Metodi per testare la disgregazione endocrina nella Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster è un modello potente per valutare in vivo i potenziali effetti tossici ed endocrini delle sostanze chimiche, come gli interferenti endocrini, che rappresentano un grave problema per la salute umana e gli ambienti naturali. Affrontare l'effetto degli EDC sui tratti ormonali della vita della mosca, come la fecondità, la fertilità, il tempo di sviluppo e la durata della vita. È un modo semplice, economico e veloce per indagare sull'alterazione endocrina in vivo.

La fertilità, lo sviluppo e la durata della vita in Drosophila possono essere influenzati da diversi fattori che devono essere attentamente controllati per garantire il risultato positivo di questo protocollo. Pertanto, è richiesta la massima attenzione nell'allevamento e nella movimentazione delle mosche. Per saggiare il gusto dell'EDC selezionato, dopo l'anestesia, trasferire 15 giovani mosche dal letto di mosca a quattro fiale parallele contenenti mezzo farina di mais mescolato con una colorazione alimentare.

La fiala di controllo contiene il solo solvente e le altre tre fiale sono integrate con diverse dosi degli EDC selezionati. Conservare le fiale in un'incubatrice umidificata per un giorno con una luce naturale di 12 ore. Dopo aver anestetizzato di nuovo le mosche, trasferisci le mosche immobilizzate su un foglio bianco e posizionalo sotto un microscopio stereo da osservare.

Confrontare la colorazione addominale di ogni gruppo di trattamento rispetto al gruppo di controllo. Per saggiare le prestazioni riproduttive delle mosche, preparare tre fiale di mosche per ogni EDC come fiale parentali, con otto femmine e quattro maschi in 10 millilitri di mezzo farina di mais integrati con EE2. Per il controllo, preparare sei fiale di mosche, ognuna con otto femmine e quattro maschi in 10 millilitri di cibo medio farina di mais integrato con solvente EE2.

La parte posteriore vola in un'incubatrice a 25 gradi Celsius. Durante il loro sviluppo, evitare il sovraffollamento delle larve. Dopo quattro giorni, inverti ogni flaconcino su un etere per rimuovere i genitori e restituire le fiale all'incubatrice per altri cinque giorni.

Nel tardo pomeriggio del nove giorno, inverti ogni fiala su un etherizer per rimuovere tutte le mosche appena emerse dalle fiale e metti le fiale in un altro incubatore a 18 gradi Celsius durante la notte. La mattina del giorno 10, su una stazione di lavoro di anidride carbonica Drosophila, invertire attentamente la fiala di coltura per evitare che le mosche anestetizzate cadano su medie e inserire un tubo di gomma con un ago nel flaconcino tra il tappo di cotone e la parete del flaconcino. Aprire la valvola per fornire anidride carbonica.

In pochi secondi, trasferisci le mosche su un letto a mosca al microscopio. Raccogli separatamente femmine vergini e giovani maschi in due gruppi sul letto di mosca. Suddividere casualmente ogni gruppo di mosche in piccoli sottogruppi, con 10 femmine o 20 maschi per fiala riempiti con mezzo di farina di mais corrispondente fresco.

Continua l'incubazione e raccogli 30 femmine vergini e 30 maschi per ogni EDC, e 90 femmine vergini e 90 maschi per il controllo. Ospita questi gruppi di mosche a 25 gradi Celsius fino a quando non hanno un'età di quattro giorni dopo l'esclusione. Quindi trasferirli in nuove fiale contenenti mezzo fresco corrispondente ogni due giorni.

Controlla che non ci siano larve nelle fiale delle femmine. Quindi etichettare fiale con una diversa serie di numeri sequenziali per il seguente trattamento. Dopo l'anestesia, trasferire una femmina trattata con solvente EE2 in una piccola fiala contenente mezzo di pomodoro fresco di farina di mais senza EE2 e aggiungere un maschio trattato con solvente EE2 per il controllo.

Abbina un maschio trattato con EE2 a una femmina trattata con solvente EE2 o una femmina trattata con EE2 con un maschio trattato con solvente EE2 per ogni trattamento. Casa 20 croci singole a 25 gradi Celsius. Trasferire ogni coppia di accoppiamento su fiale medie di pomodoro di farina di mais fresco senza EDC ogni giorno per i successivi 10 giorni.

Ispezionare visivamente ogni fiala ogni giorno per le uova e segnalare il loro numero sul foglio di calcolo della fertilità. In ogni fiala, controlla attentamente le mosche appena emerse e registra il numero giornaliero di progenie adulte nel periodo di 10 giorni. Dopo 10 giorni dall'accoppiamento iniziale, rimuovere i genitori dall'ultima serie di fiale.

Nei protocolli di dosaggio dell'eclosion, in primo luogo, per ogni gruppo di trattamento, impostare 10 fiale di mosche giovani e sane di meno di due giorni, ognuna con sei femmine e tre maschi in 10 millilitri di cibo di farina di mais senza EDC. Alleva le mosche sul cibo per 24 ore e consenti loro di accoppiarsi. Quindi preparare altri 10 flaconcini paralleli per gruppo di trattamento con 10 millilitri ciascuno di alimenti freschi di farina di mais integrati con diverse concentrazioni di EDC o il solo solvente EE2 per il controllo.

Trasferisci le mosche accoppiate a queste nuove fiale. Creare un foglio di calcolo di sviluppo per registrare le diverse serie. Consentire alle mosche di deporre le uova per 16 ore.

Quindi, rimuovere i genitori dalle fiale. Incubare le fiale a 25 gradi Celsius per tre o quattro giorni o fino a quando le larve errante sono visibili. Ogni giorno, conta il numero di nuove pupe in ogni fiala scrivendo un numero in sequenza da ogni pupa all'esterno della fiala per evitare di contare la stessa pupa due volte.

Segnala il numero di pupe appena emerse per tre o quattro giorni, o fino a quando non si formano più pupe. A partire dal nonno giorno, conta il numero di adulti emergenti ogni giorno, fino a quando non emergono più adulti. Segnalalo sul foglio di calcolo dello sviluppo ed esegui il resto del saggio di eclosion secondo il manoscritto.

Nel protocollo lifespan, prima impostare 20 fiale con otto femmine e quattro maschi, ognuno riempito con 10 millilitri di cibo farina di mais e ospitarli a 25 gradi Celsius. Dopo quattro giorni, scartare le mosche e riposizionare le fiale nell'incubatrice. Nel tardo pomeriggio della nona giornata, rimuovere tutte le mosche appena emerse dalle fiale e riportare le fiale all'incubatrice.

Dopo 16-24 ore, dividi le mosche adulte di un giorno di entrambi i sessi in quattro gruppi sotto l'anestesia leggera di anidride carbonica e trasferiscile in bottiglie da 250 millilitri contenenti cibo medio adulto, tre integrate con diverse concentrazioni di EDC e una con il solo solvente EE2. Mantenere le mosche a 25 gradi Celsius per due o tre giorni per consentire loro di accoppiarsi. Quindi, ordina ogni coorte di mosche per sesso in due gruppi.

All'interno di ogni condizione di trattamento, per entrambi i sessi, suddividere casualmente ogni gruppo in cinque flaconcini paralleli ad una densità di 20 individui per flaconcino. Preparare un foglio di calcolo della durata della vita in cui il numero di mosche morte viene sottratto dal numero di mosche sopravvissute dal trasferimento precedente, in modo che il numero di sopravvissuti ad ogni trasferimento sia automaticamente ottenuto. Dopo tre giorni, trasferisci le mosche senza anestesia in nuove fiale contenenti il cibo corrispondente allo stesso tempo e controlla la morte.

Registra l'età delle mosche e il numero di mosche morte. Ripeti il trasferimento ogni tre giorni fino a quando tutte le mosche muoiono. In questo esperimento, le curve di durata della vita sono state tracciate come la survivorship cumulativa rispetto ai giorni trascorsi per ogni concentrazione EDC e il controllo.

Per il controllo, dopo un lungo periodo iniziale in cui la curva di superstiti è rimasta relativamente alta, è diminuita esponenzialmente dopo circa 60 giorni. A seguito dell'esposizione all'EDC, la curva di sopravvissutità delle mosche trattate è stata influenzata in modo significativo e ha mostrato un drastico declino dopo 36 giorni. Si consiglia di notare che le fiale parallele in fase di analisi dovrebbero essere molto simili, altrimenti sarà difficile capire quale scartare.

Pertanto, suggeriamo di prestare molta attenzione, adottando una buona pratica sperimentale, utilizzando una grande dimensione del campione. Seguendo questi protocolli, è anche possibile valutare l'impatto transgenerazionale di un interferente endocrino selezionato e testare i potenziali effetti additivi di una combinazione di diversi interferenti endocrini.