Un modello di topo a carenza di estrogeni in vivo per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa
13 agosto 2019
Clinicamente, carenza di estrogeni nelle donne in menopausa può aggravare l'incidenza di perturbazione dei lipidi e aterosclerosi. Abbiamo stabilito un modello di carenza di estrogeni in vivo mediante ovariectomia bilaterale attraverso una doppia incisione dorsale-laterale nei topi apoe-/-. Il modello murino è applicabile per lo screening dei trattamenti estrogeni esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa.
Mancano modelli di laboratorio che coinvolgono topi carenti di estrogeni che presentano un'arteriosclerosi pons dati. Questa procedura è particolarmente utile per lo screening dei trattamenti estrogenici esogeni della disfunzione cardiovascolare dopo la menopausa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'ovariectomia senza doppia incisione dorsolaterale è un metodo più facile e meno dispendioso in termini di tempo che evita una grave adesione e infiammazione della cavità addominale.
A dimostrare la procedura sarà Yue-Zhang Yin, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per eseguire un'ovariectomia bilaterale nei topi knockout APOE, prima confermare una mancanza di risposta al riflesso del pedale e posizionare l'animale nella posizione prona su una pastiglia riscaldante. Applicare un unguento agli occhi dell'animale e coprire l'animale con un drappo chirurgico.
Fare un'incisione di un centimetro laterale alla linea mediana e un centimetro laterale alle costole e utilizzare le forcelle per sezionare senza mezzi termini il tessuto sottocutaneo. Usando occhiali sezionanti, identificare il tessuto adiposo bianco nella cavità addominale. Utilizzando micro forbici e micro forcep, fare un'incisione da 0,5 a un centimetro attraverso la fascia, fino a raggiungere la cavità addominale, e utilizzare i micro forcep per ritrarre delicatamente il tessuto adiposo bianco.
Un'ovaia rosa a forma di gelso, avvolta nel tessuto adiposo, deve essere osservata all'interno della cavità addominale. Utilizzare una sutura monofilamento per ligare il vaso prossimale da 0,5 a un centimetro e il corno uterino e utilizzare le micro forbici per raccogliere l'ovaio. Riportare il tessuto rimanente nella cavità addominale e utilizzare singole suture monofilamento per chiudere separatamente gli strati muscolari e cutanei.
Quindi raccogliere l'ovaio sul lato contralaterale dell'animale, come appena dimostrato, e lasciare che il mouse si riprenda su una pastiglia riscaldante con monitoraggio, fino alla piena reclinabile. Una volta alla settimana, dalla settimana precedente alle 12 settimane dopo l'intervento chirurgico, misurare il peso corporeo di ogni animale fittizio e sperimentale su un equilibrio. Per la misurazione del colesterolo totale al plasma e del trigliceridi, alla settimana 12, preparare l'area ventrale del torace con il 70% di etanolo e inserire un ago calibro 25 nel ventricolo destro.
Aspirare lentamente, fino a quando un millilitro di sangue fluisce nella siringa, e erogare il campione in un tubo di raccolta da 1,5 millilitri contenente dieci microlitri di EDTA molare 0,5. Invertire il tubo più volte accuratamente per mescolare l'EDTA nel sangue e posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio. Entro 30 minuti dalla raccolta, centrifugare il campione per 20 minuti a 400 volte G e quattro gradi Celsius.
Raccogliere con cura il supernatante al plasma per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Per isolare l'aorta, alla settimana 12, attaccare un ago calibro 25 a una siringa da 50 millilitri riempita con PBS e inserire l'ago nel ventricolo sinistro dell'animale sperimentale. Tagliare l'atrio destro per evitare l'alta pressione dalla perfusione e perfondere il tessuto cardiaco a una velocità di flusso da 05 a 08 millilitri di PBS al minuto.
Assorbire il liquido perfusione con tessuti da laboratorio e utilizzare forbici e forcelle per rimuovere costole e polmoni. Aprire la cavità addominale per rimuovere gli organi interni, per una migliore visione dell'aorta. Afferrare il cuore con micro forcep per consentire la separazione dell'aorta dorsalmente, dalla colonna vertebrale, fino alla biforcazione iliaca.
Quindi fissare il cuore e l'aorta per 48 ore in paraformaldeide al 4%, prima di conservare il campione di tessuto in salina a temperatura ambiente o a due o otto gradi Celsius per alcune ore. Dopo dodici settimane di dieta ad alto colesterolo, i topi ovariectomizzati dimostrano un notevole aumento del colesterolo totale nel plasma e delle concentrazioni di trigliceridi. I topi ovariectomizzati, somministrati per via orale con estradiolo 17-beta, o PPD tramite diffusione di nocciole, presentano concentrazioni di colesterolo totale nel plasma significativamente inferiori rispetto ai topi a comando fittizio.
I livelli di trigliceridi plasmatiche diminuiscono nei topi ovariectomeizzati, somministrati per via orale con estradiolo 17-beta, ma non con PPD. Mentre si osserva una tendenza verso un aumento del peso corporeo nei topi ovariectomizzati, rispetto ai topi a farsa, nel complesso non si osservano cambiamenti significativi nel peso corporeo, tra i quattro gruppi di animali. La placca massima dell'aorta ascendente è aumentata nei topi ovariectomizzati, rispetto a tutti gli altri gruppi, insieme a una diminuzione complessiva della funzione cardiaca, osservata in questi animali.
Inoltre, la percentuale media di area di lesione aortica, rispetto all'intera area aortica, è significativamente aumentata nei topi ovariectomatici. Come previsto, la presenza di queste lesioni è diminuita con il trattamento con estradiolo 17-beta o PPD. Il rischio principale per l'operazione di ovariectomia è la legazione ureterale, che si traduce in un'alta mortalità.
Ricorda anche di tagliare profondamente vicino ai rami dell'arteria renale, per evitare danni aortici.
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Panoramica
Questo studio stabilisce un modello di carenza di estrogeni in vivo mediante ovariectomia bilaterale in topi apoE -/- per indagare la disfunzione cardiovascolare post-menopausa. Il modello è particolarmente utile per lo screening di trattamenti con estrogeni esogeni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Salute cardiovascolare
- Endocrinologia
Sfondo
- La carenza di estrogeni può peggiorare il disordine lipidico e l'aterosclerosi nelle donne in menopausa.
- I modelli di laboratorio esistenti per lo studio della carenza di estrogeni e dell'arteriosclerosi sono limitati.
- L'ovariectomia è un metodo comune per indurre la carenza di estrogeni nei modelli animali.
- Questo studio mira a perfezionare la tecnica di ovariectomia per ridurre al minimo le complicazioni.
Scopo dello studio
- Creare un modello affidabile per lo studio della disfunzione cardiovascolare causata dalla carenza di estrogeni.
- Valutare l'efficacia dei trattamenti con estrogeni esogeni.
- Migliorare le tecniche chirurgiche per indurre la carenza di estrogeni nei topi.
Metodi Utilizzati
- Ovariectomia bilaterale eseguita su topi apoE -/-.
- Tecnica di incisione doppia dorso-laterale utilizzata per minimizzare le complicazioni.
- Valutazione della risposta dei topi al riflesso plantare per confermare l'anestesia.
- Applicazione di un unguento protettivo sugli occhi durante l'intervento chirurgico.
Risultati principali
- La tecnica di ovariectomia è stata eseguita con successo con complicazioni minime.
- Il modello ha dimostrato un potenziale per lo screening dei trattamenti a base di estrogeni.
- Metodi chirurgici migliorati hanno ridotto il rischio di adesioni addominali e infiammazioni.
- I risultati sostengono ulteriori ricerche sulle disfunzioni cardiovascolari post-menopausa.
Conclusioni
- Il modello consolidato è efficace per lo studio della carenza di estrogeni.
- Tecniche chirurgiche perfezionate migliorano l'affidabilità dei risultati.
- Questa ricerca contribuisce alla comprensione della salute cardiovascolare nelle donne in menopausa.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La carenza di estrogeni nelle donne in postmenopausa peggiora il rischio cardiovascolare attraverso la disregolazione lipidica e il progresso dell'aterosclerosi. Modelli in vivo affidabili sono essenziali per ridurre i rischi delle terapie estrogeniche esogene prima della traduzione clinica. Questo modello murino di ovariectomia apoE-/- consente lo screening meccanicistico di fitoestrogeni e analoghi dell'estradiolo per la protezione cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Verifica l'ipotesi terapeutica della protezione cardiovascolare mediata dagli estrogeni in contesti predisposti all'aterosclerosi.
- Valore operativo: Fornisce una validazione funzionale di bersagli estrogenici esogeni mediante somministrazione per os in un sistema rilevante per la malattia.
- Valore predittivo: Supporta l'identificazione di composti promettenti confrontando l'efficacia dei fitoestrogeni con i parametri di riferimento del 17β-estradiolo.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi su lipidi plasmatici e lesioni aortiche per la selezione di composti.
- Valore operativo: Consente un'amministrazione perorale standardizzata e riproducibile mediante crema di nocciole, compatibile con schermate ad alto rendimento.
- Prontezza del saggio: Fornisce parametri misurabili, tra cui colesterolo totale, trigliceridi e area della lesione aortica, per la successiva validazione dei composti attivi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella il rischio cardiovascolare post-menopausa in topi apoE-/- che mostrano una progressione aterosclerotica simile a quella umana.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica dimostrando l'efficacia anti-aterosclerotica del PPD paragonabile a quella dell'estradiolo.
- Riduzione del rischio: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella selezione delle terapie a base di estrogeni mediante il monitoraggio longitudinale dei lipidi e delle funzioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo modello si inserisce nel percorso di scoperta e preclinica, sostenendo la verifica delle ipotesi nella fase iniziale della scoperta, lo sviluppo di saggi per campagne di screening e la validazione traslazionale di endpoint cardiovascolari prima dell'ottimizzazione del composto capostipite.
- Biologia della scoperta: Verifica ipotesi meccanicistiche relative alla carenza di estrogeni sul metabolismo lipidico e sulla patologia vascolare.
- Screening: Fornisce output quantitativi standardizzati per la valutazione di composti estrogenici esogeni.
- Analisi: Offre profili lipidici plasmatici e metriche funzionali derivate dall'ecocardiografia per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Si allinea alla continuità preclinica dimostrando effetti cardioprotettivi in modelli predisposti all'aterosclerosi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica e di somministrazione riutilizzabile per programmi di screening in endocrinologia cardiovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile della validazione del bersaglio grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nei percorsi di segnalazione degli estrogeni.
- Valore operativo: Una tecnica chirurgica standardizzata e un’erogazione non invasiva per via orale migliorano la riproducibilità e la scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione del progetto riducendo il rischio di fallimento biologico in fase avanzata della terapia ormonale cardiovascolare.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sul rischio dei candidati fitoestrogeni dotati di profilo sia anti-tumorale sia cardioprotettivo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nelle tecniche di microchirurgia e nel monitoraggio dell'anestesia in modelli murini.
- È dipendente da strumentazione di precisione, inclusi microbisturi, pinzette e occhiali per dissezione.
- Necessita di standardizzazione intersquadra delle procedure di somministrazione per via orale tramite crema di nocciole e di analisi dei lipidi plasmatici.
- Le considerazioni relative all'adattamento includono l'idoneità del modello per altre vie di risposta agli estrogeni oltre agli esiti cardiovascolari.
- I limiti pratici comprendono il rischio di mortalità chirurgica a causa della legatura dell'uretere, qualora non venga rispettata la vicinanza all'arteria renale.
