Name: Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri un protocollo per valutare la nanotossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco su fibroblasti polmonari umani MRC5 e Drosophila melanogaster. Questo metodo permette di identificare i tipi di morte cellulare e quantificare la produzione di specie reattive dell'ossigeno.

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Lo studio è stato sostenuto dal numero di sovvenzione R706-000-043-490. Lo studio non rappresenta il parere dello sponsor della sovvenzione.

1. Fluorescenza Activated Cell Sorting (FACS) Analisi su celle vissute / fisse
<ol><li>Sonicato NP nO in sospensione per 15 min.</li>
	<li>Preparare gli NP nO a varie concentrazioni (ad esempio, 0, 10, 25, 50.100 e 200 g/mL) utilizzando una soluzione di stock di 1 mg/mL nO NP per il trattamento delle cellule coltivate.</li>
	<li>Semina MRC5 fibroblasti polmonari umani (1 x 105 cellule/bene) su una piastra di coltura 6-pozzio un giorno in anticipo, e poi trattare le cellule con 2 mL di NP nO (in triplicati) per 8 h, 16 h, e 24 h.</li>
	<li>Ad ogni punto temporale, raccogliere le cellule centrifugando a 300 x g per 5 min.</li>
	<li>Lavare i pellet cellulari due volte con salina tamponata da fosfato (PBS).</li>
	<li>Risospendere le celle con buffer di rilegatura 1x, composto da 0,1 M di idrossido di hePES/sodio (NaOH), 1,4 M di cloruro di sodio (NaCl) e 25 mM di cloruro di calcio (CaCl2), a una concentrazione di 1 x 105 celle per 100 .</li>
	<li>Aggiungere 5 -L L di isotoniociocianate (FITC) Annexin V macchia e 5 -L di macchie di DNA di iodio di propidium iodide (PI), e incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente (RT; 25 ) al buio.</li>
	<li>Ricaricare i campioni con un buffer di rilegatura aggiuntivo di 400 l of 1x prima di ordinare le celle in base alla citometria di flusso. Per ogni campione viene analizzato un minimo di 10.000 cellule.</li>
	<li>Tabulazione il grafico a barre utilizzando l'intensità mediana ottenuta.</li>
</ol>2. Esposizione delle NP di znO alla Drosophila
<ol><li>Aggiungere 1 mL di nanoparticelle a concentrazioni diverse in fiale, seguito da 9 mL di cibo a mosca per fare una concentrazione finale di 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL o 0,5 mg/mL nP.</li>
	<li>Mescolare accuratamente le nanoparticelle con il cibo nelle fiale utilizzando la pipetta.</li>
	<li>Lasciare raffreddare gli alimenti a mosca contenenti NP nO per almeno 2-3 h prima dell'uso.</li>
	<li>Introdurre adulti maschio e femmina vola nelle fiale per 5 giorni, e consentire loro di accoppiarsi e deporre le uova (che appaiono come macchie bianche) sulla superficie del cibo.</li>
	<li>Rimuovere le mosche parentali e consentire alle uova di subire un ulteriore sviluppo, che consiste in 4 diversi stadi di sviluppo (stadio embrionale, larvale, pupale e adulto).</li>
</ol>3. Dissezione del volo
<ol><li>Raccogliere larve a tarda 3rd instar dalla parete delle fiale per le analisi. Le uova appena deposte normalmente si sviluppano in larve instelle alla fine 3rd dopo 72-120 h a RT.</li>
	<li>Pulire il piatto di dissezione e riempire il pozzo con il mezzo di dissezione/PBS.</li>
	<li>Dissezionare le larve (più tardi 3rd instar) sotto lo stereoscopio, utilizzando un paio di pinze.</li>
	<li>Utilizzare la punta delle pinze per fare un piccolo foro e rompere aprire lo strato cuticola delle larve. Estrarre con attenzione l'intestino e metterlo in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml contenente il mezzo Drosophila di Schneider, prima della fase di fissaggio utilizzando 1 mL di 4% di paraformaldeide (PF).</li>
	<li>3.5Fissare l'intestino in PF per 10 min a RT, per esperimenti successivi, come l'immunostaining.</li>
</ol>4. Rilevamento ROS utilizzando la colorazione diHydroethidium (DHE)
<ol><li>Trattare le larve con varie concentrazioni di NP nO come descritto al punto 2.1.</li>
	<li>Dopo la dissezione dell'intestino da 3rd larve instelle come descritto nella sezione 3, incubare l'intestino nel mezzo Drosophila di Schneider a RT prima di colorare i tessuti. Sciogliere 1 l l di colorante DHE (dalla concentrazione di magazzino di 30 mM) in 1 mL del mezzo di Schneider, facendo una concentrazione di lavoro finale di 10-30 M dy e DHE colorante.</li>
	<li>Incubare l'intestino per 5 min al buio, quindi lavare tre volte utilizzando il mezzo di Schneider per ogni 5 min.</li>
	<li>Fissare l'intestino con il 4% PF (passo opzionale) e montare l'intestino su vetrini di vetro, con un supporto di montaggio anti-dissolvenza contenente 4,6-diamidino.2-fenilondole (DAPI). Acquisire immagini al microscopio confocale.</li>
</ol>5. Misurazione della fluorescenza mediante il software ImageJ
<ol><li>Importare le immagini a fluorescenza acquisite mediante microscopia a fluorescenza o microscopia a scansione laser confocale nel software ImageJ.</li>
	<li>Fare clic sul menu Analizza e selezionare Imposta misure.</li>
	<li>Selezionare la misura di output, ad esempio l'intensità integrata dell'area e il valore medio del grigio.</li>
	<li>Fare clic su Misura.</li>
	<li>Selezionare un'area senza fluorescenza per impostare lo sfondo.</li>
	<li>Esportare i dati nel foglio di calcolo di Excel e determinare la fluorescenza totale delle celle (CTCF) corretta, utilizzando il calcolo come illustrato di seguito. CTCF - Densità integrata - (Area della cella selezionata X Media fluorescenza delle letture di fondo)</li>
	<li>Costruire un grafico a barre ed eseguire analisi statistiche.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+100+nm+zinc+oxide+nanoparticles%3A+a+report+of+90-day+repeated+oral+administration+in+Sprague+Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats.</a> International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).</li>
<li>Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibacterial+activity+and+mechanism+of+action+of+zinc+oxide+nanoparticles+against+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).</li>
<li>Colvin, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+environmental+impact+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The potential environmental impact of engineered nanomaterials.</a> Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).</li>
<li>De Angelis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+ZnO+and+TiO%282%29+nanoparticles%3A+physicochemical+characterisation+and+toxicological+effects+on+human+colon+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells.</a> Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).</li>
<li>Johnson, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+ZnO+nanoparticles+induces+autophagic+immune+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death.</a> Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).</li>
<li>Singh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoGenotoxicology%3A+the+DNA+damaging+potential+of+engineered+nanomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials.</a> Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).</li>
<li>Song, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+dissolved+zinc+ion+and+reactive+oxygen+species+in+cytotoxicity+of+ZnO+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles.</a> Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).</li>
<li>Wahab, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZnO+nanoparticles+induced+oxidative+stress+and+apoptosis+in+HepG2+and+MCF-7+cancer+cells+and+their+antibacterial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).</li>
<li>Namvar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+biosynthesized+zinc+oxide+nanoparticles+on+murine+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).</li>
<li>Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicities+of+nano+zinc+oxide+to+five+marine+organisms%3A+influences+of+aggregate+size+and+ion+solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).</li>
<li>Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-specific+toxic+effects+of+differently+shaped+zinc+oxide+nanoparticles+to+zebrafish+embryos+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+study+of+the+harmful+effects+of+ZnO+nanoparticles+using+Drosophila+melanogaster+as+an+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hazardous+Materials%22%5BJournal%5D)">A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model.</a> Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).</li>
<li>Rand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophotoxicology%3A+the+growing+potential+for+Drosophila+in+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology.</a> Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).</li>
<li>Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+model+organism+to+study+nanotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity.</a> Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+innate+immunity%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective.</a> Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).</li>
<li>Hughes, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+genetic+model+for+studying+pathogenic+human+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses.</a> Virology. 423, 1-5 (2012).</li>
<li>Jennings, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+a+versatile+model+in+biology+%26+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila - a versatile model in biology & medicine.</a> Materials Today. 14, 190-195 (2011).</li>
<li>Adams, M. D., Sekelsky, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sequence+to+phenotype%3A+reverse+genetics+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).</li>
<li>Adams, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 2185-2195 (2000).</li>
<li>Ong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+nanoparticles+disrupt+germline+stem+cell+maintenance+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis.</a> Scientific Reports. 6, (2016).</li>
<li>Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+potential+harmful+effects+of+CdSe+quantum+dots+by+using+Drosophila+melanogaster+as+in+vivo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model.</a> Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).</li>
<li>Barik, B. K., Mishra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+as+a+potential+teratogen%3A+a+lesson+learnt+from+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly.</a> Nanotoxicology. , 1-27 (2018).</li>
<li>Jovanovic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a+human+food+additive%2C+titanium+dioxide+nanoparticles+E171%2C+on+Drosophila+melanogaster+-+a+20+generation+dietary+exposure+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li>
<li>Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Toxicity+of+Nanoparticles+to+Human+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).</li>
<li>Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+ROS+scavenging+and+antioxidant+signalling+by+redox+metallic+and+fullerene+nanomaterials%3A+Potential+implications+in+ROS+associated+degenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta-General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders.</a> Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).</li>
<li>Akter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+on+silver+nanoparticles-induced+cytotoxicity%3A+Physicochemical+properties+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives.</a> Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).</li>
<li>Vecchio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fruit+fly+in+the+nanoworld%3A+once+again+Drosophila+contributes+to+environment+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotoxicology%22%5BJournal%5D)">A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health.</a> Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).</li>
<li>Marino, G., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+apoptotic+phosphatidylserine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure.</a> Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).</li>
<li>Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStoddart%2C+MJ+%22Mammalian+Cell+Viability%3A+Methods+and+Protocols%22">Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols</a>. , Chapter 1 (2011).</li>
<li>Yazdani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerns+in+the+application+of+fluorescent+probes+DCDHF-DA%2C+DHR+123+and+DHE+to+measure+reactive+oxygen+species+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro.</a> Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+kinetics+of+dihydroethidium+fluorescence+with+superoxide+using+xanthine+oxidase+and+hypoxanthine+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay.</a> Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).</li>
<li>Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHartig%2C+SM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Al fine di valutare se l'NP nO può indurre l'apoptosi nei fibroblasti MRC5, usiamo la citometria di flusso per distinguere le cellule dalla morte cellulare necrotica o apoptotica. Nelle cellule vive normali, la fosfatidilaselserina (PS) è localizzata nella membrana cellulare. Se si verifica l'apoptosi, PS viene traslocato al volantino extracellulare della membrana plasmatica, consentendo il legame dell'annessione V etichettata con fluoresceina (FITC Annexin V)29. D'altra parte, lo iodio propidio r...

La nanotecnologia si riferisce all'applicazione di materiali di dimensioni nanometriche che vengono utilizzati in tutti i campi scientifici, tra cui la medicina, la scienza dei materiali e la biochimica. Ad esempio, gli NP nO, noti per la loro dispersione ultravioletta, il rilevamento chimico e le proprietà antimicrobiche, nonché l'elevata conduttività elettrica, sono utilizzati nella produzione di vari prodotti di consumo come imballaggi alimentari, cosmetici, tessuti, gomme, batterie, catalizzatore per il trattamento del gas coda di automobili e applicazioni biomediche1,2,3.
Tuttavia, le fiorenti applicazioni dei prodotti basati su NP di NO, che hanno portato ad una maggiore esposizione umana alle NP di NO, hanno sollevato preoccupazioni sui loro potenziali effetti negativi sulla salute umana. Una serie di studi cellulari in vitro hanno dimostrato che nO NP può indurre stress ossidativo, citobilsia autofagia, infiammazione, e genotossicità4,5,6,7 . In particolare, si presume che la tossicità degli NP di NP sia causata dalla dissoluzione di n2 o 2 o più ioni, nonché dalla reattività superficiale di inibizione del trasporto iosilio4,7,9,10. È importante sottolineare che gli studi hanno dimostrato che la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è uno dei meccanismi primari alla base della tossicità associata a NPs. È stato dimostrato che un'insufficiente attività antiossidante a seguito di un insulto AL ROS è stato dimostrato di essere responsabile di suscitare la citotossicità e il danno al DNA9. Gli effetti tossici delle NP di NO sono stati riportati anche in modelli animali, tra cui roditore1, pesce zebra11,12, così come l'invertebrato Drosophila13.
La Drosophila funge da modello animale alternativo consolidato per lo screening della tossicità di entità chimiche e nanomateriali (MN)14,15. È importante sottolineare che esistono alti livelli di somiglianza genetica e fisiologica tra l'uomo e la Drosophila che giustifica l'uso della Drosophila come modello in vivo per valutare le risposte biologiche ai contaminanti ambientali come le MMM 16. Inoltre, ci sono molti vantaggi dell'uso della Drosophila a causa delle sue piccole dimensioni, della sua breve durata, dell'amenabilità genetica e del mantenimento facile ed economico. Inoltre, la Drosophila è stata ampiamente adottata per lo studio della genetica, della biologia molecolare e dello sviluppo, sin da quando il suo genoma completo è stato completamente sequenziato anni fa nel 2000, rendendolo quindi adatto per una varietà di screening ad alto valore e per affrontare questioni biologiche irrisolte17,18,19,20,21. Negli ultimi anni, una serie di studi relativi all'immunotossicità utilizzando diversi tipi di NP in Drosophila sono stati segnalati15,22,23,24. Queste nuove conoscenze fondamentali ottenute dagli studi che utilizzano la Drosophila hanno contribuito a fornire maggiori informazioni sulla nostra comprensione della nanotossicologia.
ROS è un noto colpevole di citotossicità e genotossicità causata da NP, in particolare, NP a base metallica25. I ROS sono specie chimiche contenenti ossigeno con proprietà reattive più elevate rispetto all'ossigeno molecolare. I radicali liberi come il superossido radicale (O2-) e anche molecole non radicali come il perossido di idrogeno (H2O2)possono agire come ROS. In condizioni fisiologiche normali, sono tenuti a mantenere l'omeostasi cellulare26, tuttavia, un ROS eccessivo a causa della sovrapproduzione o della disregolazione del sistema di difesa antiossidante può causare stress ossidativo, che porta a danni alle proteine, lipidi e acido deossiribonucleico (DNA)27. Ad esempio, con l'aumento dei livelli di ROS e l'aumento del livello di glutathione (GSH) concomitante, l'interruzione della sintesi del triposfato di adenosina (ATP) avviene e il livello di dehydrogenasi in lattato (LDH) aumenta nel mezzo, culminando nella morte cellulare27.
Qui, forniamo protocolli per l'esecuzione di analisi cellulari e genetiche utilizzando cellule di mammiferi coltivati e Drosophila per determinare i potenziali effetti negativi delle NP nO. Nella figura 1è riportata una panoramica del metodo utilizzato per lo studio di tossicità degli NP nO.

<table><tbody><tr><td>15% Metil 4-idrossibenzoato</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cncCK6/TM3, Sb</td><td></td><td></td><td>un dono dal Dr. Kerppola T</td></tr><tr><td>Farina di mais, glucosio, lievito di birra</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CyAn ADP con Summit Software</td><td>DAKO</td><td></td><td>https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf</td></tr><tr><td>Diidroetidio (Idroetidina)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11347</td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Kit di rilevamento dell'apoptosi I</td><td>BD biosciences</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucolin</td><td>Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MRC5 fibroblasto polmonare umano</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield terreno di montaggio antisbiadimento con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO</td><td>NIG-FLY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticelle di ossido di zinco</td><td>Sigma Aldrich</td><td>721077</td><td>Fare riferimento al foglio 2</td></tr></tbody></table>

studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster

Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster

Le nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) hanno un'ampia gamma di applicazioni, ma il numero di rapporti sulla tossicità associata a NP è cresciuto rapidamente negli ultimi anni. Tuttavia, gli studi che chiariscono i meccanismi sottostanti per la tossicità indotta da NP nO sono scarsi. Abbiamo determinato i profili di tossicità degli NP di nO utilizzando modelli sperimentali sia in vitro che in vivo. È stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 esposti da NP, dimostrando che le NP di NO esercitano effetti citotossici. Allo stesso modo, è interessante notare che l'intestino esposto alle NP di NP ha mostrato un drammatico aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel moscerino della frutta Drosophila. Sono necessari studi più approfonditi per stabilire una valutazione del rischio per l'aumento dell'utilizzo da parte degli NP di NO da parte dei consumatori.

Le cellule esposte np sono state elaborate con il kit di reagente di colorazione delle cellule, seguito dallo smistamento delle celle utilizzando la citometria di flusso. Le celle trattate con NP nO (in basso, pannello destro) presentano una percentuale più alta di celle apoptotiche anticipate (R3) / tardive (R6) rispetto alle celle di controllo (R5, in basso, pannello sinistro). La morte necrotica delle cellule è indicata da R4 (in alto, pannello destro) (Figura 2</s...

Descriviamo un protocollo dettagliato per la valutazione dei profili tossicologici delle nanoparticelle di ossido di zinco (NO NP) in particolare, il tipo di morte cellulare nei fibroblasti polmonari MRC5 umani e la formazione di ROS nel farro della frutta Drosophila.

Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster

Zinc oxide nanoparticles (ZnO NPs) have a wide range of applications, but the number of reports on ZnO NP-associated toxicity has grown rapidly in recent ...

I nostri metodi delineano un modo semplice e ripetuto per studiare la nanotossicità, come esaminare i tipi di morte cellulare ed esaminare la produzione di specie reattive dell'ossigeno. Lo smistamento delle cellule attivato a fluorescenza è un formato rigoroso che ci consente di studiare la sottopopolazione delle cellule e i diversi tipi di morte cellulare in crescita. Il metodo di studio della sonda DHE ci consente di rilevare e quantificare le specie reattive dell'ossigeno seguite dalla citometria del flusso, dall'imaging microscopico ad alto contenuto e dall'analisi della fluorescenza basata sull'accoppiato.Per iniziare, posizionare un tubo di Eppendorf contenente nanoparticelle di ossido di zinco nella soluzione di stock di nanoparticelle di ossido di zinco in un sonicatore per 15 minuti. Preparare nanoparticelle di ossido di zinco a varie concentrazioni utilizzando lo stock di nanoparticelle di ossido di zinco da un milligrammo per millilitro. Quindi, in un armadietto per la biosicurezza, seminare fibroblasti polmonari umani MRC5 su tre piastre di coltura a sei pozzi alla concentrazione di una per 10 alla quinta cellule per pozzo.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo un giorno, trattare le cellule con due millilitri di nanoparticelle di ossido di zinco per otto ore, 16 ore o 24 ore. In ogni momento, raccogliere le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 volte g per cinque minuti.Lavare i pellet cellulari due volte con soluzione salina tamponata con fosfato, quindi rimossare le cellule con tampone di legame 1X. Aggiungere quindi cinque microlitri della macchia FITC Annexin V in cinque microlitri di macchie di DNA di ioduro di propidio. Incubare le celle macchiate per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.Prima di ordinare le cellule per citometria a flusso, ricaricare i campioni con altri 400 microlitri di buffer di legame 1X. Tabulare il grafico a barre utilizzando l'intensità mediana ottenuta. Ora usa una pipetta per aggiungere un millilitro di nanoparticelle a diverse concentrazioni in fiale, seguito da nove millilitri di cibo a mosca per fare una concentrazione finale di 0,1 milligrammi per millilitro, 0,25 milligrammi per millilitro o 0,5 milligrammi per nanoparticelle di ossido di zinco millilitro.Pipetta su e giù per mescolare accuratamente. Lasciare raffreddare il cibo a mosca contenente nanoparticelle di ossido di zinco per almeno due o tre ore prima dell'uso. Quindi anestetizza le mosche adulte maschili e femminili in una fiala con anidride carbonica e introduci cinque mosche maschili e cinque mosche femminili in ogni fiala per cinque giorni.Consentire loro di accoppiarsi e deporre le uova sulla superficie del cibo. Dopo l'anestesia, rimuovere le mosche parentali e consentire alle uova di subire un ulteriore sviluppo a temperatura ambiente, che consiste in quattro diversi stadi di sviluppo. Stadio embrionale, larvale, pupale e adulto.Dopo 72-120 ore, le uova appena deposte si sviluppano in larve instar alla fine del terzo. Usando le forcep, raccogliere le larve dal muro delle fiale per le analisi. In un pozzo di un piatto di dissezione con mezzo di dissezione o PBS, posizionare le larve nella soluzione.Sotto lo stereomicroscopio, usa la punta delle forcep per fare un piccolo buco e apri lo strato di cuticola delle larve. Estrarre con cura l'intestino. Posizionare l'intestino in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente drosophila medium di Schneider.Aggiungere un microlitro della sonda DHE e incubare al buio a temperatura ambiente per 10 minuti. Lava l'intestino tre volte usando Schneider's Medium ogni cinque minuti. Montare l'intestino su vetrini e fornire 10 microlitri di supporto antifade contenente DAPI.Cattura le immagini al microscopio confocale. Per misurare la fluorescenza, importare le immagini a fluorescenza acquisite utilizzando la microscopia a fluorescenza o la microscopia a scansione laser confocale nel software ImageJ. Fare clic sul menu analizza e selezionare imposta misure.Selezionare la misura di output, ad esempio l'intensità integrata nell'area e il valore grigio medio. Selezionate una regione senza fluorescenza per impostare lo sfondo. Fare clic su misura.Esportare i dati nel foglio di calcolo e determinare la fluorescenza totale corretta delle celle. Costruire un grafico a barre ed eseguire analisi statistiche. In questo studio, le cellule trattate con nanoparticelle di ossido di zinco mostrano una percentuale più alta di cellule R6 apoptotiche precoci o tardive rispetto alle cellule di controllo R5. La morte necrotica delle cellule è stata denotata da R4. L'intestino estratto dalla larva di drosophila era diviso in tre domini discreti di diversa origine dello sviluppo.Vale a dire, il foregut, il midgut e l'hindgut. Le azioni DHE tendono a scadere piuttosto rapidamente, quindi fai attenzione alla soluzione stock che stai utilizzando. In alternativa, potresti provare altre sonde, ad esempio la cella Roche, progettata per rilevare il ROS intracellulare nei segnali verdi, e questo è più fototabella del DHE.Il nostro protocollo fornisce uno schema generale per lo studio della produzione di ROS intracellulare e la quantificazione del livello ROS per lo studio della nanotossicità. DMSO è noto per essere un solvente migliore per il DHE rispetto al PBS. Tuttavia, dmso è tossico.Pertanto, vorrei consigliare all'utente di limitare l'intero processo di studio a 30 minuti al massimo. Questo perché è possibile osservare un risultato falso positivo in quanto DMSO può causare la morte cellulare.

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Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

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Studio di tossicità delle nanoparticelle di ossido di zinco nella coltura cellulare e nella drosophila melanogaster

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