Name: Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dellincorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Scopri l'isolamento delle lipoproteine dal tuorlo d'uovo per studiare l'incorporazione di acidi grassi in membrane batteriche di Staphylococcus aureus. Questo metodo lipidomico offre profili dettagliati per la ricerca microbiologica.

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Ringraziamo i membri del laboratorio Hammer per la loro valutazione critica del manoscritto e il sostegno di questo lavoro. Il Dr. Alex Horswill della University of Colorado School of Medicine gentilmente fornito AH1263. Il laboratorio Dr. Chris Waters della Michigan State University ha fornito reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 16SDG30170026 dell'American Heart Association e dai fondi di start-up forniti dalla Michigan State University.

Gli autori non hanno divulgazioni.

S. aureus incorpora acidi grassi esogeni nei suoi fosfolipidi di membrana27,32,43. La sintesi fosforalipidea utilizzando acidi grassi esogeni bypassa l'inibizione fasiLi ma altera anche le proprietà biofisiche della membrana27,32,44. Mentre l'incorporazione di acidi grassi esogeni nei fosfolipidi di patogeni Gram-positivi è ben...

S. aureus resistente alla meticolina (MRSA) è la causa principale dell'infezione associata all'assistenza sanitaria e la resistenza agli antibiotici associata è una sfida clinica considerevole1,2,3. Pertanto, lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche è una priorità assoluta. Una promettente strategia di trattamento per gli agenti patogeni Gram-positivi sta inibendo la sintesi degli acidi grassi, un requisito per la produzione di fosforidi di membrana che, in S. aureus, include fosfatidylglycerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina4. Nei batteri, la produzione di acidi grassi avviene attraverso la via di sintesi degli acidi grassi II (FASII)5, che è notevolmente diversa dalla controparte eucatriste, rendendoI un obiettivo attraente per lo sviluppo antibiotico5,6 . Gli inibitori del FASII si rivolgono principalmente a FabI, un enzima necessario per l'allungamento della catena del carbonio dell'acido grasso7. L'inibitore FabI triclosan è ampiamente utilizzato nei beni di consumo e medici8,9. Ulteriori inibitori FabI sono in fase di sviluppo da diverse aziende farmaceutiche per il trattamento di S. aureus infezione10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. Tuttavia, molti patogeni Gram-positivi, tra cui S. aureus, sono in grado di raccogliere acidi grassi esogeni per la sintesi fosforolipidi, bypassando l'inibizione del FASII27,28,29. Così, il potenziale clinico degli inibitori del FASII è discusso a causa di notevoli lacune nella nostra conoscenza delle fonti di acidi grassi ospiti e dei meccanismi con cui gli agenti patogeni estraggono gli acidi grassi dall'ospite27,28. Per colmare queste lacune, abbiamo sviluppato un metodo di analisi lipidomica imparziale per monitorare l'incorporazione di acido grasso esogeno dalle particelle di lipoproteina in fosfolipidi della membrana di S. aureus.
Durante la sepsi, le particelle di lipoproteina ospite rappresentano una potenziale fonte di acidi grassi derivati dall'ospite all'interno della vascolatura, poiché la maggior parte degli acidi grassi ospiti sono associati alle particelle30. Le lipoproteine sono costituite da un guscio idrofilo composto da fosfolipidi e proteine che racchiudono un nucleo idrofobico di trigliceridi e esteri di colesterolo31. Quattro classi principali di lipoproteine - chylomicron, lipoproteina a bassissima densità, lipoproteina ad alta densità e lipoproteina a bassa densità (LDL) - sono prodotte dall'ospite e funzionano come veicoli di trasporto lipidico, fornendo acidi grassi e colesterolo da e verso cellule ospiti attraverso la vascolatura. I LDL sono abbondanti in acidi grassi esterificati tra cui trigliceridi e tende di colesterolo31 . Abbiamo già dimostrato che gli LDL umani altamente purificati sono una fonte vitale di acidi grassi esogeni per la sintesi di PG, fornendo così un meccanismo per il bypass dell'inibitore di FASII32. Purificanti LDL umani può essere tecnicamente impegnativo e richiede molto tempo, mentre le fonti commerciali di LDL umani purificati sono proibitivi da utilizzare su base di routine o per eseguire schermi batterici su larga scala. Per affrontare queste limitazioni, abbiamo modificato una procedura per l'arricchimento dei LDL dal tuorlo d'uovo di gallina, una ricca fonte di particelle di lipoproteina33. Abbiamo utilizzato con successo spettrometria di massa ad alta risoluzione, ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem per monitorare l'incorporazione di acidi grassi derivati da LDL umani nella membrana di S. aureus32. A differenza dei metodi precedentemente riportati, questo approccio può quantificare i singoli isomeri di acidi grassi per ciascuno dei tre principali tipi di fosfolipidi stafilocchidi. L'acido oleico (18:1) è un acido grasso insaturi presente all'interno di tutte le particelle di lipoproteina ospite che è prontamente incorporato nei fosfolipidi S. aureus 29,30,32. S. aureus non è in grado di sintesi di acido oleico29; pertanto, la quantità di acido oleico incorporato al fosfolipidi desta la presenza di acidi grassi di origine lipoproteina ospite all'interno della membrana stafilocca29. Queste specie di fosfolipidi possono essere identificate con il metodo di spettrometria di massa all'avanguardia descritto qui, offrendo una risoluzione senza precedenti della composizione della membrana di S. aureus coltivata in presenza di una fonte di acido grasso che probabilmente durante l'infezione.

<table><tbody><tr><td>Solfato di ammonio</td><td>Fisher</td><td>BP212R-1</td><td>&ge; Incubatore per colture cellulari puro al 99,5%</td></tr><tr><td></td><td>Thermo</td><td>MaxQ 6000</td><td></td></tr><tr><td>Centrafuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td>Sorvall Legen XTR, rotore F14-6x250 LE</td></tr><tr><td>Piastra per test Costar</td><td>Corning</td><td>3788</td><td>96 pozzetti</td></tr><tr>Carta<td>da filtro</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>597</td><td></td></tr><tr><td>Uovo di gallina grande</td><td>N/A</td><td>N/A Spettrofotometro</td> per micropiastre acquistato <td>da un negozio comune</td></tr><tr><td></td><td>BioTek</td><td>Epoca 2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus ceppo AH1263</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fornito da Alex Horswill dell'Università del Colorado</td></tr><tr><td>Tubo per dialisi</td><td>Pierce</td><td>68700</td><td>7.000 MWCO</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becton, Dickison and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>perline di ossido di zirconio da 0,5 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo (grado LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A4561</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio (grado reagente)</td><td>Fisher</td><td>MCX10559</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A4611</td><td></td></tr><tr><td>Dimiristoilfosfatidilcolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850345C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>&ge; </td></tr><tr><td>Formiato di ammonio</td> puro al 99,5% <td>Sigma</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Software Xcalibur</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-30801</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Spettrometro di massa</td><td>Velos Thermo Scientific</td><td>ad alta risoluzione/massa accurata MS</td>Agilent <td></td></tr><tr><td>1260 capillare HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Concentratori sottovuoto</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Lo stafilococco aureus e altri patogeni positivi al Gram incorporano acidi grassi dall'ambiente nei fosfolipidi della membrana. Durante l'infezione, la maggior parte degli acidi grassi esogeni sono presenti all'interno delle particelle di lipoproteina dell'ospite. Permangono incertezze per quanto riguarda i serbatoi di acidi grassi ospiti e i meccanismi con cui i batteri estraggono gli acidi grassi dalle particelle di lipoproteina. In questo lavoro, descriviamo protocolli per l'arricchimento di particelle di lipoproteina a bassa densità (LDL) dal tuorlo d'uovo di gallina e determinando se i LDL fungono da serbatoi di acido grasso per S. aureus. Questo metodo sfrutta l'analisi lipidomica imparziale e gli LDL di pollo, un modello efficace ed economico per l'esplorazione delle interazioni tra LL e batteri. L'analisi dell'integrazione di S. aureus degli acidi grassi esogeni da LDL viene eseguita utilizzando spettrometria di massa ad alta risoluzione/accurata e spettrometria di massa tandem, consentendo la caratterizzazione della composizione dell'acido grasso del batterio identificazione imparziale e di nuove combinazioni di acidi grassi che sorgono nei lipidi della membrana batterica dopo l'esposizione a l'LDL. Queste tecniche avanzate di spettrometria di massa offrono una prospettiva senza precedenti di incorporazione di acidi grassi rivelando gli acidi grassi esogeni specifici incorporati nei fosforidi. I metodi qui descritti sono adattabili allo studio di altri patogeni batterici e fonti alternative di acidi grassi complessi.

Il protocollo per l'arricchimento di LDL dal tuorlo d'uovo di gallina è illustrato nella figura 1. Questo processo inizia diluindo il tuorlo d'uovo intero con la salina e separando i solidi del tuorlo d'uovo indicati come granuli dalla frazione solubile o plasma contenente i LDL (Figura 1)33. Il contenuto di LDL della frazione plasmatica è ulteriormente arricchito dalla precipitazione del kDa 30-40 dollari...

Questo metodo fornisce un quadro per studiare l'incorporazione di acidi grassi esogeni da sorgenti ospiti complesse in membrane batteriche, in particolare Staphylococcus aureus. Per raggiungere questo obiettivo, vengono descritti i protocolli per l'arricchimento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uova di gallina e la successiva profilazione dell'acido grasso di fosfatidi batterici che utilizzano la spettrometria di massa.

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Questo protocollo fornisce un quadro per lo studio dell'incorporazione di acidi grassi esogeni da fonti ospiti complesse nelle membrane batteriche, in particolare lo stafilococco aureo. Il protocollo utilizza l'analisi lipidomica imparziale e le particelle di lipoproteina isolate dai tuorli d'uovo di gallina come fonte economica di acidi grassi complessi per quantificare l'incorporazione di acidi grassi nei lipidi batterici. Le tecniche di spettrometria di massa descritte qui offrono una prospettiva impareggiabile del profilo degli acidi grassi dei lipidi stafilococco aureo, ma possono essere adattate per studiare altre membrane batteriche.Quando si esegue questo protocollo, si deve fare attenzione che ogni fase di frazionamento identifichi e mantenga la frazione contenente LDL. La rimozione del solfato di ammoniaca dalla frazione plasmatica è fondamentale per le applicazioni a valle degli LDL. Fornire ampio spazio nei tubi e cambiare l'acqua in base alle esigenze per consentire un'efficace dialisi.Per iniziare, lavare due tuorli d'uovo due volte con 30 millilitri di soluzione salina tamponata di fosfato sterile per rimuovere l'albumina residua. Forare la membrana vitellina con una

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Fonte: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Arricchimento di lipoproteine batteriche e preparazione di lipopeptidi N-terminali per la determinazione strutturale mediante spettrometria di massa. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'arricchimento delle lipoproteine batteriche utilizzando un detergente non ionico che subisce la separazione di fase al riscaldamento. Attraverso sbalzi di temperatura sequenziali e fasi di centrifugazione, le lipoproteine vengono selettivamente suddivise nella fase...

Arricchimento di lipoproteine batteriche mediante separazione di fase con detergente non ionico

Isolamento e caratterizzazione del lipide Un dominio di lipopolisaccaride (LPS) da batteri gram-negativi fornisce comprensione dei meccanismi cellulari di superficie a base di antibiotico-resistenza, la sopravvivenza dei batteri e fitness, e come chimicamente lipidi varia Una specie molecolari differenziale modulano la risposta immunitaria innata.

Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

Due tecniche per isolare gocce lipidiche cellulari da 1) cellule di lievito e 2) placente umane sono presentati. Il fulcro di entrambe le procedure è la densità centrifugazione in gradiente, dove lo strato risultante galleggiante contenente le goccioline può essere facilmente visualizzato occhio, estratto, e quantificato mediante analisi Western Blot per la purezza.

Isolamento dei lipidi cellulari Goccioline: due tecniche di purificazione partire da cellule di lievito e placente umane

Le cellule Caco-2 possono servire come modello in vitro per studiare il trasporto degli enterociti dei lipidi e dei farmaci/vitamine liposolubili. Il sistema di membrane permeabili separa il compartimento apicale da quello basolaterale, mentre il sistema di espressione del lentivirus offre un metodo efficace di sovraespressione genica. L'isolamento delle lipoproteine è confermato dalla TEM.

Utilizzando cellule Caco-2 allo Studio Lipid Trasporto dall&#39;intestino

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

I pesci zebra stanno emergendo come un valido modello di elaborazione dei lipidi alimentari e di malattie metaboliche. Vengono descritti i protocolli di mangimi larvali ricchi di lipidi, l'imaging dal vivo di analoghi lipidici fluorescenti dietetici e la quantificazione dell'assunzione di cibo. Queste tecniche possono essere applicate a una varietà di tecniche di screening, imaging e indagine basata su ipotesi.

Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l&#39;imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo

L'arricchimento delle lipoproteine batteriche mediante una fase di tensioattivo non ionico metodo di partizionamento è descritto per uso diretto in saggi TLR o altre applicazioni. Ulteriori iniziative sono dettagliate per preparare lipopeptidi triptico N-terminale per la caratterizzazione strutturale mediante spettrometria di massa.

Arricchimento delle lipoproteine batteriche e preparazione del N-terminale lipopeptidi per determinazione strutturale mediante spettrometria di massa

Questo protocollo stabilisce un metodo novello di isolamento della gocciolina del lipido e la purificazione dai fegati del topo, utilizzando un kit di isolamento ben consolidata del reticolo endoplasmatico.

Protocollo di isolamento gocciolina del lipido rapida utilizzando un Kit di isolamento organello ben consolidate

Il presente protocollo descrive un metodo semplice per isolare i preadipociti dal tessuto adiposo negli embrioni di polli da carne. Questo metodo consente l'isolamento con alta resa, coltura primaria e differenziazione adipogenica dei preadipociti. La colorazione Oil Red O e la colorazione lipidico/DNA hanno misurato la capacità adipogenica delle cellule isolate indotte con mezzi di differenziazione.

Isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo

Il presente protocollo descrive un protocollo chirurgico dettagliato per isolare la linfa intestinale fluente in risposta alle infusioni di nutrienti intraduodenali nei topi. Ciò consente la determinazione fisiologica dell'assorbimento lipidico intestinale totale e della sintesi e secrezione di chilomicroni in risposta a vari nutrienti sperimentali.

L'isolamento della linfa mesenterica fluente nei topi per quantificare in vivo la cinetica dell'assorbimento dei lipidi alimentari e della secrezione di chilomicroni

In questo articolo, descriviamo i protocolli per misurare la quantità di fosfolipide fluorescente specificamente rimosso dalle particelle del donatore di lipidi mediante lipoproteine ad alta densità (HDL) presenti nell'intero plasma umano o nel siero. Abbiamo dimostrato che questa metrica della funzionalità HDL predice la malattia cardiovascolare incidente.

Saggio di efflusso fosfolipidico specifico per lipoproteine ad alta densità

Scopri l'isolamento delle lipoproteine dal tuorlo d'uovo per studiare l'incorporazione di acidi grassi in membrane batteriche di Staphylococcus aureus. Questo metodo lipidomico offre profili dettagliati per la ricerca microbiologica.

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dellincorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana (Video) | JoVE Journal

Isolamento delle particelle di lipoproteina dal tuorlo di uovo di pollo per lo studio dell'incorporazione di acido acido grasso patogeno batterico in fosfolipidi di membrana

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