Uso di un acceleratore lineare per condurre esperimenti di radiobiologia in vitro

La radioterapia viene erogata più frequentemente utilizzando acceleratori lineari. Questo protocollo consente ai ricercatori di valutare gli effetti biologici delle radiazioni sulle cellule utilizzando un acceleratore lineare. Il vantaggio di questa tecnica è che utilizzando un acceleratore lineare, i ricercatori possono studiare una vasta gamma di dosi e dosi clinicamente rilevanti.

Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per tutti i tipi di cellule tumorali. Questo metodo può essere eseguito utilizzando apparecchiature simili a quella mostrata qui. Ad esempio, acceleratori lineari prodotti da altri fornitori.

Gli individui che non hanno sperimentato l'esecuzione di calcoli dosimetrici utilizzando un acceleratore lineare possono avere difficoltà a calcolare il numero corretto di unità di monitoraggio necessarie per fornire la dose desiderata al campione. Ne trarrebbero vantaggio chiedendo consiglio a un fisico medico o dosimetrista. Erogare la dose al campione con precisione utilizzando un acceleratore lineare richiede un posizionamento accurato.

Due giorni prima dell'irradiazione programmata, lavorando in una cappa di coltura, utilizzare una pipetta sterile a cinque millilitri per raccogliere cellule simili a staminali di glioma da una piastra di coltura in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 200 volte g per tre minuti in una centrifuga da banco. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con un millilitro di tripside-EDTA.

Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti per digerire il pellet e effettuare una sospensione a singola cella in tripside-EDTA. Ogni due minuti durante la digestione, agitare delicatamente il fondo del tubo di centrifuga per assicurarsi che le cellule siano accuratamente digerite. Quindi aggiungere tre millilitri di mezzi di coltura delle cellule staminali per temprare la tripina, mescolare delicatamente e centrifugare a 200 volte g per tre minuti in una centrifuga da banco.

Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet cellulare con cinque millilitri di mezzi di coltura cellulare e contare le cellule con un emocitometro. Piastra cinque milioni di cellule divise in due piastre di 10 centimetri contenenti 10 millilitri di mezzi di coltura cellulare e incubare 48 ore a 37 gradi Celsius. Poco prima dell'irradiazione programmata, raccogliere le cellule e la centrifuga come fatto in precedenza.

Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con cinque millilitri di mezzi di coltura cellulare. Trasferire un millilitro di sospensione cellulare in una piastra di 35 millimetri contenente due millilitri di mezzo di coltura cellulare, assicurandosi che il mezzo raggiunga un'altezza di un centimetro. Trasferire le cellule placcate in un contenitore secondario per ridurre il rischio di contaminazione e portare le cellule del contenitore su un carrello di servizio all'impianto di irradiazione per irradiare le cellule.

Un giorno prima dell'irradiazione, lavorando nella cappa di coltura cellulare, utilizzare una pipetta Pasteur collegata al vuoto per rimuovere il supporto DMEM dalla piastra di coltura cellulare alla linea cellulare attaccata. Quindi lavare le cellule con cinque millilitri di PBS sterile per risciacquare il mezzo residuo. Aggiungere un millilitro di tripside-EDTA nel piatto di coltura e inclinare delicatamente il piatto di coltura per assicurarsi che l'intero piatto sia coperto.

Dopo aver incubato a temperatura ambiente per cinque minuti, spegnere la reazione tripina-EDTA con tre millilitri di mezzi DMEM. Utilizzare una pipetta da cinque millilitri per raccogliere le cellule in un tubo di centrifuga da 15 millilitri, centrifugare e quindi colturare le cellule come descritto nel manoscritto. Per irradiare queste cellule precedentemente preparate utilizzando il software console del LINAC, impostare il portale dell'acceleratore e il collimatore a zero gradi, aprire le mascelle x e y a una dimensione simmetrica di campo di cinque per cinque centimetri quadrati e ritrarre i collimatori multifoglio.

Aggiungere almeno cinque centimetri di materiale equivalente all'acqua sul divano di trattamento e posizionare il piatto cellulare da irradiare su di esso al centro del mirino LINAC. Posizionare le cellule a una profondità di dose massima in un fascio di raggi X di sei megavolt intorno a 1,5 centimetri e aggiungere un centimetro aggiuntivo di materiale equivalente all'acqua sopra il piatto. Apporre il puntatore anteriore alla testa del LINAC ed estenderlo fino a toccarne la superficie del materiale di accumulo.

Regolare l'altezza della tabella fino a quando la distanza dalla sorgente alla superficie di accumulo è di 100 centimetri. Lascia il caveau del trattamento, assicurandoti che tutti gli altri individui se ne siano andati. Verificare che non vi siano altre celle nella stanza, quindi chiudere la porta del caveau.

Verificare le dimensioni del campo, le unità di monitoraggio e le unità di monitoraggio al minuto nella console, quindi abilitare il fascio per una cella di radiazioni. Tre campioni di cellule simili a glioma sono stati preparati utilizzando questo protocollo e raccolti 24 ore dopo l'irradiazione. Lì i profili del ciclo cellulare sono stati calcolati e mostrati con le percentuali di cellule in diverse fasi del ciclo cellulare.

L'arresto del ciclo cellulare G2 è stato osservato dopo l'irradiazione di cellule staminali di glioma con un'intensità di dose standard o un'intensità di dose extra elevata rispetto alle cellule di controllo non irradiate. Per avere la giusta dose erogata, è più importante misurare l'altezza del mezzo nel piatto di coltura per assicurarsi che raggiunga un centimetro. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri saggi biologici, come l'immunostaining, la macchia occidentale e l'analisi del ciclo cellulare.

Poiché questa procedura fornisce ai ricercatori impostazioni clinicamente rilevanti per la dose e l'intensità di dose, può essere utilizzata per valutare l'effetto di radiazione su molti modelli basati sulla coltura cellulare.