biology. 16 (7), e2005263(2018).</li>
<li>Agoston, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-type+natriuretic+peptide+regulates+endochondral+bone+growth+through+p38+MAP+kinase-dependent+and+-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways.</a> BMC Developmental Biology. 7, 18(2007).</li>
<li>Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-nonautonomous+local+and+systemic+responses+to+cell+arrest+enable+long-bone+catch-up+growth+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice.</a> PLoS Biology. 16 (6), e2005086(2018).</li>
<li>Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+ex+vivo+explant+cultures%3A+applications+in+bone+research%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research.</a> BoneKEy Reports. 5, 818(2016).</li>
<li>Okubo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+bioluminescence+monitoring+in+mouse+ex+vivo+bone+culture+revealed+persistent+circadian+rhythms+in+articular+cartilages+and+growth+plates%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates.</a> PloS One. 8 (11), e78306(2013).</li>
<li>Hirota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+analysis+of+the+growth+plate+in+a+murine+long+bone+explanted+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10332(2018).</li>
<li>Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+cell+adhesion+surface+regulates+tissue+architecture+in+growth+plate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage.</a> Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).</li>
<li>Kaucka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+clonal+cell+dynamics+enables+accurate+growth+and+shaping+of+vertebrate+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Alvarez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta2+mediates+the+effects+of+hedgehog+on+hypertrophic+differentiation+and+PTHrP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression.</a> Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).</li>
<li>De Luca, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+is+a+potent+regulator+of+growth+plate+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis.</a> Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).</li>
<li>Stern, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+Scaling+in+Developing+Long+Bones+Is+Achieved+by+an+Optimal+Epiphyseal+Growth+Balance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance.</a> PLoS Biology. 13 (8), e1002212(2015).</li>
<li>Minkin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+development+and+formation+of+osteoclast-like+cells+from+in+situ+progenitors+in+fetal+mouse+metatarsals+cultured+in+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+and+Mineral%22%5BJournal%5D)">Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium.</a> Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).</li>
<li>Erben, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErben%2C+RG+%22Handbook+of+histology+methods+for+bone+and+cartilage%22">Handbook of histology methods for bone and cartilage</a>. , Springer. 99-117 (2003).</li>
<li>Hu, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+to+bone+transformation+during+fracture+healing+is+coordinated+by+the+invading+vasculature+and+induction+of+the+core+pluripotency+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes.</a> Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).</li>
<li>Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+strain+history+of+bone%3A+spatial+uniformity+and+self-similarity+of+low-magnitude+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains.</a> Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).</li>
<li>Duncan, R. L., Turner, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+and+the+functional+response+of+bone+to+mechanical+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain.</a> Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi di coltura ossea ex vivo sono stati usati per un certo tempo per valutare la biologia della crescita ossea28, ma sono stati raramente applicati alle ossa lunghe murine. Con lo sviluppo di tecniche di imaging, la coltura ossea ex vivo offre un modo attraente per studiare la crescita ossea in tempo reale in un ambiente che assomiglia strettamente alle condizioni in vivo. In questo scenario, è importante definire le condizioni in cui la crescita delle ossa lunghe è paragonabile alla loro cre...

La crescita degli organi deve essere strettamente sintonizzata per prevenire la comparsa di disturbi della crescita, e coinvolge la regolazione di diversi tipi di cellule, vie molecolari e crosstalk tra diverse parti del corpo. Le tecniche di imaging sono essenziali per affrontare i cambiamenti che si verificano nel corso del tempo in un embrione in crescita, sia in condizioni normali, così come dopo una perturbazione è indotta nel sistema. Gli embrioni con sviluppo intrauterino, come i modelli di roditori ampiamente utilizzati, presentano una sfida aggiuntiva per l'imaging dal vivo e il trattamento farmacologico, che può essere parzialmente superato utilizzando tecniche di coltura ex vivo. Per ricapitolare con successo i processi in vivo e ottenere risultati significativi, diventa cruciale trovare le giuste condizioni di coltura per ogni organo o tessuto.
La maggior parte delle ossa dello scheletro dei mammiferi crescono attraverso l'ossificazione endocondrale, dove la cartilagine embrionale (composta da cellule chiamate condrociti) spinge la crescita longitudinale e viene gradualmente sostituita dall'osso. Questo processo avviene alle piastre di crescita, situate alla fine delle ossa lunghe, dove si distinguono tre zone: riposo, proliferativo e ipertrofico1,2. In primo luogo, i condrociti progenitrici rotondi nella zona di riposo transitano nei condrociti colonnari ciclistici nella zona proliferativa. Durante la successiva fase di differenziazione, questi condrociti diventano ipertrofici e iniziano a secchire il collagene di tipo X. I condrociti ipertrofici orchestrano le fasi successive di ossificazione: secernono molecole di segnalazione chiave, come il fattore di crescita del tessuto connettivo, le proteine morfogenetiche ossee e il riccio indiano, e dirigono la mineralizzazione della matrice, reclutano vasi sanguigni alla parte centrale dell'osso, e, su apoptosi, consentire osteoblasti (cellule che formano ossa) per invadere la matrice per formare il centro di ossificazione primaria3,4. La matrice mineralizzata facilita la penetrazione dei vasi sanguigni attraverso i quali gli osteoblasti migrano per sostituire questa cartilagine degradata con una matrice ossea5. La maggior parte degli osteoblasti invade la matrice cartilaginea dal perichdri, uno strato fibusto che avvolge la cartilagine6. In alternativa, una proporzione di condrociti ipertrofici è in grado di sopravvivere e di trasdifferenziarsi agli osteoblasti7,8,9. La lunghezza finale dell'osso è dovuta alla crescita accumulata della cartilagine transitoria, il cui tasso di crescita a sua volta dipende dal numero e dalle dimensioni dei condrociti ipertrofici e dalla loro produzione di matrici10. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la durata dell'ultima fase dell'ipertrofia è correlata alla lunghezza finale dell'osso11. Pertanto, è necessaria una stretta regolazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule per garantire la corretta dimensione ossea.
Nonostante le conoscenze sostanziali acquisite nel corso degli anni sull'organizzazione e lo sviluppo delle piastre di crescita, la maggior parte di queste conclusioni si basano sull'osservazione delle sezioni istologiche fisse. Il sezionamento dei tessuti fornisce informazioni preziose su questo processo, ma può essere guidato con artefatti tecnici, quindi non può essere sempre utilizzato in modo affidabile per stimare i cambiamenti morfologici o dimensionali tra le diverse fasi. Inoltre, poiché la crescita ossea è un processo dinamico, le immagini statiche bidimensionali (2D) offrono una visione limitata del movimento delle cellule nella piastra di crescita, mentre l'imaging time-lapse sul tessuto vivo potrebbe offrire informazioni preziose sul comportamento del condrociti nella piastra di crescita.
Tutte queste limitazioni possono essere potenzialmente risolte utilizzando colture ossee ex vivo. Mentre i protocolli di coltura ossea sono stati sviluppati qualche tempo fa, sono stati limitatamente applicati alle ossa lunghe murine. La maggior parte degli studi usa le ossa delle pollastrelle a causa dei vantaggi tecnici offerti dal pulcino modello12,13. Le colture organotipiche (interfaccia aria/liquido) sono state applicate ai femori embrionali di pulcino, che sono stati mantenuti in coltura per 10 giorni14. I sofisticati strumenti genetici disponibili nel topo rendono questo modello molto attraente per essere utilizzato nella coltura ossea ex vivo. Gli studi che hanno usato i topi per esaminare la crescita ossea hanno funzionato principalmente con le ossa metatarsali15, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni e dei numeri maggiori ottenuti per embrione16. Sebbene tradizionalmente considerate ossa lunghe, metatarsi entrano in senescenza (caratterizzata da ridotta proliferazione e involuzione della piastra di crescita17) prima di altre ossa lunghe in vivo, e quindi la loro continua crescita ex vivo non davvero ricapitolare il processo in vivo. Ai fini di questo articolo, useremo il termine ossa lunghe per le ossa delle regioni degli arti prossimali e intermedie. Diversi studi precedenti hanno usato ossa lunghe murine, come la tibia, in colture ex vivo e osservato una crescita sostanziale della cartilagine, ma poca ossificazione18. Abbiamo anche usato le colture tibiali recentemente, principalmente per studiare la dinamica dei condrociti19. Altri studi hanno usato teste femorali da giovani topi20 o solo la parte distale del femore per la cultura21. Alcune opere più recenti combinano con successo la cultura ex vivo di ossa piene con imaging time-lapse per acquisire film tridimensionali (3D) di condrociti nel tessuto vivente del topo22,23. Gli autori sono riusciti ad osservare eventi precedentemente inosservati nel riarrangiamento dei condrociti alla zona proliferativa23 in un buon esempio della potenziale applicazione della coltura ossea ex vivo. L'alternativa, cioè l'analisi delle immagini statiche, richiede tecniche indirette e complesse. Questo è stato esemplificato da un recente studio che ha valutato l'importanza di cloni orientati alla trasversalmente per la crescita della cartilagine, dove il tracciamento genetico con ceppi di topo reporter multicolore accoppiato con la modellazione matematica sono stati utilizzati24. Pertanto, la cultura ex vivo potrebbe contribuire a ottenere informazioni sui processi dinamici in modo più rapido e diretto.
Qui, presentiamo un metodo per la cultura ossea lunga murina, che può essere combinata con diversi trattamenti molecolari e/o con Time-lapse Live Imaging. Questo protocollo adatta i metodi utilizzati nelle precedenti relazioni15,18,25, ma affronta alcuni problemi aggiuntivi e si concentra su ossa lunghe come la tibia, piuttosto che le ossa metatarsali. Infine, Esplora il potenziale dell'utilizzo di confronti associati statisticamente potenti Culturando le ossa sinistra e destra separatamente in presenza di diverse sostanze.

<table><tbody><tr><td>5-etil-2'-deossiuridina</td><td>Santa Cruz</td><td>CAS 61135-33-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-2&prime;-deossiuridina</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Trattato TC-Well Piatto per coltura d'organo con pozzo centrale, 20/confezione, 500/cassa,</td><td>Falco</td> sterile <td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td>CS4</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>Unità di base per il cannocchiale</td><td>Zeiss</td><td>435425-9100-000</td><td></td></tr><tr><td>Betaglicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale binoculare</td><td>Zeiss</td><td>STEMI-2000</td><td></td></tr><tr><td>Frazione di albumina sierica bovina (BSA) v</td><td>Roche/Sigma</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DigiRetina 500</td> Kit di dissezione <td>Aunet</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cumper Robbins</td><td>PFS00034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Provette da 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Merk</td><td>159010</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont#5 Inox08</td><td>Strumenti per la scienza</td> fine<td>T05811</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150 CO2 incubatore</td><td>Thermo Fisher</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle</td><td>Sigma</td><td>M2279</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipette in plastica 1 mL Sterili Confezionato singolarmente</td><td>Thermo</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa 0,2 um</td><td>Life Sciences</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Terumo 20 mL</td><td>Terumo</td><td>DVR-5174</td><td></td></tr><tr><td>Tretinoina (acido retinoico)</td><td>Sigma</td><td>PHR1187-3X</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale trinoculare</td><td>Aunet</td><td>AZS400T</td><td></td></tr></tbody></table>

coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Le ossa lunghe sono strutture complesse e dinamiche, che derivano dall'ossificazione endocondrale attraverso una cartilagine intermedia. L'accesso limitato a ossa umane sane rende particolarmente prezioso l'uso di modelli di mammiferi, come topo e ratto, per esaminare diversi aspetti della crescita ossea e dell'omeostasi. Inoltre, lo sviluppo di sofisticati strumenti genetici nei topi consente studi più complessi di crescita ossea lunga e richiede un'espansione delle tecniche utilizzate per studiare la crescita ossea. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura ossea ex vivo murina, che consente lo studio dell'osso e della cartilagine in modo strettamente controllato, ricapitolando la maggior parte del processo in vivo. Il metodo descritto permette la coltura di una gamma di ossa, tra cui tibia, femore, e ossa metatarsali, ma ci siamo concentrati principalmente sulla cultura tibiale qui. Inoltre, può essere utilizzato in combinazione con altre tecniche, come l'imaging Live time-lapse o il trattamento farmacologico.

La coltura ossea può essere eseguita partendo da diverse fasi. Nella Figura 1a-D, viene mostrato un confronto tra la tibia coltivata e quelle appena estratte in fasi equivalenti. La prima osservazione è che fino a due giorni di cultura le dimensioni raggiunte sono paragonabili alla crescita ossea in vivo sia per la cartilagine che per l'osso mineralizzato (Figura 1a, B, D). Periodi di coltura più...

Qui, presentiamo un metodo per la coltura ex vivo di ossa lunghe murine sia a stadi fetali che neonati, adatto per l'analisi dello sviluppo osseo e della cartilagine e dell'omeostasi in condizioni controllate, ricapitolando il processo in vivo.

Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Questo metodo adatta il protocollo di coltura metatarsale alle ossa più grandi, consentendo di izzare la manipolazione ossea diretta con modelli genetici complessi per affrontare i processi legati allo sviluppo osseo. Questa tecnica consente la manipolazione e l'analisi della crescita ossea che non sono possibili in vivo, come l'imaging dal vivo o la manipolazione fisica e farmacologica diretta. Questo metodo di coltura ex vivo consente lo studio specifico degli effetti locali dell'insorgenza genetica nell'osso che lo separa dall'effetto sistemico che il trattamento ha sull'organismo.Inizia sterilizzando la regione addominale di un giorno gestazionale incinta da 14,5 a 18,5 topo con 80%etanolo e usando piccole forbici per aprire la pelle e i muscoli addominali per accedere alle corna uterine. Per estrarre l'utero dalla cavità addominale, rimuovere il mesometrio e tagliare la base delle corna. Quindi, trasferire l'utero in una piastra di petri di 60 millimetri contenente mezzo di dissezione ghiacciato sul ghiaccio.In un armadio di biosicurezza tagliato tra i sacchi con forbici per separare i singoli feti e trasferire un singolo sacco in un nuovo piatto da 60 millimetri con mezzo di dissezione fresco sotto un microscopio stereo a dissezione. Utilizzare una pinzetta per separare i feti dalle placenta e per pulire i feti dalle membrane. Utilizzare una pipetta di plastica tagliata per trasferire il corpo in un nuovo piatto da 60 millimetri e decapitare l'embrione prima di un'ulteriore dissezione.Quindi utilizzare una pinzetta per rimuovere la pelle, partendo dalla parte posteriore e staccandosi alle dita dei piedi. Usa le pinzette per tagliare vicino alla colonna vertebrale e separare gli arti posteriori dal corpo. Trasferire gli arti posteriori in un piatto pulito contenente mezzo di dissezione ghiacciato e inserire le pinzette tra la cartilagine superficiale del femore distale e la tibia prossimale per separare la tibia dal femore.Rimuovere le ossa dell'anca dal femore prossimale e dall'osso calcaneo e dalla fibula dalla tibia. Stroncare e estrarre con cura i tessuti molli dai femminicidi e dalle tibia e utilizzare una pipetta sterile da un millilitro per trasferire tutte e quattro le ossa delle gambe nel primo pozzo di una piastra da 24 pozzetti contenente mezzo di dissezione fresco. È importante dimostrare che il tessuto molle che collega il polso dell'osso viene rimosso.Altrimenti, l'osso si piegherà e non raggiungerà una crescita adeguata. Quando le ossa sono state sezionate dal numero sperimentale appropriato di feti, immaginiamo le ossa in ogni pozzo a volte zero sotto un microscopio leggero con un buon contrasto e sostituisci il mezzo di dissezione in ogni pozzo con un millilitro di mezzo di coltura per pozzo facendo particolare attenzione a non aspirare le ossa. Per osservare l'effetto dell'inibizione della crescita nelle condizioni di coltura, trattare le tibia sinistra con acido retinoico nanomolare 500 e incubare le tibia destra con un volume equivalente di veicolo come controllo.Quindi, posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare in condizioni standard di coltura cellulare. Dopo due giorni, trattare le ossa con un analogo di timmidina appropriato per una o due ore per valutare la proliferazione delle cellule ossee prima di trasferire le ossa in singoli tubi da due millilitri del 4% di paraformaldeide per 10 minuti. Quindi, trasferire le ossa su PBS per imageare le ossa nel momento finale prima di restituire i campioni alla paraformaldeide per la fissazione notturna a quattro gradi Celsius.Per misurare la lunghezza e la regione mineralizzata delle ossa, aprire un programma software di imaging appropriato e, tenendo conto della scala dell'immagine, misurare sia la lunghezza totale dell'osso, sia la regione mineralizzata. Avvio delle misurazioni dalle prime celle scure da un'estremità fino alle ultime celle scure all'altra estremità. Per calcolare il tasso di crescita definito come l'aumento medio della durata al giorno, dividere la differenza tra la lunghezza finale dell'osso e la durata iniziale per il numero di giorni in coltura.Qui viene mostrato un confronto tra tibia coltivata e tibia appena estratta in fasi equivalenti. Dopo un massimo di due giorni di coltura, la dimensione raggiunta è paragonabile alla crescita ossea in vivo sia per la cartilagine che per l'osso mineralizzato. Periodi di coltura più lunghi portano a maggiori differenze tra le ossa coltivate e le ossa appena estratte.Nota, la tibia coltivata con una rimozione incompleta del tessuto molle può causare la flessione della tibia coltivata. Il trattamento con acido retinoico ha un effetto robusto sulla crescita tibiale già dopo due giorni di trattamento. Sebbene vi sia un aumento costante della lunghezza totale della tibia dopo due giorni di coltura, questa crescita corrisponde ad un aumento approssimativo di soli nove-29% rispetto alla lunghezza iniziale.Meno dell'aumento della crescita ossea che si osserverebbe in vivo. In effetti, l'etichettatura analogica della timmidina mostra meno cellule positive in questa regione dopo la coltura rispetto alle ossa appena estratte di uno stadio equivalente. Inoltre, nella tibia coltivata in vitro, la lunghezza totale dell'elemento scheletrico aumenta notevolmente, mentre quasi nessun aumento della regione mineralizzata è osservato.Oltre all'analisi istologica e molecolare, la compensazione e l'imaging 3D possono essere eseguite dopo la coltura per caratterizzare l'effetto cellulare dei trattamenti applicati alle ossa coltivate. La tecnica ci permette di affrontare domande relative alla comunicazione interorganale. Ad esempio, co-coltivando ossa dei diversi modelli genetici in una sorta di esperimento di parabiosi indolore.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo protocollo descrive una procedura per il campionamento seriale del midollo osseo femorale (BM) senza richiedere il sacrificio di topi. Questa procedura facilita gli studi longitudinali della composizione del midollo osseo dei topi nel tempo e fornisce un accesso seriale alle cellule all'interno del midollo osseo per studi ex vivo e di trapianto.

Femorale aspirazione del midollo osseo in Live Mice

Qui presentiamo un protocollo per la dissezione delle ossa lunghe degli arti posteriori (femori e tibie) dal topo di laboratorio. Descriviamo inoltre una tecnica rapida per l'isolamento del midollo osseo da queste ossa che utilizza la centrifugazione per la rimozione del midollo osseo dallo spazio del midollo osseo.

Murino arto posteriore osso lungo dissezione e isolamento di midollo osseo

Presentiamo un protocollo per sezionare e coltivare ossa metatarsali murine embrionali del giorno 15 (E15). Questo modello ex vivo altamente fisiologico di ossificazione endocondrale fornisce condizioni più vicine alla situazione in vivo rispetto alle cellule in monostrato o in coltura 3D ed è uno strumento vitale per studiare la crescita e lo sviluppo osseo.

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

Questo manoscritto descrive un protocollo a isolare e cultura gli osteoclasti in vitro da midollo osseo di topo e di studiare il ruolo della destinazione dei mammiferi/meccanicistica della rapamicina complesso 1 nella formazione degli osteoclasti.

Un base di RANKL Osteoclast cultura Assay di midollo osseo del topo per studiare il ruolo di mTORC1 nella formazione degli osteoclasti

In questo articolo, presentiamo metodi per isolare e differenziare cellule stromali del midollo osseo e cellule staminali ematopoietiche da ossa lunghe del mouse. Due differenti protocolli sono presentati ottenendo diverse popolazioni cellulari adatte per espansione e differenziazione in osteoblasti, adipociti e gli osteoclasti.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Il presente protocollo descrive lo sviluppo di una piattaforma di prova riproducibile per colli femorali murini in un set-up di flessione a sbalzo. Sono state utilizzate guide personalizzate stampate in 3D per fissare in modo coerente e rigido i femori in un allineamento ottimale.

Flessione a sbalzo dei colli femorali murini

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

Questo protocollo descrive un modello murino migliorato per le lesioni della cartilagine di crescita ossea degli adolescenti. Utilizzando topi transgenici con reporter fluorescenti tri-lineage per collagene di tipo I, II e X, le matrici primarie associate a tre diversi substrati della placca di crescita, il posizionamento delle lesioni è guidato dalla fluorescenza nativa al microscopio.

Modello murino transgenico tricolore per lo studio delle lesioni della cartilagine di crescita

Il modello di lesione del midollo osseo murino è uno strumento utile per studiare l'osteogenesi postnatale attraverso l'ossificazione intramembranosa. Questo protocollo chirurgico semplificato descrive la procedura di ablazione del midollo osseo per la valutazione a valle della formazione di nuovo osso e delle risposte cellulari dopo la lesione.

Metodologia migliorata per lo studio dell'osteogenesi postnatale tramite ossificazione intramembranosa in un modello di lesione del midollo osseo murino

Scopri la coltura ex vivo di ossa lunghe fetali e neonatali di topo per studiare lo sviluppo osseo e cartilagineo in condizioni controllate. Questo metodo consente imaging in vivo e manipolazione farmacologica diretta.

Coltura e misurazione ossa lunghe e fetali di murina neonatale

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