Name: Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: Scopri la spettroscopia di assorbimento atomico a fornetto di grafite per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero. Questo metodo offre alta sensibilità e bassi limiti di rilevamento per analisi accurate.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla facoltà diversità studiosi Award dalla University of Massachusetts Medical School a T.P.-B. N.N.-T. è supportata da SEP-CONACYT, Grant 279879. J. G. N è supportato dalla National Science Foundation Grant DBI 0959476. Gli autori sono grati al dottor Daryl A. bosco per aver fornito la linea cellulare N2A e a Daniella Cangussu per il suo supporto tecnico.

1. coltura cellulare dei mammiferi
<ol><li>Considerazioni generali
	<ol>
<li>Seguire le tecniche asettiche per la coltura cellulare dei mammiferi precedentemente recensiti38.</li>
		<li>Mantenere tutte le linee cellulari in un incubatore umidificato 5% CO2 a 37 ° c. Le condizioni di coltura delle celle variano per ogni tipo di cella. È importante mantenere condizioni di coltura appropriate per ogni linea cellulare utilizzata, poiché le variazioni di queste procedure porteranno a fenotipi aberranti e al fallimento della coltura cellulare.</li>
		<li>Assicurati di conoscere la linea cellulare di interesse e segui i protocolli forniti per ogni tipo di cella selezionato per esperimenti specifici (Vedi alcuni esempi di seguito).</li>
	</ol></li>
	<li>Procedura generale per la tripsinizzazione e il passaggio di cellule aderenti
	<ol>
<li>Rimuovere il supporto di coltura cellulare dalla piastra di coltura per aspirazione.</li>
		<li>Lavare le cellule delicatamente utilizzando PBS senza calcio e magnesio (5 mL per 10 cm2 superficie di coltura). Aggiungere la soluzione di lavaggio sul lato della piastra per evitare di distaccare il monostrato delle cellule; ruotare la piastra per massimizzare la copertura della soluzione. Per le cellule epiteliali, è necessario Incubare le cellule per 10-15 min nell'incubatore a 37 ° c in PBS per facilitare la dissociazione delle cellule nei seguenti passaggi.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di lavaggio per aspirazione.</li>
		<li>Aggiungere abbastanza reagente di dissociazione (0,25% tripsina) alla piastra (circa 0,7 mL per 10 cm2). Ruotare delicatamente la piastra per ottenere una copertura completa del monostrato cellulare.</li>
		<li>Incubare la cultura a temperatura ambiente per 2 a 5 min. Il tempo di incubazione effettivo varia con la linea cellulare utilizzata, nel caso di cellule epiteliali si raccomanda di incubare per 10-15 minuti nell'incubatore a 37 ° c. Osservare le cellule sotto il microscopio per il distacco delle cellule.</li>
		<li>Quando la maggior parte delle cellule si sono staccate, recuperare la sospensione cellulare in 5 mL della placcatura pre-riscaldato o del mezzo di crescita (Vedi sotto per alcuni esempi). Dissociare meccanicamente i gruppi di cellule pipettando più volte il monostrato cellulare.</li>
		<li>Trasferire la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 mL e centrifugare a 1.000 x g per 2 a 5 min. La velocità e il tempo di centrifugazione variano in base al tipo di cellula. Rimuovere il supporto da un'aspirazione delicata, facendo attenzione a non toccare il pellet cellulare. Risospendere il pellet cellulare in 5-10 mL del mezzo di crescita pre-riscaldato appropriato e rimuovere un campione per il conteggio utilizzando un emocytometro o un contatore cellulare automatico.</li>
		<li>Utilizzare il volume appropriato della sospensione cellulare per seminare la densità raccomandata per ogni linea di cella specifica (vedere di seguito per alcuni esempi). Integrare con il volume adeguato di mezzi di coltura in base alle dimensioni del piatto di coltura e mettere le cellule di nuovo nell'incubatrice.</li>
	</ol></li>
	<li>Mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo
	<ol>
<li>Prima di iniziare, prepara le piastre rivestite di collagene per la crescita primaria del mioblasto. Una soluzione contenente 0,02% di collagene e 0,05 di acido acetico in acqua deionizzata deve essere sterilizzata mediante filtrazione con un dispositivo filtrante sterile da 0,22 μm. Incubare le piastre di coltura con la soluzione di collagene durante la notte a 37 ° c.</li>
		<li>Il giorno successivo, aspirare la soluzione di collagene, lasciare asciugare le piastre nell'armadietto sterile e conservare a 4 ° c fino all'uso. Nota: i volumi minimi di collagene sono: per 35 mm = 1 mL; 60 mm = 2 mL; 10 cm = 5 mL.</li>
		<li>Mioblasti primari seme a 1 x 104 cellule/cm2 in 55 cm2 piastre di coltura rivestite di collagene. I media di proliferazione sono i media di coltura della miscela nutriente F12 di Dulbecco (DMEM)/Ham, contenenti il 20% di siero bovino fetale (FBS), 25 ng/mL di fattore di crescita fibroblastico di base ricombinante (FGF) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. Nota: le cellule proliferative e di scorta devono essere mantenute sotto il 50% della confluenza. Il contatto cellulare induce l'impegno delle cellule alla differenziazione miogenica e compromette le capacità di crescita della cultura.</li>
		<li>Per differenziare i mioblasti primari, consentire alle cellule di raggiungere 80% a 100% confluenza, che normalmente si verifica dopo 48 h di placcatura. Quindi, cambiare a media di differenziazione (DMEM, 2% siero di cavallo, 1% di insulina, transferrina, selenio un integratore, e 100 U/mL di penicillina/streptomicina). Aggiornare i media ogni giorno fino al raccolto.</li>
	</ol></li>
	<li>Neuroblastoma murino (N2A)
	<ol>
<li>Piastra N2A celle ad una densità di 2 x 104 cellule/cm2 in media di crescita, contenente una miscela di ridotto-siero medio/DMEM contenente alto glucosio e L-Glutammina (1:1, v:v), supplemento con 10% FBS e 100 U/ml di penicillina/streptomicina. Mantenere la cultura dello stock sotto il 50% di confluenza.</li>
		<li>Indurre la differenziazione delle cellule N2A una volta confluenza raggiunto 25% a 40%. Cambiamento di media di differenziazione contenente una miscela di siero ridotto medio/DMEM, 1% FBS e 20 μM di acido retinoico per 7 a 10 giorni. Aggiorna i media ogni altro giorno fino alla raccolta delle cellule. Nota: poiché le cellule N2A si differenziano, alcune cellule diventano rotonde, si staccano facilmente e possono subire l'apoptosi. Prestare attenzione quando si aspirano e si aggiungono i supporti di coltura alle piastre.</li>
	</ol></li>
	<li>3T3 L1 murine pre-adipociti
	<ol>
<li>Mantenere le cellule del mouse 3T3/L1 in DMEM con alto glucosio, integrato con 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. Il processo adipogenico dipende dalla confluenza delle cellule; Pertanto, non lasciate che la cultura dello stock crescano oltre il 50% di confluenza, poiché una maggiore confluenza compromette la capacità delle cellule di differenziarsi.</li>
		<li>Piastra le cellule a 2 x 104 cellule/cm2. A questa densità, le cellule raggiungeranno confluenza in 3 giorni.</li>
		<li>Indurre la differenziazione adipogenica due giorni dopo che le cellule raggiungono 100% confluenza. I supporti di induzione sono costituiti da DMEM contenenti 10% FBS, 10 μg/mL di insulina, 0,5 mM 3-isobutilil-1-metilxantina, 1 μM di desametasone e 10 μM di troglitazone.</li>
		<li>Sostituire il supporto di induzione dopo 48 h di incubazione ai mezzi di differenziazione (DMEM contenente 10% FBS e 5 μg/mL di insulina). Aggiornare i media ogni altro giorno fino al raccolto. Campioni rappresentativi di differenziazione completa sono normalmente raccolti tra 7 e 10 giorni dopo l'induzione adipogenica. Nota: come progredisce l'adipogenesi, le cellule diventano rotonde e tendono a staccarsi facilmente. Prestare attenzione quando si aspirano e si aggiungono i supporti di coltura alle piastre.</li>
	</ol></li>
	<li>Celle MCF10A
	<ol>
<li>Piastre MCF10A celle in DMEM/F12 (1:1, v:v), integrate con 5% FBS, 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 0,5 μg/mL di idrocortisone, 10 μg/mL di insulina e 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF). La densità di semina raccomandata è 1 x 105 cellule/cm2. In queste condizioni, le cellule raggiungeranno il 100% di confluenza entro 4 giorni. Aggiornare il supporto ogni 2 o 3 giorni fino al raccolto. Nota: le celle MCF10A sono difficili da staccare. Si raccomanda di incubare le cellule per 10-15 min a 37 ° c in PBS senza calcio con 0,5 mM di EDTA prima della tripsinizzazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Cellule renali canina Madin-Darby (MDCK)
	<ol>
<li>Cellule di MDCK a piastre in DMEM integrate con 10% FBS e 100 U/mL di penicillina/streptomicina. La densità di semina raccomandata è 1 x 105 cellule/cm2, dove le cellule raggiungeranno il 100% di confluenza entro 3 giorni. Aggiornare il supporto ogni 2 giorni fino al raccolto. Nota: le celle MDCK sono difficili da staccare. Si raccomanda di incubare le cellule per 5 a 10 min a 37 ° c in PBS senza calcio e magnesio prima della tripsinizzazione. Per prevenire l'aggregazione cellulare non agitare le piastre colpendo o scuotendo il pallone in attesa che le cellule si staccino.</li>
	</ol></li>
</ol>2. preparazione del campione di coltura cellulare dei mammiferi per AAS: frazione di cellule intere e subcellulari
<ol><li>Cultura le cellule di interesse in 55 cm2 piastre. L'uso di piastre di coltura più piccole può produrre campioni con livelli di metalli sotto i limiti di rilevazione del GF-AAS.</li>
	<li>Estratto di cellule intere<ol>
<li>Aspirare i mezzi di coltura utilizzando una trappola per vuoto. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Sciacquare le cellule dai punti temporali o dalle condizioni di coltura desiderati tre volte con PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio.</li>
		<li>Raschiare immediatamente le cellule dalla piastra utilizzando un nuovo raschietto in plastica in 1 mL di PBS privo di calcio e magnesio. Trasferire il campione a una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 2 min a 2.000 x g e aspirare il surnatante. Il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare i campioni di pellet a-20 ° c o procedere al passo 2,4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frazione subcellulare<ol>
<li>Aspirare i mezzi di coltura utilizzando una trappola per vuoto. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Sciacquare le cellule dai punti temporali o dalle condizioni di coltura desiderati tre volte con PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio. Rasare le cellule dalla piastra con 1 mL di PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio.</li>
		<li>Trasferire i campioni in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e tenere il ghiaccio. Centrifugare per 10 s a 10.000 x g. Continuare l'isolamento rapido dei nuclei se si desidera l'analisi del metallo delle frazioni citoplasmatiche e nucleari. Questa procedura ridurrà al minimo la potenziale perdita di metalli a causa dell'estrazione delle cellule39, 40.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante per aspirazione e risospendere il pellet cellulare in 400 μL di PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio, contenente 0,1% Nonidet P-40 (NP-40), un detergente non ionico. Trasferire 100 μL in una nuova provetta per microcentrifuga e considerarla come l'intero campione di cellule. Questa aliquota rappresenta il 25% del campione.</li>
		<li>Isolare i nuclei pipettando la sospensione cellulare da 5 a 10 volte su ghiaccio con una punta di micropipetta P1000. L'isolamento dei nuclei delle cellule epiteliali richiede una concentrazione di 0,5% NP-40. Raggiungere la dissociazione cellulare passando la sospensione cellulare attraverso un ago 26 3/4 G da 10 a 15 volte, seguita da 10-15 passaggi attraverso un ago 30 1/2 G. Nota: verificare l'integrità dei nuclei mediante microscopia leggera utilizzando un obiettivo 40x.</li>
		<li>Centrifugare la sospensione di lisato cellulare rimanente (300 μL) per 10 s a 10.000 x g. Il supernatante conterrà la frazione citosolica. Trasferire i 300 μL in una nuova provetta per microcentrifuga.</li>
		<li>Sciacquare il pellet contenente la frazione nucleare in 500 μL di PBS privo di calcio e magnesio, contenente 0,1% NP-40, quindi centrifugare per 10 s a 10.000 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet contenente i nuclei in 100 μL della stessa soluzione. Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati a-20 ° c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lizzare le cellule da tre cicli di sonicazione (30 s on/30 s off, a 50 kHz, 200 W) per 5 min. quantificare il contenuto proteico totale nel campione da Bradford41.</li>
	<li>Eseguire il controllo di qualità della purezza delle frazioni da Western blot utilizzando anticorpi specifici per il nucleare (istoni, rimodernatori della cromatina, proteine della matrice nucleare) o frazioni citosoliche (β-tubulina, β-actina) (Figura 2). Nota: non utilizzare sonicatori con una punta metallica. Questi possono contaminare il campione con i metalli.</li>
</ol>3. analisi del contenuto di Zn di frazioni intere di cellule e subcellulari di colture cellulari di mammiferi mediante spettroscopia di assorbanza atomica
<ol><li>Mineralizzare i campioni di colture cellulari (intere cellule o frazioni nucleari) mediante digestione acida usando un volume uguale di grado di metallo concentrato HNO3 Trace (Caution) per 1 h a 80 ° c, quindi una notte a 20 ° c.</li>
	<li>Arrestare la reazione aggiungendo il 30% del volume di reazione di H2O2. Portare il volume del campione a 500 μL con acqua purificata da 18 MΩ. Nota: la manipolazione di HNO3 deve essere effettuata indossando occhiali di sicurezza chimici, uno scudo facciale per la protezione da spruzzi, guanti e un respiratore di vapore approvato se la ventilazione adeguata (cappa aspirante) non è disponibile. Il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni possono essere conservati a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Preparare soluzioni standard e campioni sperimentali per misurazioni Zn da AAS dotati di un forno di grafite.<ol>
<li>Utilizzare 2% (v/v) HNO3 soluzione in acqua deionizzata, proveniente dallo stesso lotto utilizzato per la curva standard come la soluzione vuota per la calibrazione in tutto. Utilizzare standard di qualità analitici diluiti in acqua purificata da 18 MΩ.</li>
		<li>Preparare uno standard di 1.000 ppb di Zn da una soluzione di stock di Zn 1.000 ppm commercialmente disponibile con 2% (v/v) di soluzione HNO3 in acqua deionizzata. Preparare le soluzioni standard di lavoro dal 100 ppb standard diluendo a 5, 8, 10, 15, 20, e 25 PPB direttamente con 2% (v/v) HNO3 soluzione in acqua deionizzata. Preparare gli standard Zn e lo spazio vuoto con un modificatore di matrice 0,1% (1 g/L) mg (NO3)2 . Nota: il LOD di Zn è 0,01 ppb (μg/L). Aumentando la concentrazione degli standard, il limite di linearità di Zn è stato determinato a 20 ppb (Figura 3).</li>
		<li>Misurare standard e campioni nelle stesse condizioni ottimizzate: portata di introduzione di 250 mL/min, temperatura di iniezione di 20 ° c e temperatura GF di 1.800 ° c. Nota: la temperatura GF è stata aumentata a 2450 ° c per fasi di pulizia, prima dell'iniezione di un nuovo campione o standard.</li>
		<li>Ottimizzare la lampada (C-HCL) ad una corrente di 20 A, lunghezza d'onda di 213,9 Nm, e fessura di 0,7 Nm.</li>
		<li>Misurare i campioni mineralizzati utilizzando la curva standard Zn per determinare il contenuto metallico. Quando vengono misurati piccoli volumi, i campioni possono evaporare se le misurazioni prendono lunghi periodi di tempo. Pertanto, si consiglia di aggiungere acqua ai campioni. Diluire i campioni con acqua purificata da 18 MΩ trattata con 0,01% HNO3 (grado analitico) se i dati ottenuti superano il LOD. Nota: in genere, i campioni vengono diluiti in un volume di 500 μL, collocati nell'autocampione automatico dell'AAS da misurare subito dopo la stabilita della curva standard. Il volume richiesto deve essere determinato dall'utente e dovrebbe prendere in considerazione i calcoli finali delle concentrazioni. Si consiglia di terminare le determinazioni Zn da AAS di un esperimento completo in un tentativo. La sospensione delle misurazioni può comportare notevoli variazioni sperimentali e incongruenze.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convertire le misurazioni PPB in molarità come ottenuto da Zn misurato tramite AAS. Si consideri la massa di Zn (65,39 AMU). Dividere la quantità di PPB ottenuta da AAS per 63.390.000. Nelle cellule, le concentrazioni di Zn vanno da unità di pmol a μmol.<ol>
<li>Dividere la concentrazione di Zn (pmol o μmol) per la massa iniziale di proteine nel campione determinato da Bradford (passaggio 2,4). Questo calcolo renderà la quantità di metallo (pmol o μmol Zn) contenuta per mg di proteina del campione. Nota: è importante considerare i fattori di diluizione utilizzati durante le determinazioni metalliche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La spettroscopia di assorbanza atomica è un metodo altamente sensibile per la quantificazione di Zn in piccoli campioni biologici di volume/massa. L'ottimizzazione descritta della misura Zn rende semplice l'applicazione di questo metodo e garantisce condizioni analitiche ideali. Qui, utilizzando GF-AAS, abbiamo determinato la concentrazione di Zn in cellule intere, e in frazioni citosoliche e nucleari, da diverse linee cellulari. I risultati dimostrano che questa tecnica rende paragonabile a quelle ottenute da sonde fluo...

La transizione e i metalli pesanti, come Zn, cu, MN e Fe, si trovano naturalmente nell'ambiente in entrambi i nutrienti negli alimenti e negli inquinanti. Tutti gli organismi viventi richiedono quantità diverse di questi micronutrienti; Tuttavia, l'esposizione a livelli elevati è deleteriosa per gli organismi. L'acquisizione di metalli è principalmente attraverso la dieta, ma i metalli possono anche essere inalati o assorbiti attraverso la pelle1,2,3,4,5. È importante notare che la presenza di metalli nelle particelle atmosferiche è in aumento ed è stata in gran parte associata a rischi per la salute. A causa di attività antropogeniche, sono stati rilevati aumenti dei livelli di metalli pesanti come AG, As, CD, CR, Hg, NI, Fe e PB in particolato atmosferico, acqua piovana e suolo6,7. Questi metalli hanno il potenziale per competere con oligoelementi fisiologici essenziali, in particolare Zn e Fe, e inducono effetti tossici inattivando gli enzimi fondamentali per i processi biologici.
L'oligoelemento Zn è redox neutro e si comporta come un acido di Lewis nelle reazioni biologiche, il che lo rende un cofattore fondamentale necessario per la piegatura delle proteine e l'attività catalitica in oltre il 10% delle proteine dei mammiferi8,9, 10; il di conseguenza, è essenziale per diverse funzioni fisiologiche8,11. Tuttavia, come molti oligoelementi, c'è un delicato equilibrio tra questi metalli facilitando la normale funzione fisiologica e causando tossicità. Nei mammiferi, carenze di Zn portano a anemia, ritardo della crescita, ipogonadismo, anomalie della pelle, diarrea, alopecia, disturbi del gusto, infiammazione cronica, e le funzioni immunitarie e neurologiche compromessa11,12, 13,14,15,16,17,18. In eccesso, lo Zn è citotossico e altera l'assorbimento di altri metalli essenziali come il rame19,20,21.
Inoltre, alcuni metalli come Cu e Fe hanno il potenziale per partecipare a reazioni dannose. La produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) tramite la chimica Fenton può interferire con l'assemblaggio delle proteine del cluster di zolfo di ferro e alterare il metabolismo lipidico22,23,24. Per evitare questo danno, le cellule utilizzano chaperoni e trasportatori di legame metallico per prevenire gli effetti tossici. Indubbiamente, l'omeostasi metallica deve essere strettamente controllata per garantire che determinati tipi di cellule mantengano i livelli appropriati di metalli. Per questo motivo, vi è una significativa necessità di avanzare tecniche per la misurazione accurata dei metalli in tracce in campioni biologici. Negli organismi in via di sviluppo e maturi esiste una necessità biologica differenziale per oligoelementi a livello cellulare, in diverse fasi evolutive, e in condizioni normali e patologiche. Pertanto, la determinazione precisa dei livelli di tessuto e di metallo sistemico è necessaria per comprendere l'omeostasi metallica dell'organismo.
La spettrometria di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) è una tecnica altamente sensibile utilizzata per piccoli volumi di campioni, rendendola ideale per misurare la transizione e i metalli pesanti presenti nei campioni biologici e ambientali25,26 , 27 il , 28. Inoltre, a causa dell'elevata sensibilità della tecnica, si è dimostrato appropriato per studiare le proprietà di trasporto fine di na+/K+-ATPase e gastrico H+/K+-ATPase con Xenopus ovociti come sistema modello29. In GF-AAS, gli elementi atomizzati all'interno di un campione assorbono una lunghezza d'onda della radiazione emessa da una fonte di luce contenente il metallo di interesse, con la radiazione assorbita proporzionale alla concentrazione dell'elemento. L'eccitazione elettronica Elementale avviene dopo l'assorbimento di radiazioni ultraviolette o visibili in un processo quantizzato unico per ogni elemento chimico. In un singolo processo di elettroni, l'assorbimento di un fotone coinvolge un elettrone che si muove da un livello di energia inferiore a un livello superiore all'interno dell'atomo e GF-AAS determina la quantità di fotoni assorbita dal campione, che è proporzionale al numero di radiazioni che assorbono elementi atomizzati nel tubo di grafite.
La selettività di questa tecnica si basa sulla struttura elettronica degli atomi, in cui ogni elemento ha una specifica linea spettrale di assorbimento/emissione. Nel caso di Zn, la lunghezza d'onda di assorbanza è 213,9 Nm e può essere precisamente distinta da altri metalli. Complessivamente, GF-AAS può essere utilizzato per quantificare Zn con adeguati limiti di rilevazione (LOD) e alta sensibilità e selettività25. I cambiamenti nella lunghezza d'onda assorbita sono integrati e presentati come picchi di assorbimento di energia a lunghezze di onda specifiche e isolate. La concentrazione di Zn in un dato campione è di solito calcolata da una curva standard di concentrazioni conosciute secondo la legge della birra-Lambert, in cui l'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di Zn nel campione. Tuttavia, l'applicazione dell'equazione di Beer-Lambert alle analisi di GF-AAS presenta anche alcune complicazioni. Ad esempio, le variazioni nell'atomizzazione e/o nelle concentrazioni non omogenee dei campioni possono influire sulle misurazioni metalliche.
L'atomizzazione del metallo necessaria per l'analisi elementale della traccia GF AAS consiste in tre passaggi fondamentali. Il primo passo è la desolvazione, dove il solvente liquido viene evaporato; lasciando i composti secchi dopo che il forno raggiunge una temperatura di circa 100 ° c. Poi, i composti vengono vaporizzati riscaldandoli da 800 a 1.400 ° c (a seconda dell'elemento da analizzare) e diventare un gas. Infine, i composti allo stato gassoso sono atomizzati con temperature che vanno da 1.500 a 2.500 ° c. Come discusso in precedenza, aumentando le concentrazioni di un metallo di interesse renderà aumenti proporzionali sull'assorbimento rilevato dal GF-AAS, ma il forno riduce la gamma dinamica di analisi, che è il campo di lavoro di concentrazioni che possono essere determinato dallo strumento. Pertanto, la tecnica richiede basse concentrazioni e un'attenta determinazione della gamma dinamica del metodo determinando il LOD e il limite di linearità (LOL) della legge della birra-Lambert. Il LOD è la quantità minima richiesta per una sostanza da rilevare, definita come tre volte la deviazione standard di Zn nella matrice. Il LOL è la massima concentrazione che può essere rilevata utilizzando la legge di birra-Lambert.
In questo lavoro, descriviamo un metodo standard per analizzare i livelli di Zn in estratti di cellule intere, frazioni citoplasmatiche e nucleari, e nel proliferare e differenziare le cellule coltivate (Figura 1). Abbiamo adattato il rapido isolamento del protocollo dei nuclei a diversi sistemi cellulari per prevenire la perdita di metallo durante la preparazione del campione. I modelli cellulari utilizzati erano i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, cellule di neuroblastoma murina (N2A o Neuro2A), murine 3T3 L1 adipociti, una linea cellulare epiteliale del seno non tumorigenico umano (MCF10A), e rene epiteliale Madin-Darby canino ( MDCK). Queste cellule sono state stabilite da diversi lignaggi e sono buoni modelli per indagare le variazioni specifiche di lignaggio dei livelli di metallo in vitro.
I mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo costituiscono un modello in vitro ben adatto per indagare la differenziazione muscolare scheletrica. La proliferazione di queste cellule è veloce quando viene coltivata in condizioni sieriche elevate. La differenziazione nel lignaggio muscolare viene quindi indotta da condizioni sieriche basse30. La linea cellulare stabilita dal neuroblastoma murino (N2A) è derivata dalla cresta neurale del topo. Queste cellule presentano la morfologia delle cellule staminali neuronali e amoeboidi. Dopo lo stimolo di differenziazione, le cellule N2A presentano diverse proprietà dei neuroni, come i neurofilamenti. Le cellule N2a sono usate per indagare la malattia di Alzheimer, la crescita del neurite e la neurotossicità31,32,33. Il 3T3-L1 murino pre-adipociti stabilito linea cellulare è comunemente usato per indagare i cambiamenti metabolici e fisiologici associati con adipogenesi. Queste cellule presentano una morfologia simile a fibroblasti, ma una volta stimolata per la differenziazione, presentano l'attivazione enzimatica associata alla sintesi lipidica e all'accumulo di trigliceridi. Questo può essere osservato come cambiamenti morfologici per produrre goccioline di lipidi citoplasmatici34,35. MCF10A è una linea cellulare epiteliale mammaria non tumorale derivata da una donna premenopausale con malattia fibrocistica mammaria36. È stato ampiamente utilizzato per gli studi biochimici, molecolari e cellulari relativi alla carcinogenesi mammaria, come la proliferazione, la migrazione cellulare e l'invasione. La linea cellulare epiteliale del rene canino Madin-Darby (MDCK) è stata ampiamente utilizzata per indagare le proprietà e gli eventi molecolari associati alla creazione del fenotipo epiteliale. Al raggiungimento della confluenza, queste cellule diventano polarizzate e stabiliscono le adesioni cellulari, caratteristiche dei tessuti epiteliali dei mammiferi37.
Per testare la capacità di AAS di misurare i livelli di Zn nelle cellule di mammiferi, abbiamo analizzato frazioni intere e subcellulari (citosol e nucleo) di queste cinque linee cellulari. Le misurazioni di AAS hanno mostrato diverse concentrazioni di Zn in questi tipi di cellule. Le concentrazioni sono state più basse nel proliferare e differenziare i mioblasti primari (da 4 a 7 nmol/mg di proteina) e più in alto nelle quattro linee cellulari stabilite (che vanno da 20 a 40 nmol/mg di proteina). Un piccolo aumento non significativo dei livelli di Zn è stato rilevato nella differenziazione delle mioblasti primari e delle cellule di neuroblastoma rispetto alle cellule proliferanti. L'effetto opposto è stato rilevato in adipociti differenziati. Tuttavia, le cellule 3T3-L1 proliferanti hanno mostrato concentrazioni più elevate del metallo rispetto alle cellule differenziate. È importante sottolineare che, in queste tre linee cellulari, il frazione subcellulare ha mostrato che Zn è distribuito differenzialmente nel citosol e nel nucleo secondo lo stato metabolico di queste cellule. Per esempio, in proliferare mioblasti, cellule N2A, e 3T3-L1 pre-adipociti, la maggior parte del metallo è localizzato al nucleo. Dopo l'induzione della differenziazione utilizzando trattamenti cellulari specifici, Zn localizzato al citosol in questi tre tipi di cellule. È interessante notare che entrambe le linee cellulari epiteliali hanno mostrato livelli più elevati di Zn durante la proliferazione rispetto a quando raggiungono la confluenza, in cui è stato formato un caratteristico monostrato stretto. Nelle cellule epiteliali proliferanti, la linea cellulare mammaria MCF10A aveva una distribuzione uguale di Zn tra il citosol e il nucleo, mentre nella linea cellulare derivata dal rene, la maggior parte del metallo era situata nel nucleo. In questi due tipi di cellule, quando le cellule raggiunsero la confluenza, Zn era prevalentemente localizzato al citosol. Questi risultati dimostrano che GF-AAS è una tecnica altamente sensibile e accurata per eseguire l'analisi elementare in campioni a basso rendimento. GF-AAS accoppiato con frazione subcellulare e può essere adattato per indagare i livelli di oligoelementi metallici in diverse linee cellulari e tessuti.

<table><tbody><tr><td>3-isobutile-1-metilxantina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1005706</td><td></td></tr><tr><td>Anti Brg1-anticorpo (G7)</td><td>Santa Cruz biotechnologies</td><td>sc-17796</td><td></td></tr><tr><td>Anti b-tubulina-anticorpo (BT7R)</td><td>Thermo Scientific</td><td>MA5-16308</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Media (DMEM)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Media/Nutrient Mix (DMEM/F12)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidemale (EGF)Siero</td> fetale <td>bovino Sigma Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>(FBS)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita fibroblastico-Basico (FGF) (AA 10-155)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>Siero PHG0024</td><td></td></tr><tr><td>cavallo</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno (H2O2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95321</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>Insulina-Transferrina-Selenio-A</td><td>ThermoFischer</td><td>51300044</td><td></td></tr><tr><td>Acido nitrico (HNO3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85125</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM (Terreni di siero ridotti)</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>ThermoFischer-Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>PureCol (Collagene)</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Acido rezionale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PHR1187</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>648469-M</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso</td> <td>fenoloThermoFischer-Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Zinco (Zn) puro a elemento singolo, 1.000 & micro; g/mL, 2% HNO3</td><td>Perkin Elmer</td><td>N9300168</td><td></td></tr><tr><td>Established Cell Lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3-L1</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CL-173</td><td></td></tr><tr><td>MCDK</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A</td><td>Collezione di colture di tipo americano</td><td>CRL-10317</td><td></td></tr><tr><td>N2A</td><td>Americano Tipo Collezione di colture</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro ad assorbimento atomico</td><td>PerkinElmer</td><td>Aanalyst 800</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor</td><td>Diagnode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr></tbody></table>

spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

I metalli di transizione sono micronutrienti essenziali per gli organismi, ma possono essere tossici per le cellule ad alte concentrazioni competendo con i metalli fisiologici nelle proteine e generando stress redox. Le condizioni patologiche che portano alla deplezione o all'accumulo di metalli sono agenti causali di diverse malattie umane. Alcuni esempi includono l'anemia, l'enteropatica dell'acrodermatite e le malattie di Wilson e Menkes. È quindi importante essere in grado di misurare i livelli e il trasporto dei metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e accuratezza al fine di facilitare la ricerca esplorando come questi elementi contribuiscano alle normali funzioni fisiologiche e Tossicità. Lo zinco (Zn), ad esempio, è un cofattore in molte proteine dei mammiferi, partecipa a eventi di segnalazione ed è un messaggero secondario nelle cellule. In eccesso, Zn è tossico e può inibire l'assorbimento di altri metalli, mentre in deficit, può portare a una varietà di condizioni potenzialmente letali.

La spettroscopia di assorbimento atomico del forno di grafite (GF-AAS) fornisce un metodo altamente sensibile ed efficace per determinare Zn e altre concentrazioni di metalli di transizione in diversi campioni biologici. L'atomizzazione elettrotermica tramite GF-AAS quantifica i metalli atomizzando piccoli volumi di campioni per la successiva analisi selettiva dell'assorbimento utilizzando la lunghezza d'onda dell'eccitazione dell'elemento di interesse. Entro i limiti della linearità della legge della birra-Lambert, l'assorbanza della luce da parte del metallo è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'analita. Rispetto ad altri metodi per determinare il contenuto di Zn, GF-AAS rileva sia Zn libero e complessato in proteine e possibilmente in piccole molecole intracellulari con alta sensibilità in piccoli volumi di campione. Inoltre, GF-AAS è anche più facilmente accessibile rispetto alla spettrometria di massa plasmatica induttivamente accoppiata (ICP-MS) o alla fluorescenza a raggi X basata su sincrotrone. In questo metodo, viene descritta la preparazione sistematica del campione di diverse linee cellulari coltivate per le analisi in un GF-AAS. Le variazioni di questo oligoelemento sono state confrontate sia nei lisati a cellule intere che nelle frazioni subcellulari di cellule proliferanti e differenziate come prova di principio.

Abbiamo testato la capacità del GF-AAS di rilevare i livelli dei minuti di Zn nelle cellule di mammiferi (Figura 1). Così, abbiamo coltivato i mioblasti primari derivati da cellule satelliti del topo, e le linee cellulari stabilite N2A (neuroblastoma derivato), 3T3 L1 (adipocytes), MCF10A (epitelio del seno), e cellule MDCK (epitelio del rene del cane). In primo luogo, abbiamo isolato le frazioni intere di cellule, citosoliche e nucleari di tutti questi tipi ...

Le linee cellulari primarie o consolidate sono comunemente utilizzate per affrontare questioni biologiche e meccanicistiche fondamentali come approccio iniziale prima di utilizzare modelli animali. Questo protocollo descrive come preparare estratti di cellule intere e frazioni subcellulari per studi di zinco (Zn) e altri oligoelementi con spettroscopia di assorbanza atomica.

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Il ruolo dei metalli di transizione nello sviluppo dei mammiferi è ampiamente sottovalutato. Prove emergenti mostrano che l'omeostasi metallica continua a cambiare in base allo stadio di sviluppo di cellule e tessuti. Inoltre, anche le destinazioni cellulari specifiche dei metalli sono in fase di sviluppo e, naturalmente, è difficile identificarne la posizione.Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche analitiche per quantificare i metalli, ma la maggior parte sono costose o inaccessibili. La ricerca intensiva è focalizzata per migliorare le determinazioni dei metalli in modo più accessibile ed efficiente. La spettroscopia ad assorbimento atomico del forno a grafite, GF-AAS, presenta due vantaggi principali.Fornisce bassi limiti di rilevamento per lo zinco, consentendo un'accurata analisi dello zinco traccia. È anche una tecnica che non richiede elevati volumi di campione, i microlitri di soluzione tendono ad essere sufficienti per eseguire l'analisi. La combinazione di questi due vantaggi rende GF-AAS ideale per analizzare oligoelementi in campioni a basso volume.Diverse condizioni patologiche umane sono legate a squilibri metallici. Alcuni esempi sono l'anemia, l'acrodermatite enteropathica e le malattie di Wilson e Menkes. Pertanto, è importante sviluppare metodi efficienti e affidabili per misurare i livelli di metalli di transizione in campioni biologici con elevata sensibilità e precisione.GF-AAS è un ottimo esempio su una tecnologia che facilita la determinazione di un dato metallo in normali condizioni fisiologiche e in casi patogeni. Il metodo è molto versatile. Può essere applicato a molti sistemi e molti elementi possono essere analisi utilizzando GF-AAS.Le sfide sono stabilire il limite di metodo di rilevamento nella realtà, assicurandosi che i campioni rientrano in questo limite. Dato che il volume dei campioni è basso, non c'è molto spazio per i test, quindi l'esame attento dei dati deve avvenire fin dall'inizio. Dopo la prima analisi dei campioni, dobbiamo stabilire qual è il fattore di diluizione necessario per portare i campioni ai limiti richiesti per la quantificazione.Assicurati di essere in grado di frazionare correttamente i nuclei prima di andare all'AAS. Le macchie occidentali sono sempre una buona convalida prima dell'analisi spettroscopica. Mentre GF-AAS richiede volumi bassi, i pool intracellulari sono già in volumi bassi.Questo dà poco spazio per i test. Le prime misurazioni devono essere accuratamente fatte ed esaminate, in modo che il trattamento del campione possa essere ridotto al minimo a un solo fattore di diluizione. Per iniziare, coltura le cellule di interesse in piastre di 55 centimetri quadrati.Utilizzare una trappola per vuoto per aspirare i mezzi di coltura. Assicurarsi di rimuovere tutte le tracce di supporti. Utilizzare PBS ghiacciato privo di calcio e magnesio per risciacquare le cellule dai punti di tempo desiderati, o dalle condizioni di coltura, tre volte.Quindi aggiungere un millilitro di PBS ghiacciato alla piastra e raschiare le cellule dalla piastra. Trasferire le sospensioni cellulari in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri e tenerlo sul ghiaccio. Centrifugare per 10 secondi a 10.000 volte G e rimuovere il supernatante per aspirazione.Se si desidera un'analisi metallica delle frazioni citoplasmatiche e nucleari, rimescolare il pellet cellulare in 400 microlitri di PBS ghiacciato contenente lo 0,1%NP-40, un detergente non ionico. Trasferire 100 microlitri in un nuovo tubo di microcentrifugo come campione di cellule intere e conservarlo a meno 20 gradi celsius. Per isolare i nuclei, utilizzare una punta in micropipetto P1000 per pipettare la sospensione cellulare da 400 microliter su e giù da cinque a 10 volte sul ghiaccio.Quindi, estrarre cinque microlitri della sospensione cellulare e trasferirli in uno scivolo di vetro al microscopio. Posizionare i cinque microlitri al microscopio leggero utilizzando un obiettivo 40 volte superiore per verificare l'integrità dei nuclei. Centrifugare la restante sospensione a lysato a celle a 395 microliter per 10 secondi a 10.000 volte G.Trasferire il supernatante contenente la frazione citosolica in un nuovo tubo di microcentrifugo.Successivamente, aggiungere 500 microlitri del PBS contenenti 0,1%NP-40 per risciacquare il pellet con la frazione nucleare e centrifugare per 10 secondi a 10.000 volte G.Rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet contenente i nuclei in 100 microlitri della stessa soluzione. Per liscire le cellule, utilizzare un Bioruptor per sonicare l'intera cellula e i nuclei contenenti soluzione tre volte, ciascuno per cinque minuti. Procedere ad eseguire il controllo di qualità della purezza delle frazioni da parte della macchia occidentale, utilizzando anticorpi specifici per le frazioni nucleari o citosoliche.In primo luogo, aggiungere un volume uguale di acido nitrico concentrato di grado di metallo traccia a tutte le frazioni cellulari, citoplasmatiche e nucleari contenenti 100, 500 e 100 microlitri di sospensione cellulare in tubi microcentrifuge da 1,5 millilitri e metterli in un blocco termico a 80 gradi celsius per mineralizzare la coltura cellulare per un'ora. Successivamente, esettare i tubi dal blocco termico e metterli in un rack per continuare la digestione acida durante la notte a 20 gradi Celsius. Interrompere la reazione aggiungendo il 30% del volume del campione di perossido di idrogeno.Portare il volume del campione a 500 microlitri con acqua purificata da 18 mega Ohm. Successivamente, in un tubo Falcon da 15 millilitri diluire l'ossido nitrico standard di grado analitico in acqua purificata a 18 mega Ohm per preparare la soluzione di acido nitrico del due volumi percento come soluzione vuota durante la calibrazione. Quindi, utilizzare la soluzione di acido nitrico del due volumi percento per diluire una soluzione di stock di zinco disponibile in commercio da 1.000 ppm con una concentrazione di 1.000 parti per miliardo.Preparare soluzioni standard di lavoro dalla soluzione standard di zinco da 1.000 parti per milione, la soluzione da 1.000 parti per miliardo, quindi diluirla a 5, 8, 10, 15, 20 e 25 ppb direttamente con una soluzione di acido nitrico del 2%. Posizionare un millilitro del modificatore della matrice di nitrato di magnesio dello 0,1% in tazze campione di polipropilene, quindi caricare le tazze nel carosello dell'autocampionatore. Programmare lo spettrometro ad assorbimento atomico per aggiungere automaticamente cinque microlitri del modificatore della matrice agli standard di zinco e al vuoto.Impostare la stessa condizione ottimizzata sullo spettrometro ad assorbimento atomico per le soluzioni standard e i campioni, con portata di introduzione a 250 millilitri al minuto, temperatura di iniezione a 20 gradi celsius e temperatura del forno di grafite che raggiunge 1.800 gradi celsius in processi in quattro fase. Tutte le norme e i campioni di un singolo esperimento devono essere misurati contemporaneamente per evitare errori dovuti a differenze di taratura o evaporazione. Ottimizzare la lampada C-HCL a una corrente di 20 ampere, lunghezza d'onda di 213,9 nanometri e fessura di 0,7 nanometri.Pipettare i campioni in tazze campione di polipropilene e posizionarli nel carosello dell'autocampionatore. Il limite inferiore di rilevazione dello zinco è di 0,01 parti per miliardo. Aumentando la concentrazione degli standard, il limite massimo di rivelazione dello zinco è determinato in 20 parti per miliardo.Dopo aver ottenuto una curva standard di zinco, misurare i campioni mineralizzati per determinare il contenuto di metallo. Se i dati ottenuti sono oltre il limite di rivelazione, diluire i campioni con acqua purificata da 18 mega Ohm trattata con acido nitrico di grado analitico dello 0,1%. In questo rapido isolamento del protocollo dei nuclei, una macchia occidentale rappresentativa dalla differenziazione dei mioblasti primari mostra la purezza delle frazioni subcellulari.L'enzima rimodellatore di cromatina Brg1 è stato usato per identificare la frazione nucleare, e la tubulina è stata utilizzata per identificare la frazione citosolica. Questa figura mostra le micrografie luminose rappresentative per monostrati proliferano e differenziati o confluenti di ciascun tipo di cella, non e il corrispondente contenuto di zinco negli estratti di cellule intere, nelle frazioni citosoliche e nucleari. Tutte le linee cellulari analizzate in questo studio hanno mostrato concentrazioni di zinco nell'intervallo nanomolare.I miotubi primari differenziati mostravano livelli più elevati di zinco rispetto alle cellule proliferanti. Una distribuzione subcellulare simile dello zinco è stata rilevata nella linea cellulare derivata dal neuroblastoma N2A. D'altra parte, la linea cellulare 3T3-L1 stabilita mostrava livelli più elevati di zinco quando i pre-adipociti proliferavano rispetto a quando erano indotti o differenziati.Le cellule MCF10A mostravano livelli uguali di zinco tra frazioni citosoliche e nucleari nelle cellule proliferanti. Una volta che le cellule MCF10A raggiungono la confluenza, è stata rilevata una diminuzione del 40% dei livelli di zinco a cellule intere e il metallo è stato trovato più concentrato nella frazione citosolica. La spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite è una tecnica altamente sensibile per misurare la transizione e i metalli pesanti in campioni biologici e ambientali.Occorre prestare particolare attenzione e pulizia nella preparazione delle frazioni subcellulari, poiché una contaminazione minima probabilmente interferirà con l'analisi, a causa della sensibilità dell'apparecchiatura. Dati i bassi volumi e i bassi livelli di tracce di metalli in ogni esperimento, è difficile pensare a una tecnica migliore e più accurata per misurare lo zinco rispetto al GF-AAS. Non esistono tecniche attuali in grado di fornire i limiti di rilevamento e il basso volume richiesto al costo relativamente basso del GF-AAS.La spettrometria ad assorbimento atomico del forno a grafite è accurata, sensibile, economica e accessibile. Questa tecnica analitica continuerà a migliorare man mano che le tecnologie di rilevamento elementale continueranno a progredire. La futura applicazione per l'individuazione dello zinco e di altri metalli da parte della GF-AAS includerà organi, tessuti ottenuti da modelli animali e biopsie da pazienti con malattie associate a squilibri metallici sistemici.L'acido nitrico è un acido estremamente corrosivo in grado di causare gravi ustioni chimiche molto rapidamente. Questa sostanza chimica può anche reagire violentemente con alcuni composti come le polveri metalliche. A causa del pericolo rappresentato dall'acido nitrico, è importante adottare severe misure di sicurezza ogni volta che si maneggia acido nitrico.Quando si maneggia acido nitrico si consiglia vivamente di indossare occhiali chimici di sicurezza, schermo facciale per la protezione dagli spruzzi, guanti e respirazione a vapore approvata se la ventilazione non è adeguata.

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