Name: Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Scopri l'analisi automatizzata del lignaggio cellulare in embrioni di C. elegans mediante microscopia isotropica leggera diSPIM. Questo metodo consente di tracciare neuroni in sviluppo con risoluzione subcellulare senza fototossicità.

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Ringraziamo John Murray per il ceppo integrato, ujIs113, per generare deformazione BV514 di linea; Brandon Harvey (NIBIB) per l'aiuto nel testare il protocollo; Jon Daniels e Gary Rondeau (Strumentazione scientifica applicata) per assistenza con Micro-Manager e strumento diSPIM; e Andrew York e Hank Eden per il loro feedback critico sul sistema diSPIM. Ringraziamo anche il programma centro di ricerca per le istituzioni minoritarie e l'Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) per la fornitura di una piattaforma di incontro e di brainstorming. Gran parte di questo lavoro è stato condotto presso il laboratorio biologico marino a Woods Hole attraverso il programma Whitman. Questo lavoro è stato sostenuto dai programmi di ricerca intramurale del NIH National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering e da NIH Grant No. U01-HD075602 e no. R24-OD016474. Mark W. Moyle è stato supportato da F32-NS098616 e Leighton H. Duncan è stato sostenuto da un integratore Diversity a R24-OD016474.

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<li>Santella, A., Du, Z., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+blob-slice+model+for+accurate+and+efficient+detection+of+fluorescence+labeled+nuclei+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A hybrid blob-slice model for accurate and efficient detection of fluorescence labeled nuclei in 3D.</a> BMC Bioinformatics. 11, 580(2010).</li>
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<li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+isotropic+four-dimensional+imaging+with+dual-view+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy.</a> Nature Biotechnology. 31 (11), 1032-1038 (2013).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Stage-+and+Slit-Scanning+to+Improve+Contrast+and+Optical+Sectioning+in+Dual-View+Inverted+Light+Sheet+Microscopy+%28diSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Using Stage- and Slit-Scanning to Improve Contrast and Optical Sectioning in Dual-View Inverted Light Sheet Microscopy (diSPIM).</a> The Biological Bulletin. 231 (1), 26-39 (2016).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-view+plane+illumination+microscopy+for+rapid+and+spatially+isotropic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2555-2573 (2014).</li>
<li>Wu, Y., Christensen, R., Colon-Ramos, D., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+techniques+for+neurodevelopment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging techniques for neurodevelopment.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1090-1097 (2013).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+%28iSPIM%29+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17708-17713 (2011).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+quantitative+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology.</a> Nature Methods. 12 (1), 23-26 (2015).</li>
<li>Winter, P. W., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+fluorescence+microscopy%3A+advances+in+high+speed+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 46-53 (2014).</li>
<li>Lucy, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+iterative+technique+for+the+rectification+of+observed+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Astronomical+Journal%22%5BJournal%5D)">An iterative technique for the rectification of observed distributions.</a> Astronomical Journal. 76 (6), 745-754 (1974).</li>
<li>Richardson, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bayesian-Based+Iterative+Method+of+Image+Restoration%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA%22%5BJournal%5D)">Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration.</a> JOSA. 62 (1), 55-59 (1972).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

C. elegans si distingue come l'unico organismo con le posizioni finali e la connettività di ogni neurone adulto noto27. Tuttavia, le dinamiche evolutive che portano all'organizzazione dei circuiti di lavoro e delle reti che compongono il connettoma di C. elegans restano sconosciute. In base alle opportunità che emergono dai progressi nella microscopia leggera, possiamo ora catturare e analizzare le posizioni delle cellule, la morfogenesi e la neurogenesi in tutto lo sviluppo embrionale di C. elegans .
La procedura che abbiamo descritto e che ordinariamente usiamo in laboratorio produce immagini 4D-isotropiche di neuroni etichettati e nuclei per la linearazione delle cellule negli embrioni C. elegans . Ancora più importante, abbiamo ottimizzato le condizioni di imaging a lungo termine con il diSPIM e accoppiato semi-automatizzato capacità di linearizzazione con immagini ad alta risoluzione per migliorare la velocità e la precisione di analisi C. elegans embriogenesi. Questo protocollo integrato consentirà agli utenti di visualizzare e identificare le cellule e di quantificare le caratteristiche tridimensionali come la migrazione del neurite e la fascicolazione degli assoni attraverso l'insorgenza di spasmi precoci. Questa procedura può essere facilmente adattata in qualsiasi struttura con un sistema ASI diSPIM e raccomandiamo questo sistema in modo specifico per questo protocollo. Altre formulazioni SPIM offerte commercialmente possono differire dalla configurazione ASI nella camera di campionamento e le proprietà ottiche. Tuttavia, i dati esportati da altre piattaforme possono anche essere messi attraverso la nostra pipeline di dati. Pertanto, è fattibile la valutazione del loro valore in linea, un test impegnativo di qualità dell'immagine e stabilità dello strumento. Anche se usiamo attivamente il diSPIM per l'immagine periodica di altri esemplari (come la Drosophila e gli embrioni di pesce zebra), l'analisi di lignaggio descritta e completa degli embrioni è ancora attualmente limitata alle specie di nematode. Per i campioni più grandi o spessi, optiamo per utilizzare approcci di scansione dello stage, che scansionano i campioni attraverso un foglio luminoso stazionario. Hanno precedentemente dimostrato questo sezionamento di diSPIM migliorato per produrre immagini di alta qualità da campioni spessi senza ulteriori modifiche al diSPIM10.
I passaggi critici all'interno del protocollo includono il montaggio di embrioni C. elegans sul vetrino rivestito in poli-L-lisina, l'acquisizione dei dati e l'elaborazione dei dati. La raccolta e il montaggio di embrioni C. elegans sul vetrino coprivetrino può essere impegnativo per gli utenti inesperti, ma qui forniamo un protocollo dettagliato di passaggi chiave per facilitare l'apprendimento. Se si desidera l'imaging a lungo termine, otteniamo i migliori risultati raccogliendo quattro celle o embrioni precedenti da 8-10 giovani adulti28. Si noti che i vecchi adulti sono meno desiderabili di raccogliere embrioni in fase precoce perché tendono a contenere embrioni più vecchi nell'utero e uova non fertilizzate. Per quanto riguarda gli embrioni di montaggio, problemi quali il blocco nell'aspiratore assemblato (pipetta per bocca) o un troppo grande di un'apertura nella pipetta microcapillare possono impedire il corretto montaggio e l'orientamento degli embrioni. Per prepararsi all'imaging ottimale, eseguiamo test di pre-acquisizione su embrioni precoci e ritardanti per verificare le prestazioni dei fogli leggeri, delle fotocamere, degli obiettivi e dell'autofocus. Otteniamo i migliori risultati quando tutte queste operazioni vengono testate e producono immagini di alta qualità durante i test di pre-acquisizione. Ciò è particolarmente rilevante per la generazione di immagini con risoluzione spaziale isotropica, per cui le immagini raw acquisite da entrambe le viste (obiettivi) devono essere di alta qualità. Dopo l'acquisizione, i volumi acquisiti per ogni vista vengono elaborati per produrre immagini isotropiche. È importante utilizzare una scheda di elaborazione grafica (GPU) appropriata come descritto in questo protocollo (vedere di seguito). Ciò migliora la velocità di elaborazione alla quale vengono generate le immagini con fusibili isotropicali, abbreviando il tempo di analisi dei dati. È inoltre imperativo che gli utenti stiano eseguendo l'ultima versione di CytoSHOW e stiano utilizzando i parametri forniti con il nostro bundle di download per la linea automatica StarryNite. Se gli utenti sono interessati a utilizzare la linearizzazione automatica per altri campioni (ad esempio, zebrafish, Drosophila ecc.), sarà necessaria un'ulteriore ottimizzazione dei parametri utilizzati in starrynite (vedere riferimenti3,4).
Anche se il nostro protocollo integrato fornisce immagini e risultati di linearizzazione nell'embrione pre-spasmi, gli utenti devono essere consapevoli che la linearizzazione automatizzata nell'embrione post-spasmi non è attualmente fattibile: le posizioni nucleari cambiano nell'ordine dei secondi nel embrione post-contrazione, troppo rapidamente per consentire il tracciamento del lignaggio. Tuttavia, il dispim ha effettivamente dimostrato una capacità promettente per catturare eventi di sviluppo neurologico e tenere traccia di alcune posizioni cellulari nelle fasi post-contrazione dell'embriogenesi23,29. Se gli utenti sono interessati ad esaminare l'embrione post-spasmi, il diSPIM fornisce la velocità per ottenere istantanee volumetriche e tenere traccia di eventi neuroevolutivi fini, come la crescita del neurite, in embrioni in rapido movimento.
Questo protocollo sarà fondamentale per il completamento cellulare per cella del WormGUIDES Atlas30, in quanto fornirà un approccio integrato con immagini isotropiche ad alta risoluzione per identificare e catturare morfologie 3D di neuroni etichettati durante primi 430 minuti di embriogenesi. Così com'è, il prototipo di WormGUIDES Atlas fornisce posizioni nucleari di cellule nell'embrione in via di sviluppo e mira a catturare le dinamiche evolutive di un sottoinsieme di neuroni embrionali. Questo protocollo sarà una chiave per l'integrazione di ulteriori neuroni in via di sviluppo nell'Atlante WormGUIDES30.
Il nostro protocollo integrato semplificherà anche l'esplorazione di nuovi profili di espressione genica nell'embrione C. elegans . In C. eleganstransgenici, molti promotori specifici delle cellule controllano spazialmente e temporalmente l'espressione transgenica. Mentre i modelli di espressione della maggior parte dei geni sono stati ampiamente caratterizzati nell'animale adulto31,32,33,34, quasi tutti devono ancora essere caratterizzati nello sviluppo (soprattutto tardo stadio) embrionale. Il C. elegans promoterome è stata una risorsa utile per la comunità di worm per guidare l'espressione transgenica specifica delle cellule, così come determinare se la funzione genica è cellula-autonoma o non autonoma. Catturare i modelli isotropici ad alta risoluzione e di espressione dinamica dei geni, e identificare con precisione le cellule che esprimono attraverso la lineaging, sarà prezioso per molti nella comunità scientifica.
L'embriogenesi comprende due processi principali intrecciati, la differenziazione cellulare e la morfologenesi tissutale. Si conoscono molto i meccanismi e le molecole che definiscono i tipi di cellule distinti durante lo sviluppo di C. elegans. Tuttavia, si sa poco sui meccanismi importanti per la migrazione cellulare, l'adesione delle cellule e la forma delle cellule nell'embrione C. elegans . Con il lignaggio di cellule invarianti C. elegans conosciuto, il nostro protocollo ci permette di discernere facilmente la microanatomia 3D catalogata dell'embrione durante la morfogenesi a nuovi livelli di dettaglio: ad esempio, fascicolazione degli assoni, sinaptogogia e attività neuronale. Hanno precedentemente dimostrato la potenza del diSPIM per catturare i transienti di calcio a livello di un singolo neuroni in C. elegans embrioni23. Molti altri aspetti della fisiologia dello sviluppo sono maturi per l'inchiesta con questi metodi.
Infine, questo protocollo è in gran parte automatizzato e riduce sistematicamente il tempo necessario per generare immagini di deconvoluzione ed eseguire la linearizzazione delle cellule tramite StarryNite e Acetree. Le strategie software utilizzate in questo protocollo possono essere applicate a molte domande di biologia lontane dai campi molto specifici in cui li abbiamo dimostrati qui.
Dettagli sulla compatibilità del software e sull'accesso al download
Le informazioni su Micro-Manager e plugin per l'imaging diSPIM sono disponibili su http://dispim.org/software/micro-manager e https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
La pipeline di elaborazione dei dati richiede attualmente un sistema operativo Windows. Abbiamo in bundle un unico file di archivio per semplificare l'installazione di tutti i programmi di elaborazione dati necessari e file di supporto. È disponibile per il download su http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) si basa sulla piattaforma di analisi dell'immagine ampiamente utilizzata e open source, ImageJ (V1). Java deve essere installato e aggiornato sul computer per utilizzare CytoSHOW e gli aggiornamenti di CytoSHOW vengono distribuiti automaticamente tramite Java Web Start. Molte funzioni basate su ImageJ di CytoSHOW sono descritte e illustrate in https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW è stato personalizzato per visualizzare dati grezzi multidimensionali da ASI diSPIM, così come altri software di imaging che crea l'output TIFF. In linea di principio, altri sistemi di imaging SPIM multi-vista potrebbero essere supportati da piccole modifiche di CytoSHOW per consentire che questo protocollo venga eseguito su diversi sistemi di microscopio.

SpimFusion è stato scritto in CUDA/C++ utilizzando Visual Studio 2013 con CUDA Toolkit v 7.5. L'esecuzione di SpimFusion richiede hardware specifico per computer: una scheda GPU con capacità di elaborazione CUDA 1,0 o superiore e un minimo di 2 GB di memoria della scheda grafica. Al momento della pubblicazione del nostro protocollo, SpimFusion non è pubblicata (min Guo e Hari Shroff) ma disponibile nell'archivio del bundle software menzionato sopra.

Una versione di StarryNite basata sulla riga di comando appositamente costruita richiede che il MATLAB Compiler Runtime sia disponibile gratuitamente, ma non richiede una licenza per il software MATLAB commerciale. MATLAB Compiler Runtime è incluso nell'archivio del bundle software menzionato sopra. Il codice per StarryNite utilizzato in questo protocollo è sostanzialmente invariato rispetto a quello utilizzato per le immagini confocali6. Tuttavia, diverse questioni operative nella creazione di immagini di input per l'elaborazione di StarryNite e la gestione dei risultati di StarryNite sono state affrontate qui da metodi in CytoSHOW che consentono una pipeline di elaborazione dati continua per diSPIM isotropico fuso Volumi. Queste modifiche sono automatizzate dal codice CytoSHOW che gestisce questi passaggi di pre e post-elaborazione. CytoSHOW modifica anche un set di parametri StarryNite preottimizzato specifico per il modello diSPIM per sintonizzare automaticamente l'algoritmo di segmentazione all'intensità di fluorescenza dei nuclei nei dati iminvecchiati. I parametri univoci utilizzati da StarryNite su ogni set di dati diSPIM vengono quindi salvati in un file insieme all'immagine di output e ai dati di linearaging.
Una versione personalizzata di AceTree che funziona con immagini a 16 bit e mantiene la compatibilità con il rendering Java3D è più adatto per questo protocollo. È anche incluso nell'archivio del bundle software menzionato sopra.

C. elegans si distingue come l'unico organismo in cui ogni cellula dell'embrione può essere osservata durante tutto il neurosviluppo. Con l'intera cellula-lignaggio noto e invariante1, e con lo sviluppo di nuovi strumenti che consentono l'etichettatura e l'imaging continuo di singole cellule in embrioni, biologi possono ora iniziare a esaminare diversi passi nello sviluppo del nematode nervoso sistema da tutti gli angoli-nascita delle cellule; migrazione e differenziazione; Formazione di neurite, crescita mirata e fascicolazione; Formazione di sinapsi; e messa a punto dei circuiti funzionali. Catturare le dinamiche di conseguenza neuronale nell'embrione C. elegans , combinando i reporter espressi in modo stabile e la microscopia a fluorescenza, è prezioso per la comunità scientifica.
Gli studi sullo sviluppo in C. elegans spesso sfruttano il lignaggio delle cellule invarianti e le mappe del destino cellulare di questa specie per aumentare la comprensione contestuale a livello di singola cellula all'interno dell'organismo intatto1. Analisi di allineamento automatico-utilizzo di starrynite2,3,4 e acetree5,6,7,8 software-vantaggi da alto contrasto, alta risoluzione immagini di nuclei fluorescenti. Per lavorare in modo ottimale, StarryNite/AceTree dipende anche dall'orientamento vincolato prevedibile degli embrioni iminvecchiati durante lo sviluppo. Microscopia confocale, fatto in C. elegans embrioni compressi tra due coprioggetti, è stato il metodo di microscopia di auto-linearaggio standard per più di un decennio perché fornisce sia ad alto contrasto/alta risoluzione e una prevedibile vincolato orientamento dell'embrione7,8. In precedenza abbiamo descritto la costruzione e l'uso di un nuovo microscopio a doppia vista con illuminazione a doppio piano (dispim) per l'imaging di campioni vivi come l'embriogenesi C. elegans 9,10 , 11 il , 12 anni di , 13. la microscopia a foglio leggero, in generale, fornisce una bassa fototossicità, alta velocità e imaging a lungo termine di campioni 3D in diretta14,15. Il metodo diSPIM, in particolare, produce immagini quadridimensionale (4D) con una risoluzione spaziale quasi isotropica di circa 330 Nm9.
Rispetto alla microscopia confocale, diSPIM offre maggiore segnale-rumore e velocità, più risoluzione spaziale isotropica ed è più adatto per l'imaging a lungo termine in vivo 16. Abbiamo quindi lavorato per adattare i dati diSPIM per l'input in StarryNite/AceTree e abbiamo esaminato se ciò migliorasse le analisi di lineaging. Un ostacolo importante è che i campioni diSPIM non possono essere facilmente vincolati dalla compressione di guscio d'uovo per adottare gli orientamenti previsti per StarryNite/AceTree. L'orientamento casuale delle posizioni delle celle nel volume analizzato diminuisce la precisione dell'analisi di allineamento automatico.
Abbiamo quindi impiegato CytoSHOW, un'interfaccia utente guidata dagli spettatori che consente agli utenti di selezionare l'orientamento 3D preciso degli embrioni durante la pre-elaborazione delle immagini diSPIM, ottenendo dati di immagine che sono ottimizzati per la qualità e consapevoli del contesto per l'input in StarryNite /AceTree. Dopo la selezione degli embrioni iminvecchiati, CytoSHOW coordina una pipeline di elaborazione automatizzata dei dati. Le immagini embrionali ritagliate e in background vengono salvate all'interno dei file dello stack TIFF per ogni posizione, timepoint e vista. Cytoshow quindi chiama iterativamente il programma spimfusion per co-registrare e congiuntamente deconvolve le due viste pre-elaborate, utilizzando l'algoritmo Richardson-Lucy17,18 per produrre immagini volumetriche ad alta risoluzione isotropica. Un set di parametri specifico per diSPIM è stato ottimizzato per StarryNite per regolarne il comportamento durante la segmentazione dell'immagine e il tracciamento del nucleo in immagini fuse in modo isotropicale. Le immagini fuse e i risultati di lineaging vengono quindi modificati utilizzando AceTree, che consente agli utenti di identificare e correggere eventuali errori nella traccia di derivazione automatica generata da StarryNite. AceTree può anche presentare lignaggio albero e rendering 3D modellato di nuclei monitorati nell'embrione. Troviamo che la velocità e la precisione della linea automatica sono notevolmente migliorate utilizzando immagini fuse isotropicamente, se confrontate con immagini RAW da una telecamera SPIM. Il nostro protocollo, mentre ottimizzato per l'applicazione C. elegans descritta qui, potrebbe essere generalmente adattato per l'auto-linearaging dei dati dispim prodotti per altre specie o esemplari. Se questo è l'uso previsto del protocollo, si prega di notare che la sintonizzazione aggiuntiva dei parametri starrynite sarà probabilmente necessario per i nuovi esemplari, come descritto3,4.
L'implementazione riuscita di questo protocollo produce immagini con risoluzione 4D-isotropica e consente ai biologi di tracciare i lineages delle cellule, identificando e analizzando simultaneamente i neuroni nell'embrione C. elegans in via di sviluppo. Inoltre, unendo diversi algoritmi di post-elaborazione-con l'accelerazione hardware essendo il più dispendioso in termini di tempo di questi-possiamo ora analizzare sia i dettagli subcellulari fini e le cellule-lignaggi e cellule-destati di embrioni vivi in tempo essenzialmente reale. Questo nuovo protocollo consente una manipolazione precisa e informata e l'osservazione del comportamento delle cellule durante gli studi probativi di differenziazione e morfogenesi in vivo. In questo manoscritto, presentiamo una spiegazione dettagliata dei protocolli migliorati che abbiamo sviluppato per la lineaging e il monitoraggio delle cellule nello sviluppo di embrioni C. elegans , per migliorare gli studi di embriogenesi, espressione genica o neurosviluppo.

<table><tbody><tr><td>Steps 1-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini di concavità</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1519006</td><td>5-18 mm di diametro, 0,6-0,8 mm di profondità, 1,2-1,5 mm</td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione con 10& &ndash; 50&volte; gamma di zoom</td><td>Motic</td><td>SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>E. coli (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti, n. 1.5, 24 &volte; 50 mm</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>M9 Buffer</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Manutenzione di C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>Metilcellulosa &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7509-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo aspiratore per pipette microcapillari</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Pipette microcapillari, 0,4 mm i.d</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-800</td><td></td></tr><tr><td>Ago, n. 18G x 1 e frac12; (1,2 mm x 40 mm)</td><td>BD Precision Glide</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>piastre</td><td></td><td></td> NGM <td>preparate come descritto da Brenner (1974)</td></tr><tr><td>O-ring per camera di imaging</td><td>O-ring West</td><td>M1.5X40</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur</td><td>Corning/Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095D5X</td><td></td></tr><tr><td>Filo di platino, diametro 0,5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>267201</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>Camera rettangolare in acciaio inossidabile (76,0 mm x 50,5 mm)</td><td>Strumentazione scientifica applicata (ASI)</td><td>I2450</td><td></td></tr><tr><td>Worm Eyelash Pick Hart</td><td></td><td></td><td>, A. C. Comportamento. WormBook.&nbsp; (2006).</td></tr><tr><td>Worm Pick</td><td></td><td></td><td>Stiernagle, T. Manutenzione di C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006).</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Passaggi 5-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm filtro passa-lungo</td><td>Semrock</td><td>LP02-488 RU-2</td><td></td></tr><tr><td>561-nm filtro notch</td><td>Semrock</td><td>NF03-561E-25</td><td></td></tr><tr><td>BLP02-561R-25, quantità 2</td> Filtro bordo passa-lungo <td>Semrock</td><td></td><td>561 nm EdgeBasic con il miglior rapporto qualità-prezzo</td></tr><tr><td>Software di controllo per telecamera inferiore</td><td>Jenoptik</td><td></td><td>ProgRes CapturePro</td></tr><tr><td>video di montaggio SIPM</td><td>Strumentazione scientifica applicata (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ;</td></tr><tr><td>http://www.asiimaging.com video di allineamento diSPIM</td><td>Strumentazione scientifica applicata (ASI)</td><td></td><td>https://youtu.be/qnOrg30NNuE</td></tr><tr><td>diSPIM imaging PC</td><td>Intel</td><td></td><td>Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 core in totale,&nbsp; 64&nbsp; GB di memoria, Windows 7</td></tr><tr><td>FF01-525/45-25, quantità 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>525/45 nm BrightLine filtro passa-banda a banda singola</td></tr><tr><td>FF555-DI03-25X36, quantità 2</td><td>Semrock</td><td></td><td>555 nm edge BrightLine single-edge dicroic beamsplitter</td></tr><tr><td>Scheda grafica per PC di imaging</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti schede grafiche</td></tr><tr><td>Kumar et al diSPIM Installazione</td><td>Strumentazione di Applied Scientifics (ASI)</td><td></td><td>La configurazione dello strumento per questo protocollo è identica a quella di Kumar et al 10,11 &nbsp; diSPIM, che utilizza lenti a immersione in acqua 40x 0,8NA per l'imaging. (Vedere i passaggi 5.1 e notare)</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>Modifiche a Kumar et al diSPIM Setup (vedi sotto)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo ottico con isolatori, 4 piedi & volte; 6 piedi & volte; 12 pollici</td><td>TMC</td><td>784-651-02DR e 14-416-34</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda </td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Passaggi 7-10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis PC</td><td>Intel</td><td></td><td>Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 core in totale, 64 GB di memoria, Windows 10</td></tr><tr><td>Analysis PC Scheda grafica</td><td>NVIDIDA</td><td></td><td>NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti Installazione delle schede grafiche</td></tr><tr><td> istruzioni</td><td>Pacchetto</td><td></td> software <td>http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm</td></tr><tr><td>Pacchetto software</td><td>Pacchetto</td><td></td> software <td>http://dispimlineage.wormguides.org</td></tr></tbody></table>

microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) si distingue come l'unico organismo in cui si può osservare la sfida di comprendere le origini cellulari di un intero sistema nervoso, con una risoluzione a singola cellula, in vivo. Qui, presentiamo un protocollo integrato per l'esame del neurosviluppo negli embrioni di C. elegans . Il nostro protocollo combina Imaging, linearaggio e tracciamento neuroanatomico di singole cellule nello sviluppo di embrioni. Otteniamo immagini a lungo termine, a quattro dimensioni (4D), di embrioni viventi C. elegans con risoluzione spaziale quasi isotropica attraverso l'uso di microscopia a doppia vista invertita di illuminazione piana selettiva (dispim). I nuclei e le strutture neuronali negli embrioni di nematode sono iminvecchiati e fusi isotropicamente per produrre immagini con risoluzione di ~ 330 Nm in tutte e tre le dimensioni. Questi set di dati 4D ad alta risoluzione minuto per minuto vengono quindi analizzati per correlare le identità definitive di lignaggio delle cellule con l'espressione genica e le dinamiche morfologiche a livelli di dettaglio a cellule singole e subcellulari. Il nostro protocollo è strutturato per consentire l'implementazione modulare di ciascuno dei passaggi descritti e migliorare gli studi sull'embriogenesi, l'espressione genica o il neurosviluppo.

Per prima cosa abbiamo convalidato la redditività degli embrioni iminvecchiati utilizzando i parametri del protocollo per l'acquisizione di diSPIM (sezioni 1-6). Dieci embrioni sono stati simultaneamente iminvecchiati a 20 ° c, un volume/embrione/minuto, dalla fase a 2 cellule fino allo stadio 2 volte (7,5 ore, 451 volumi/embrione). Per monitorare le divisioni cellulari in tutta l'embriogenesi, abbiamo usato il ceppo BV514, che esprime in modo onnipresente i costrutti reporter mCherry::Histone dall'array transgenico integrato ujIs11324. La Figura 6 Mostra una linea temporale di questa prima metà dello sviluppo embrionale per uno degli embrioni iminvecchiati. Ogni immagine rappresenta una proiezione ad intensità massima a vista singola (prodotta dai passaggi 7-8) dell'embrione immaturato. Abbiamo riscontrato che i protocolli ottimizzati non inducono alcuna fototossicità rilevabile agli embrioni, come valutato dalla tempistica delle divisioni cellulari (non mostrate), dal tempo di cova e dai tempi relativi alle tappe dello sviluppo (Figura 6 e riferimenti1 , 25 il , 26).
Abbiamo quindi applicato il protocollo per analizzare le dinamiche di conseguenza dei singoli neuroni nello sviluppo di embrioni. Abbiamo immagine DCR7692 (olaex4655), un ceppo di nematode transgenico che esprime GFP off il neuropeptide FLP-19 promoter in un sottoinsieme di cellule non identificate (DACR2819, PFLP-19 (3.6 KB):: Syn21:: GFP:: CAAX::p 10 3' UTR) . Seguendo le fasi del protocollo qui delineato, abbiamo stabilito che le cellule non identificate corrispondono ai motoneuroni RMDDL e RMDDR, alla cellula del canale escretore, e a due cellule muscolari (Figura 7). Abbiamo poi esaminato e quantificato le dinamiche di conseguenza dei neuroni rmddl e rmddr. Abbiamo osservato che i neuroni RMDDL e RMDDR sono sagomati obliquamente già 360 minuti dopo la fertilizzazione, con l'asse cellulare più lungo che rappresenta l'asse successivo per la crescita del neurite (Figura 7 e film S1). Utilizzando il plugin "semplice neurite tracing" in FIJI e applicandolo alle ricostruzioni 3D dei volumi isotropicali fusi, abbiamo quindi quantificato la crescita stereotipata dei neuriti RMDDL e RMDDR per sei embrioni. Abbiamo stabilito che le dinamiche di conseguenza sono state stereotipate per rmddl e rmddr attraverso gli embrioni (qui denominati rmdd). A partire da 385-410 minuti dopo la fertilizzazione, i neuriti Rmdd hanno esteso 6,0 ± 0,5 μm (media ± SEM; n = 12 neurites) anteriori dei corpi cellulari (Figura 7b, C, I). A partire da 415-445 minuti dopo la fertilizzazione, entrambi i neuriti si estendono all'interno e all'intorno dell'anello nervoso presuntivo (asterisco in Figura 7D). In media, ogni neurite RMDD estesa 11,0 ± 0,6 μm (media ± SEM; n = 12 neuriti) dal corpo cellulare prima di incontrare in modo sincrono la sua controparte controlaterale all'apice dell'anello (Figura 7i). È importante sottolineare che i nostri risultati rappresentativi dimostrano che siamo in grado di esaminare, confrontare e quantificare le caratteristiche di sviluppo neuronale per le singole cellule identificabili utilizzando il nostro protocollo integrato (Figura 7 e Figura 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig1.jpg"> Figura 1: impostazione del montaggio del campione diSPIM. (A) preparazione del vetrino coprioggetti con poli-L-lisina. Nell'inserto, 10 μL di lisina Poly-L è stato utilizzato per rivestire il vetrino coprioggetti per 5 minuti. Poly-L-lisina permette l'embrione uovo di attaccare saldamente al vetrino coprioggetti nel rettangolo. B) schema della camera di imaging in acciaio e della camera assemblata. Negli inset, gli embrioni rappresentativi sono orientati con l'asse anteriore-posteriore perpendicolare all'asse lungo sul coprioggetto. C) tubo aspiratore assemblato con pipetta microcapillare. D) camera di imaging in acciaio montata nel supporto del campione secondo gli obiettivi dispim 40x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig2.jpg"> Figura 2: configurazione di imaging diSPIM a lungo termine in Micro-Manager. (A) parametri di potenza laser dispim consigliati (rettangolo rosso) ottimizzati per l'imaging prolungato, riducendo la fototossicità (come valutato con un tasso di cova più elevato di embrioni di C. elegans ). Impostare 561 nm laser a 79 μW (0,25) e 488 nm laser a 179 μW (0,5). Si noti che la calibrazione esatta delle impostazioni del software per la potenza laser varia tra le installazioni diSPIM. Si raccomanda agli utilizzatori di misurare e calibrare la potenza del laser al fine di ottenere 79 μW (561 Nm) e 179 μW (488 nm) di potenza laser. (B) parametri dispim per il salvataggio dei dati (rettangolo verde), le impostazioni del volume (quadrato blu) e le impostazioni di taglio (quadrato arancione). (C) parametri di messa a fuoco automatica dispim per immagini a lungo termine dell'embriogenesi C. elegans (vedere passaggi 6.1-6.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig3.jpg"> Figura 3: visualizzazione delle immagini e impostazione dell'elaborazione dei dati tramite CytoSHOW. (A) immagini dispim RAW aperte da cytoshow. CytoSHOW è in grado di aprire le immagini catturate da entrambi i percorsi della telecamera (SPIM A e B). Queste immagini RAW vengono aperte in finestre multidimensionali chiamate Monitor Dispim. Nel Monitor Dispimviene generato un "pattern bowtie" per selezionare i bordi anteriori, posteriori, dorsali e ventrale dell'embrione (vedere il passo 9,1). Le selezioni di Papillon indicano l'orientamento dell'embrione per la deconvoluzione e la tracciatura di lineaging assistita da StarryNite. (B) parametri ottimizzati utilizzati per generare immagini isotropiche. Nella finestra Deconvolved durante l'acquisizione , impostare i parametri specificati nei passaggi 9.5.1-9.5.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig4.jpg"> Figura 4: configurazione della telecamera diSPIM. (A) fotografia di posizionamenti e orientamenti della fotocamera dispim. (B) rappresentazione di + 90 rotazioni di grado di SPIM a per abbinare le immagini SPIM B raccolte. (C) volumi di input relativi all'indice di orientamento + 1 in base alla configurazione della fotocamera del dispim (vedere il passo 9.5.2). Ruotiamo SPIM un'immagine (s) + 90 gradi intorno asse Y prima della registrazione per abbinare SPIM B immagine (s). Barre di scala = 10 μm. le immagini sono rappresentative a vista singola, proiezioni di massima intensità e immagini deconvoluzione di embrione di 1,5 volte con nuclei etichettati (561-Nm, rosso) e neuroni (488-nm, verde). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig5.jpg"> Figura 5: curation e modifica del lignaggio embrionale C. elegans in acetree. (A) usiamo acetree per modificare le tracce di lignaggio di starrynite (vedi riferimenti5,6,8; i manoscritti sono inclusi anche nel nostro pacchetto di download). AceTree visualizzerà C. elegans nomi sistematici per ogni nucleo (rettangolo verde) al completamento dei passaggi 10.1-10.2. Questa finestra (a) fornisce informazioni (rettangolo nero) su ogni cella nella traccia di derivazione (ABA, evidenziata in blu) che consentono di guidare gli utenti durante il rilevamento e la modifica delle tracce di derivazione. Si raccomanda agli utenti di verificare e confrontare le celle linearate e le loro posizioni al lignaggio di cellule embrionali C. elegans precedentemente segnalati da Sulston et al.1 inoltre, se gli utenti sono interessati a localizzare celle specifiche nel serie di dati deconvolved (Vedi sotto, B) immettere il nome sistematico C. elegans nella barra di ricerca (rettangolo arancione). (B) la serie di dati deconvolved dell'utente si apre automaticamente anche al completamento dei passaggi 10.1-10.2. Qui viene mostrata un'immagine isotropicamente fusa di un embrione a quattro celle con nuclei etichettati in rosso. Durante il tracciamento di un nucleo, gli utenti dovrebbero cambiare l'intensità dell'immagine (quadrato rosso) e navigare attraverso il tempo e z utilizzando i tasti freccia sulla loro tastiera (tempo-sinistra/destra, z-su/giù). (C) fumetto 3D del timepoint in (B) con alcune funzionalità (rettangolo viola) che consente la visualizzazione 3D ruotabile. Per una panoramica dell'acetree e della sua funzionalità 3D, vedere i riferimenti5,6,8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig6.jpg"> Figura 6: dinamiche evolutive cronometrate degli embrioni di C. elegans sul dispim. Pannello superiore, immagini diSPIM che mostrano la prima metà dello sviluppo embrionale per uno degli embrioni iminvecchiati (strain BV514 ujIs11324). Gli embrioni sono stati continuamente iminvecchiati, ogni minuto per 7,5 ore (a 20 ° c). Le prime due immagini del pannello superiore rappresentano embrioni a 4 e 8 celle con nuclei (rossi) e posizioni di corpi polari (sfere rosse dense, contrassegnate con asterischi blu). Ogni immagine rappresenta una proiezione ad intensità massima a vista singola dell'embrione immaturato. Barre di scala = 10 μm. La Timeline (barra orizzontale) rappresenta i minuti dopo la fertilizzazione (m.p.f.) dello sviluppo degli embrioni di C. elegans . Abbiamo convalidato che i parametri del nostro protocollo per l'acquisizione di diSPIM non inducesse alcuna fototossicità rilevabile agli embrioni iminvecchiati come valutati dalla vitalità, dalla tempistica delle divisioni cellulari, dalla tempistica della schiusa e dalla tempistica delle tappe di sviluppo (vedere riferimenti 1 il , 25 il , 26). notiamo che i tempi delle tappe dello sviluppo sono stati riproducibili attraverso gli embrioni con i nostri parametri di imaging (SEM ± 8,174 minuti per sessioni di imaging lunghe 6,4 ore; n = 10). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig6large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig7_v2.jpg"> Figura 7. Identificazione cellulare e caratterizzazione a cellula singola delle dinamiche di crescita del neurite nello sviluppo di embrioni di C. elegans . Imaging a doppio colore di una deformazione effettuata attraversando BV514 ujIs11324 (per la Lineage) e DCR7692 (olaex4655), un ceppo di nematode transgenico che esprime GFP al di fuori del promotore del neuropeptide FLP-19 in un sottoinsieme di cellule non identificate. (A-H) Seguendo le fasi del protocollo qui delineato, abbiamo stabilito che le cellule non identificate corrispondono ai motoneuroni RMDDL e RMDDR (frecce gialle), alla cellula del canale escretore (frecce blu), e a due cellule muscolari (frecce bianche). (I) quantificazione delle dinamiche di conseguenza dei neuroni rmddl e rmddr utilizzando il plugin Fiji "semplice rintracciamento del neurite" e applicandolo alle ricostruzioni 3D dei volumi fusi isotropicamente. Si noti che rmddl e rmddr mostrano dinamiche di conseguenza stereotipare, ognuna delle quali si estende in modo sincrono per una lunghezza totale di 11,0 ± 0,6 μm (media ± SEM; n = 12 neurites) e incontro all'apice dorsale dell'anello nervoso (vedere anche film S1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59533/59533fig8.jpg"> Figura 8: esame delle immagini diSPIM isotropiche delle morfologie neuronali negli embrioni di C. elegans . Visualizzazione isotropica dei neuroni AVHL e AVHR (frecce gialle). Utilizzando il diSPIM, le morfologie neuronali possono essere catturate producendo immagini quadridimensionali (4D) con risoluzione spaziale isotropica di circa 330 Nm. Il diSPIM consente agli utenti di ruotare virtualmente i volumi di immagine con risoluzione identica in tutte le direzioni. Le immagini in a-D sono proiezioni di massima intensità dello stesso volume di immagini dispim fusi isotropicamente da rotazioni distinte intorno all'asse lungo dell'embrione. Barre di scala = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/59533fig8large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Film integrativo S1: C. elegans sviluppo embrionale da 280 a 434 minuti dopo la fertilizzazione. Film isotropico del ceppo DCR7692 (olaex4655) che esprime ujIs113 ubiquamente con DACR2819 neurites rmdd etichettando scarsamente (Figura 7a-d, frecce gialle). DACR2819 anche etichettare due cellule muscolari (Figura 7a-d, frecce bianche) e la cellula del canale escretore (Figura 7a-d, freccia blu) durante lo sviluppo embrionale (Figura 7a-d). Barre di scala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59533/Movie_S1.mov">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui, presentiamo un approccio combinatorio utilizzando microscopia ad alta risoluzione, strumenti computazionali, e l'etichettatura a cella singola in vivente embrioni C. elegans per comprendere le singole dinamiche delle cellule durante il neurosviluppo.

Microscopia isotropica leggera e analisi di lignaggio cellulare automatizzate al catalogo Caenorhabditis elegans embriogenesi con risoluzione subcellulare

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Questo protocollo consente di tracciare in modo efficiente le lignaggi cellulari e le identità negli embrioni vivi, analizzando contemporaneamente morfologie cellulari dettagliate come assoni e dendriti nello sviluppo di neuroni C.elegans. Rispetto alla microscopia confocale, la microscopia ad illuminazione selettiva invertibile a doppia vista o diSPIM offre un segnale più elevato al rumore, una risoluzione spaziale più isotropica ed è più adatto per l'imaging in vivo a lungo termine. Inizia aggiungendo 500 microlitri di soluzione di metilcellulosa all'1% nella depressione di uno scivolo al microscopio concavo.Utilizzando un piccone di filo di platino, trasferire gli adulti da una piastra media di crescita del nematode nella soluzione di metilcellulosa M9. Utilizzare le punte affilate di aghi ipodermici calibro 18 per tagliare ogni animale trasversalmente al corpo medio ad almeno uno o quattro embrioni cellulari. Con un bocchino aspiratore tenuto delicatamente tra i denti, precompilare una pipetta microcapillare con da 10 a 15 microlitri di tampone M9 e aspirare delicatamente diversi embrioni dallo scivolo nel capillare.Erogare gli embrioni nel rettangolo centrale del coverslip di una camera di imaging in acciaio riempita con tampone M9 fresco. Orientare delicatamente gli embrioni verticalmente in modo che l'asse lungo di ogni embrione sia perpendicolare al lungo asse del coverslip. Quindi posizionare la camera di imaging in acciaio nel supporto del campione sullo stadio di un diSPIM.Per preparare gli embrioni per l'imaging, aprire micro manager e impostare le intensità laser su 179 microwatt 0,5% di equivalenza per 488 nanometri e 79 microwatt 0,25% di equivalenza per 561 nanometri. La calibrazione tra la regolazione del software e la vera uscita laser deve essere eseguita in anticipo al fine di impostare lo spazio per microwatt specifici. Nel menu plugin, selezionare il controllo del dispositivo e il diSPIM di imaging scientifico applicato per aprire la finestra di microscopia di illuminazione selettiva invertita a doppia visualizzazione per immagini scientifiche applicate.Nella scheda acquisizione verificare che i parametri siano impostati come indicato. Nella scheda messa a fuoco automatica impostare i parametri come indicato. Si noti che il canale di messa a fuoco automatica deve specificare il canale di fluorescenza nucleare per gli esperimenti di lineatura pianificati.Selezionare le caselle del fascio e del foglio per il tracciato A o B e fare clic dal vivo per iniziare l'acquisizione dell'immagine. Si aprirà una finestra di visualizzazione dal vivo. Quindi disegnare una casella intorno all'embrione di interesse per selezionare l'area di analisi autofocus dell'embrione e fare clic sull'acquisizione iniziale per avviare l'acquisizione di immagini multidimensionali a lungo termine.Per la visualizzazione, l'elaborazione e l'analisi del lignaggio cellulare delle immagini, dopo aver scaricato ed estratto il bundle software, fare doppio clic sul file jnlp di CytoSHOW_app. per iniziare a eseguire CytoSHOW. Nel menu file selezionare micro manager monitor nuovo e diSPIM per individuare la cartella del set di dati radice in cui sono state salvate le immagini di micro manager non elaborati.Selezionare una cartella del punto di tempo e fare clic su Apri. Le finestre di navigazione multidimensionali verranno aperte automaticamente sia per SPIM A che per SPIM B.Utilizzando lo strumento di selezione poligonale, fare clic appena fuori dai bordi anteriore, posteriore, dorsale e ventrale dell'embrione di interesse per generare un motivo di papillon sull'embrione sia nelle viste SPIM A che SPIM B e fare clic su diSPIM. Allineare i canali verde e rosso per ogni braccio SPIM e fare di nuovo clic su diSPIM.I turni verranno attivati in tutte le altre finestre di posizione. Fate quindi clic su diSPIM e fuse per aprire la finestra di dialogo volumi di dati grezzi diSPIM fusibile deconvolta e impostare i parametri come indicato. Una volta impostati tutti i parametri, fare clic su sì e specificare la directory di output in cui salvare i file elaborati prima di fare clic su OK. Nella finestra di anteprima spostare la barra di scorrimento t sul punto di tempo due della finestra e spostare il dispositivo di scorrimento z fino a visualizzare la vista direttamente lungo l'asse lungo dell'embrione.Spostare la barra di scorrimento t al punto di tempo uno nella finestra di anteprima e utilizzare lo strumento di selezione della linea per disegnare una linea dal nucleo ventrale più rotondo attraverso il piano delle piastre di metafase della cella AB. Fate clic sul pulsante di anteprima diSPIM per salvare le regolazioni precise sull'orientamento del volume dell'immagine visualizzato in anteprima. Impostare le barre di scorrimento t delle finestre del monitor diSPIM sui punti di tempo iniziale e finale dell'intero intervallo di immagini da elaborare.Quindi fare clic su OK. Per un'analisi efficiente e accurata del lignaggio cellulare, è fondamentale ottenere un preciso orientamento ADL dei volumi di dati prima dell'elaborazione di Starry Night. Per aprire la serie di tracce di derivazione Notte stellata in AceTree, aprire il file AceTree personalizzato fornito e selezionare apri il file di configurazione per individuare la directory di output indicata in precedenza. Aprire la sottocartella fusibile per l'embrione di interesse e selezionare il file modificato.Quindi fare clic su apri e procedere con la visualizzazione e la modifica del lignaggio come descritto in precedenza. I protocolli ottimizzati non inducono alcuna fototossicità rilevabile agli embrioni valutata dal momento della schiusa e dai tempi relativi alle pietre miliari dello sviluppo. Usando questo protocollo come dimostrato, le cellule non identificate in questa proteina fluorescente verde transgenica che esprime il ceppo nematode sono state determinate per corrispondere ai motoneuroni, alla cellula del canale escretore e a due cellule muscolari.I neuroni identificati sono stati modellati obliquamente già 360 minuti dopo la fecondazione con l'asse cellulare più lungo che rappresenta l'asse successivo per la crescita della neurite. Da 385 a 410 minuti dopo la fecondazione, i neuriti RMDD hanno esteso circa sei micrometri anteriori dei corpi cellulari. Da 415 a 445 minuti dopo la fecondazione, entrambi i neuriti si estendevano dorsalmente all'interno e intorno all'anello nervoso presuntivo.In media, ogni neurite RMDD si estendeva a circa 11 micrometri dal corpo cellulare prima di incontrare in modo sincrono la sua controparte controparte controlaterale all'apice dell'anello. Nel loro insieme, questi dati dimostrano che le caratteristiche dello sviluppo neuronale per singole cellule identificabili possono essere esaminate, confrontate e quantificate utilizzando questo protocollo integrato. È importante ricordare di orientare gli embrioni verticalmente in modo che l'asse lungo di ogni embrione sia perpendicolare al lungo asse del coverslip.Usando questo protocollo, abbiamo iniziato a esplorare il nascente sistema nervoso embrionale da tutte le angolazioni. Ad esempio, durante la nascita cellulare, la migrazione e la differenziazione, la formazione di neurite, la crescita e la fascicolazione.

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