Name: In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Impara a identificare la connettività funzionale degli input a lungo raggio nel cervello del topo usando stimolazione optogenetica in fette cerebrali ex vivo. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche precise.

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Ringraziamo Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang e Jean Simonnet per il loro aiuto nello sviluppo di versioni precedenti del protocollo di iniezione stereotassico e Marin Manuel e Patrice Jegouzo per l'aiuto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero francese per l'istruzione e la ricerca (L. R., L. S.), Centro Nazionale di Des Etudes Spatiales (M. B.), e Agence Nationale de la Recherche Grant <span lang="FR" style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.).

<ol><li>Goodridge, J. P., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+postsubiculum+and+anterior+thalamus+in+the+generation+of+head+direction+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).</li>
<li>Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+navigation.+Disruption+of+the+head+direction+cell+network+impairs+the+parahippocampal+grid+cell+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal.</a> Science. 347 (6224), New York, N.Y. 870-874 (2015).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+decrease+of+excitability+in+rat+hippocampal+neurons+through+increases+in+I%28h%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h).</a> Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).</li>
<li>Takahashi, H., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway+Interactions+and+Synaptic+Plasticity+in+the+Dendritic+Tuft+Regions+of+CA1+Pyramidal+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons.</a> Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).</li>
<li>Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+nucleus+reuniens+and+entorhinal+cortex+projections+in+hippocampal+field+CA1+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+%26+Function%22%5BJournal%5D)">Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat.</a> Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).</li>
<li>Callaway, E. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulating+neurons+with+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stimulating neurons with light.</a> Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).</li>
<li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuBi-Glutamate%3A+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, 2(2009).</li>
<li>Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neuronal+circuits+underlying+the+interaction+between+sensory+and+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex.</a> Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).</li>
<li>Simonnet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+feedback+inhibition+may+maintain+head+direction+signals+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum.</a> Nature Communications. 8, 16032(2017).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior+Thalamic+Excitation+and+Feedforward+Inhibition+of+Presubicular+Neurons+Projecting+to+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).</li>
<li>Fricker, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyramidal+cells+of+rodent+presubiculum+express+a+tetrodotoxin-insensitive+Na%2B+current%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current.</a> The Journal of Physiology. 587, Pt 17 4249-4264 (2009).</li>
<li>Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neuroanatomy+of+rat+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cellular neuroanatomy of rat presubiculum.</a> The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).</li>
<li>Simonnet, J., Fricker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+components+and+circuitry+of+the+presubiculum+and+its+functional+role+in+the+head+direction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system.</a> Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic. New York. (2013).</li>
<li>Huang, L. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+Localization+and+Projection-Specific+Properties+of+Presubicular+Neurons+Targeting+the+Lateral+Mammillary+Nucleus%2C+Thalamus%2C+or+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex.</a> eNeuro. 4 (2), (2017).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Sulser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+Projections+from+the+Medial+Septum+Selectively+Inhibit+Interneurons+in+the+Medial+Entorhinal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).</li>
<li>Mathon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+effectiveness+of+intracerebral+injections+in+adult+and+neonatal+mice%3A+a+neurosurgical+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view.</a> Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Hass, C. A., Glickfeld, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fidelity+optical+excitation+of+cortico-cortical+projections+at+physiological+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

L'iniezione virale in vivo per esprimere le opsine sensibili alla luce in un'area del cervello definita è un metodo di scelta per l'analisi optogenetica della connettività funzionale a lungo raggio10,11,17,18. Le iniezioni stereotassiche offrono la possibilità di indirizzare con precisione una specifica area del cervello. La coespressione di un opsino con un reporter fluorescente permette comod...

La definizione della connettività tra le regioni del cervello è necessaria per comprendere i circuiti neurali. I classici metodi di tracciamento anatomico consentono di stabilire la connettività interregionale e gli studi di lesione aiutano a comprendere l'organizzazione gerarchica del flusso di informazioni. Ad esempio, i circuiti cerebrali per l'orientamento spaziale e la segnalazione della direzione della testa coinvolgono il flusso direzionale di informazioni dal talamo al presubiculum. Ciò è stato dimostrato da studi di lesioni di nuclei talamici cioco-dorsalici (ADN) che degradano il segnale di direzione della testa nel presubiculum dorsale a valle, così come il segnale della rete della griglia paraippocampale1,2.
La connettività funzionale tra le aree del cervello è più difficile da stabilire a livello cellulare e subcellulare. Nell'ippocampo, un'anatomia altamente organizzata permette di studiare le connessioni sinaptiche specifiche del percorso utilizzando la simulazione elettrica nella preparazione della fetta. Gli elettrodi di stimolazione collocati nel radiato stratificato di CA1 possono essere utilizzati specificamente per stimolare l'input collaterale di Schaffer da CA33. Stimolando gli elettrodi collocati nella molecolare di lacunoso stratificante di CA1 attiverà l'ingresso del percorso perforante a CA14,5. La stimolazione elettrica attiva il rilascio del neurotrasmettitore dai terminali assoni; tuttavia, attiva i neuroni con somata vicino al sito di stimolazione e assoni di passaggio. È quindi di uso limitato per studiare gli afferenti da regioni cerebrali definite quando le fibre di diverse regioni di origine si mescolano nella struttura bersaglio, come è tipicamente il caso nella neocorteccia.
I neuroni possono anche essere stimolati con la luce. I metodi ottici includono la fotoattivazione del glutammato in gabbia, che può essere combinato con la scansione laser a uno o due fotoni. Più siti strettamente distanziati possono essere stimolati in sequenza, senza danni meccanici al tessuto6. Questo è stato utilizzato con successo per mappare i recettori sinaptici così come attivare i singoli neuroni7. Mentre lo sblocco del glutammato può essere utilizzato per l'analisi del circuito locale, non consente l'attivazione specifica di input a lungo raggio.
Un metodo di scelta per lo studio della connettività a lungo raggio nei circuiti neuronali è l'uso dell'espressione channelrhodopsin mediata da virus. Utilizzando iniezioni stereotassiche in vivo come descritto qui, l'espressione dei canali ionici illuminati può essere mirata e limitata spazialmente a una regione del cervello desiderata. In questo modo, le channelrhodopsins sono efficaci per mappare la connettività eccitatoria o inibitoria da una regione al suo obiettivo. I terminali degli assoni transettati possono essere stimolati con la luce nella preparazione di una fetta di cervello, e le registrazioni patch-clamp come una lettura consente l'esame delle funzioni e dei punti di forza di specifici componenti del circuito nel cervello8. L'approccio optogenetico combinato con l'iniezione stereotassica di un virus offre una specificità senza precedenti e il controllo genetico9. La stimolazione con la luce consente inoltre un'elevata precisione temporale che spaziale10,11.
Il presubiculum è una struttura corticale a sei strati alla transizione dell'ippocampo e della formazione para-ippocampale12,13. Riceve un importante input sinaptico dall'ADN11 ma anche da diverse altre regioni corticali e subcorticali14. Pertanto, la stimolazione selettiva dei terminali degli assoni talamici all'interno di una fetta presubicolare non è possibile con la stimolazione elettrica né con lo sblocco del glutammato. Descritto in questo protocollo sono metodi per determinare la connettività funzionale tra le regioni del cervello (ADN e presubiculum) utilizzando precise iniezioni stereotassiche di vettori virali che esprimono canali illuminati. È stata descritta anche la fotostimolazione dei terminali degli assoni dei neuroni proiettanti nella loro regione bersaglio, insieme alle registrazioni a morsetto a tutta cellula dei neuroni post-sinaptici nella preparazione delle fette cerebrali.

<table><tbody><tr><td>Fresa da 0,5 mm</td><td>Apparato di Harvard</td><td>724962</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Siringa Hamilton</td><td>Hamilton</td><td>1701 RN - 7653-01</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS soluzione</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9624</td><td>&nbsp; testo</td></tr><tr><td>36% PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>470 nm LED&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>P1105/470/LED&nbsp; DC/59022m</td><td>utilizzare con filtro di eccitazione abbinato 470/40x e filtro di emissione per GFP.</td></tr><tr><td>AAV5. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-5-PV3446</td><td>lotto V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13&nbsp;</td></tr><tr><td>Tutti i prodotti chimici</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bath termoregolatore</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM7</td><td>Set a 34&deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ago in metallo smussato</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>calibro 33, 13 mm, stile punta 4-20 gradi;</td></tr><tr><td>Forbici grandi</td><td>Dahle Allround</td><td>50038</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td>final 1-3 mg/ml</td></tr><tr><td>Capillari borosilicati</td><td>Apparato Havard</td><td>GC150-10</td><td>1,5 mm esterno, diametro interno 0,86</td></tr><tr><td>Estrattore di elettrodi fiammeggianti</td><td>marroni Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>BupH Phosphate Buffered Saline Pack</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28372</td><td></td></tr><tr><td>ago a farfalla per perfusione</td><td>Braun&nbsp;</td><td>Venofix A</td><td>24G</td></tr><tr><td>CCD Camera</td><td>Andor&nbsp;</td><td>DL-604M</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>20X</td></tr><tr><td>pinza curva</td><td>FST&nbsp;</td><td>11011-17</td><td></td></tr><tr><td>CY5 configurazione (confocale)</td><td></td><td></td><td>Laser elio-neon 633nm (5,0 mW); Specchio: MBS 488/561/633&nbsp;</td></tr><tr><td>Configurazione CY5 (epifluo)</td>Luce fluorescente <td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>(luce intensa); Filtro di eccitazione: BP645/30; Specchio dicroico: 89100 BS ; Filtro emissione: BP705/72</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>configurazione DAPI (epifluo)</td><td>Luce fluorescente Nikon/Chroma</td><td></td><td>(Intensilight); Cubo: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Eccitazione: BP 377/50; Specchio: BS 409; Emissione: BP 447/60)</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misuratore ottico digitale portatile</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>Parametrizzato su 475 nm</td></tr><tr><td>Lame di rasoio in acciaio inox a doppia emissione</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>72000</td><td>Utilizzare metà della lama nell'affettatrice</td></tr> Dual <tr><td>Fluorescent Protein Flashlight</td><td>Nightsea</td><td>DFP-1</td><td>eccitazione, 440-460 nm; Filtro di emissione sui vetri, 500 nm passante.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4368</td><td>final 0,2 mM</td></tr><tr><td>Microscopio a epifluorescenza</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE-2000E</td><td>10 o 20X</td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Ruby 10%</td><td>Millipore</td><td>AG335</td><td>disolvi 10 mg in 100 &micro; l. di acqua distillata ; iniettare da 150 a 300 nl</td></tr><tr><td>in configurazione GFP (epifluo)</td>Luce fluorescente <td>Nikon/Chroma</td><td></td><td>(Intensilight); Cubo: Set di filtri Nikon B-2E/C FITC (Eccitazione: BP 465-495; Specchio: BS 505; Emissione: BP 515-555)</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Physitemp</td><td>HP4M</td><td></td></tr><tr><td>Heparin choay 5000 U.I./ml</td><td>Sanofi</td><td></td><td>5 ml fiala</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>finale 10 mM</td></tr><tr><td>Kit micromotore rotativo ad alta velocità</td><td>Foredom</td><td>K.1070</td><td>velocità massima di perforazione 38.000 giri/min</td></tr><tr><td><forte>Composti in soluzione interna: </forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore di impulsi isolato</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>final 1,2 mM</td></tr><tr><td>Ketamine 1000</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketofen 10%</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml : diluire 1 &micro; l in 1 ml totale (0,1%)</td></tr><tr><td>Laocaina (lidocaina)</td><td>MSD</td><td></td><td>16,22 mg/ml : diluire 1 ml in 4 ml totali (circa il 4%)</td></tr><tr><td>LED hi power spot per chirurgia</td><td>Fotonico (tramite Phymep)</td><td>10044</td><td></td></tr><tr><td>Alimentatore LED</td><td>Cairn Research</td><td>OptoLED Manipolatori di sorgenti</td><td></td>luminose</tr><tr><td></td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-7</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP 2H20</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>final 4 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>63069</td><td>final 2 mM</td></tr><tr><td>Micro termoregolatore</td><td>Physitemp</td><td>MTC-1</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere</td><td>Garofano</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na Phosphocreatine</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>final 10 mM</td></tr><tr><td>Na3-GTP 2H20</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td>final 0.4 mM</td></tr><tr><td>needle holder/emostatico</td><td>FST</td><td>13005-14</td><td></td></tr><tr><td>software di acquisizione pClamp</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 3</td><td>14-16 sul display per 2-3 ml/min&nbsp;</td></tr><tr><td>Gluconato di potassio (K-gluconato)</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>Final 135 mM</td></tr><tr><td>ProLong Gold mezzo di montaggio antisbiadimento</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36390</td><td></td></tr><tr><td>Rompun 2% (xilazina)</td><td>Forbici piccole Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio 0,9%&nbsp;</td><td>Virbac</td><td></td><td>diluire 8,5 mL in 10 ml totali</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio VISISCOPE SZT</td><td>VWR</td><td>630-1584</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico con display digitale</td><td>Kopf</td><td>Modello 940</td><td>Strumento stereotassico per piccoli animali</td></tr><tr><td>Streptavidina-Cy3 coniugato</td><td>Tecnologie di vita&nbsp;</td><td></td><td></td>434315</tr><tr><td>Coniugato di streptavidina-Cy5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Supercolla3 Loctite</td><td>Dutscher</td><td>999227</td><td>tubo da 1 g</td></tr><tr><td>Filamento di sutura Ethilon II 4-0 poliammide</td><td>Ethicon</td><td>F3210</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>kdScientific</td><td>Legato 130 - 788130</td><td>Utilizzo Modalità di infusione e prelievo</td></tr><tr><td>Affettatrice per tessuti</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td>velocità 0,07, ampiezza 1.</td></tr><tr><td>tubo</td><td>Gilson</td><td>F117942, F117946</td><td>Giallo/Nero, Viola/Nero</td></tr><tr><td></td><td>microscopio verticale Olympus</td><td>BX51W1</td><td></td></tr><tr><td>Versi-dry carta assorbente da banco</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo intracerebral stereotaxic iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

La conoscenza della connettività sinaptica specifica di tipo cellulare è un prerequisito fondamentale per comprendere i circuiti neuronali a livello di cervello. Lo studio funzionale delle connessioni a lungo raggio richiede registrazioni mirate di singoli neuroni combinati con la stimolazione specifica di input distanti identificati. Questo è spesso difficile da ottenere con tecniche di stimolazione convenzionali ed elettriche, perché gli assoni provenienti da aree cerebrali a monte convergenti possono mescolarsi nella regione bersaglio. Il targeting stereotassico di una regione cerebrale specifica per l'espressione mediata da virus dei canali ionici sensibili alla luce consente una stimolazione selettiva degli assoni provenienti da quella regione con la luce. Le iniezioni stereotassiche intracerebrali possono essere utilizzate in strutture ben delimitate, come i nuclei talamici anteriori, oltre ad altre aree subcorticali o corticali in tutto il cervello.
Descritto qui è un insieme di tecniche per l'iniezione stereotassica precisa di vettori virali che esprimono channelrhodopsin nel cervello del topo, seguita da fotostimolazione dei terminali assoni nella preparazione della fetta del cervello. Questi protocolli sono semplici e ampiamente applicabili. In combinazione con la registrazione di morsetto di cervo a tutta cellula da un neurone postsynaptaptically collegato, la fotostimolazione degli assoni consente il rilevamento di connessioni sinaptiche funzionali, la caratterizzazione farmacologica e la valutazione della loro forza. Inoltre, il riempimento della biocitina del neurone registrato può essere utilizzato per l'identificazione morfologica post-hoc del neurone post-sinaptico.

La procedura qui presentata è stata utilizzata per esprimere una channelrhodopsin (Chronos) blu sensibile alla luce fusa alla GFP nel nucleo antero-dorsale del talamo (ADN), mediante iniezione stereotassica di virus anterogrado adeno-associato. Le coordinate stereotassiche sono state determinate secondo un atlante cerebrale del topo e testate iniettando 200 nL di fluoro-ruby fluorescente. L'animale è stato sacrificato 10 min dopo l'iniezione, e il cervello è stato estratto e fissato durante la notte. Le sezioni cerebrali...

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Knowledge of cell-type specific synaptic connectivity is a crucial prerequisite for understanding brain-wide neuronal circuits. The functional ...

Lo scopo di questo metodo è identificare la connettività funzionale degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando la fotostimolazione nelle fette cerebrali. Il targeting stereotassico di una specifica regione cerebrale per varie espressioni mediate di canali ionici sensibili alla luce consente la stimolazione selettiva di assoni provenienti da quella regione con la luce. A dimostrare la procedura sarà Louis Richevaux, un dottorando del mio gruppo.Prima dell'intervento chirurgico, verificare che l'animale sia ben anestetizzato con un dito del piedi. Estrarre delicatamente la lingua per facilitare la respirazione. Quindi, radersi i capelli cranici.Iniettare 20 microlitri di cloridrato di lidocaina sotto la pelle della testa per l'anestesia locale e attendere cinque minuti. Per esporre il cranio, fai un taglio sul cuoio capelluto. Quindi, posizionare l'animale in una cornice stereotassica.Inserire le barre dell'orecchio e appoggiarle sulle ossa leggermente rostrali alle orecchie e tirare giù la pelle per creare un buon accesso al cranio. Stringere le barre dell'orecchio e installare il nasello. Mantenere il corpo dell'animale orizzontalmente e a livel

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Il video dimostra un protocollo per studiare le interazioni sinaptiche e le risposte neuronali in una fetta di cervello ippocampale di topo trasfettata. Consiste nell'illuminare i neuroni sensoriali a lungo raggio per innescare i potenziali d'azione e nel registrare i potenziali eccitatori post-sinaptici risultanti nel neurone registrato utilizzando la tecnica del patch-clamp a cellula intera.

Fotostimolazione e registrazioni di patch clamp a cellule intere di neuroni in fette di ippocampo di topo

Questo video dimostra l'inibizione mediata da microRNA delle correnti sinaptiche eccitatorie in fette di cervello ippocampale di topo. I neuroni CA3 sono stati infettati con un vettore virale ricombinante che ospita un costrutto per esprimere un reporter fluorescente, un canale di membrana attivato dalla luce e un microRNA che riduce l'espressione dei canali del calcio voltaggio-dipendenti. Dopo aver posizionato una fetta in una camera di registrazione e aver patchato un neurone CA1 con una...

Inibizione mediata da microRNA delle correnti postsinaptiche eccitatorie nelle fette di ippocampo di topo

Questo video dimostra la procedura per studiare l'efficienza sinaptica nella corteccia entorinale laterale (LEC) stimolando optogeneticamente gli assoni della corteccia prefrontale mediale (mPFC) e registrando le risposte dei neuroni piramidali nella LEC. Questo metodo combina le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica.

Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica di eventi sinaptici in fette di cervello di ratto

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i...

Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

Le fette di cervello ex vivo possono essere utilizzate per studiare gli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate agli input afferenti. L'optogenetica è impiegata per attivare indipendentemente afferenze talamocorticali e corticocorticali alla neocorteccia non primaria, e le risposte sinaptiche e di rete sono modulate con isoflurano.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l'esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Qui, presentiamo il metodo di fabbricazione di un sistema optrode con fibre ottiche per l'erogazione della luce e un array di elettrodi per la registrazione neurale. Esperimenti in vivo con topi transgenici che esprimono channelrhodopsin-2 mostrano la fattibilità del sistema per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica.

Optrode Array per la modulazione optogenetica simultanea e la registrazione neurale elettrica

Questo protocollo fornisce un metodo integrato che include la somministrazione virale, l'impianto di optrodi, l'induzione fototrombotica, la registrazione simultanea dell'attività degli astrociti e dei neuroni, e la stimolazione optogenetica degli astrociti. Questo metodo integrato mira a fornire un'indagine parallela della relazione astrocito-neurone nelle fasi acute a croniche dell'ictus ischemico.

Un metodo integrato per la modellazione fototrombotica dell'ictus e la registrazione in vivo dell'attività neuronale e astrocita in topi in comportamento

Impara a identificare la connettività funzionale degli input a lungo raggio nel cervello del topo usando stimolazione optogenetica in fette cerebrali ex vivo. Questo metodo consente registrazioni elettrofisiologiche precise.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo (Video) | JoVE Journal

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

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