Name: Genotipizzazione dellAnemone marino durante lo sviluppo precoce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Scopri la genotipizzazione non letale di Nematostella vectensis durante la gastrulazione per studiare fenotipi post-embriogenetici. Questo metodo consente di identificare mutanti senza sacrificare gli embrioni.

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Ringraziamo i revisori anonimi per i commenti sulla versione precedente del manoscritto, che ha migliorato il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi dell'Università dell'Arkansas.

1. Induzione della deposizione delle uova, fecondazione in vitro e deduzione
<ol><li>Mantenere la veturi di Nematostella nell'acqua di mare con una salinità di 12 parti per mille (ppt) al buio a 16 gradi centigradi, alimentando Artemia ogni giorno.</li>
	<li>Il giorno prima dell'induzione della deposizione delle uova, posizionare gli animali in un'incubatrice a temperatura e a luce. Programmare l'incubatrice in modo che gli animali siano esposti a 8 h di luce a 25 gradi centigradi. Facoltativo: alimentare un piccolo pezzo (<1 mm3) di ostrica ai singoli animali prima di inserirli nell'incubatrice per migliorare la deposizione delle uova.</li>
	<li>Lasciare gli animali nell'incubatrice per 1 h a 16 gradi centigradi.</li>
	<li>Togliere gli animali dall'incubatrice e lasciarli su una panchina con luce a temperatura ambiente (RT) per consentire la deposizione delle uova. La riproduzione di solito si verifica entro il prossimo 1,5–2 h.</li>
	<li>Se i maschi e le femmine si trovano in contenitori separati, inserire i pacchetti di uova dal contenitore femminile in un contenitore maschio contenente spermatozoi utilizzando una pipetta di trasferimento la cui punta viene tagliata per ingrandire l'apertura in modo che le uova non siano danneggiate da stress meccanico durante trasferire. Lasciare che le uova siano fecondate lasciandole nel contenitore maschile per almeno 15 min.</li>
	<li>De-jelly i pacchetti di uova in acqua di mare contenenti 3% cisteina (pH 7.4) su un piatto Petri o in un tubo da 15 mL. Agitare delicatamente su uno shaker per 12 min.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta di plastica per rompere i grumi e continuare ad agitare per altri 2-3 minuti fino a quando completamente de-jellied.</li>
	<li>Rimuovere la cisteina sostituendo il supporto con acqua di mare fresca per almeno 5x.</li>
	<li>Conservare le uova fecondate su un piatto di Petri di vetro a 16 gradi centigradi o RT.</li>
</ol>2. Rimozione chirurgica di un tessuto aborale da un embrione di gastrula
<ol><li>Preparare un buffer di estrazione del DNA composto da 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 0,3% Tween20, 0,3% NP40 e 1 mg/mL di proteina K. Utilizzare 20 mL del buffer di estrazione per embrione. Mescolare bene vorticee e il tampone in tubi PCR.</li>
	<li>Sciogliere l'1% di agarose nell'acqua di mare e versarla in un piatto Petri per coprire il fondo. Raffreddare su un banco per fare un letto gel. Versare acqua di mare fresca per coprire il letto di gel nel piatto Petri.</li>
	<li>Trasferire nella piastra Petri embrioni da 24 h post-fecondazione (hpf) (stadio da inizio gastrula) contenente un letto di gel di agarose.</li>
	<li>Inserire un ago di tungsteno in un portaa ago e sterilizzare immergendo la punta dell'ago nell'alcool (70% o superiore) e mettendolo in fiamme per bruciare l'alcol.</li>
	<li>Sotto un microscopio dissezioso (a magnifiche da 20x a 40x), utilizzare l'ago di tungsteno per fare una depressione sul letto di agarose rimuovendo un pezzo di superficie agarose circa le dimensioni di un embrione da manipolare, e posizionare l'embrione sulla depressione con la sua laterale verso il basso per limitare il movimento dell'embrione per la microchirurgia.</li>
	<li>Utilizzare l'ago del tungsteno per eccitare chirurgicamente un pezzo di tessuto aborale situato di fronte all'apertura blastoporale orale. Di solito è sufficiente un aboral aboral a un quarto del tessuto embrionale lungo l'asse orale-aborale.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta P20 per trasferire il tessuto aborare isolato (in <2 mL) in un tubo PCR contenente 20 mL di buffer di estrazione del DNA.</li>
	<li>Trasferire l'embrione post-chirurgia in un pozzo contenente almeno 500 mL di acqua dolce in una piastra di 24 o 96 pozze.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 2,4 a 2,8 per il numero di embrioni in base alle esigenze.</li>
	<li>Posizionare la piastra del pozzo contenente gli embrioni post-chirurgia in un'incubatrice a 16 gradi centigradi o RT fino al completamento della genotipizzazione.</li>
</ol>3. Estrazione del DNA genomico e genotipizzazione PCR
<ol><li>Far girare brevemente i tubi PCR contenenti il buffer di estrazione del DNA e i tessuti embrionali isolati utilizzando una mini centrifuga (ad esempio a 2.680 x g per 10 s).</li>
	<li>Per estrarre il DNA genomico da singoli embrioni, incubare i tubi PCR a 55 gradi centigradi per 3 h. Vortex per 30 s ogni 30 min per garantire la rottura dei grumi cellulari e migliorare la lisi cellulare.</li>
	<li>Incubare i tubi PCR a 95 gradi centigradi per 5 minuti per inattivare la proteinasi K.</li>
	<li>Conservare gli estratti di gDNA a 4 gradi centigradi o sul ghiaccio e procedere immediatamente alla PCR. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui inserendo estratti gDNA in un congelatore -20 .</li>
	<li>Impostare una reazione PCR utilizzando gDNA estratto come modello per amplificare il locus genomico di interesse.<ol>
<li>Se diversi alleli al luogo di interesse differiscono in termini di dimensioni in modo che la differenza di dimensioni possa essere rilevata dall'elettroforesi gel agarose, progettare un unico set di primer per amplificare l'intero locus.</li>
		<li>In alternativa, utilizzare primer specifici per alleli che generano prodotti PCR solo in presenza dell'allele specifico; ad esempio, progettando l'incarico che si lega a una regione contenente mutazioni di inserimento/eliminazione.</li>
		<li>Utilizzare un tipico mix di reazione PCR da 20 mL come segue: 5 mL di estratti di gDNA, 8 mL di acqua senza nucleato, 4 mL di buffer PCR, 0,2 mL di 10mM dNTP, 0,6 mL di DMSO, 1 mL di 10 mM di primer in avanti di 10 mM, 1 mL di 10 mM in avanti , e 0,2 mL di polimerasi del DNA (vedere Tabella dei materiali). NOTA: in una reazione PCR è possibile utilizzare più primer. Ad esempio, è possibile combinare un primer in avanti universale e due primer invertiti specifici per gli alleli, a condizione che i due primer invertiti siano progettati per generare prodotti PCR di dimensioni distinte in modo che la presenza/assenza dei due alleli possa essere inequivocabilmente determinata dall'elettroforesi gel (vedi sezione dei risultati rappresentativi).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire l'elettroforesi gel di agarose per determinare le dimensioni e la presenza/assenza di prodotti PCR. Regolare la condizione dell'elettroforesi del gel di agarose (ad esempio, percentuale di gel di agarose, V/cm e durata) a seconda delle dimensioni previste dei prodotti PCR.</li>
	<li>Utilizzare i risultati della PCR per quanto riguarda le dimensioni e la presenza/assenza di prodotti PCR per assegnare un genotipo a ogni embrione post-chirurgico. Ad esempio, se si prevede che diversi alleli generino prodotti PCR di dimensioni diverse, utilizzare le informazioni sulle dimensioni per assegnare il genotipo per ogni embrione. Se si utilizzano primer specifici dell'allele, i dati sulla presenza/assenza di prodotti PCR devono essere utilizzati per assegnare un genotipo a ciascun embrione.</li>
	<li>Ordinare gli embrioni in base al genotipo.</li>
</ol>

<ol><li>Medina, M., Collins, A. G., Silberman, J. D., Sogin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+hypotheses+of+basal+animal+phylogeny+using+complete+sequences+of+large+and+small+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Evaluating hypotheses of basal animal phylogeny using complete sequences of large and small subunit rRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9707-9712 (2001).</li>
<li>Erwin, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cambrian+Conundrum%3A+Early+Divergence+and+Later+Ecological+Success+in+the+Early+History+of+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Cambrian Conundrum: Early Divergence and Later Ecological Success in the Early History of Animals.</a> Science. 334 (6059), 1091-1097 (2011).</li>
<li>Putnam, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+anemone+genome+reveals+ancestral+eumetazoan+gene+repertoire+and+genomic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sea anemone genome reveals ancestral eumetazoan gene repertoire and genomic organization.</a> Science. 317 (5834), 86-94 (2007).</li>
<li>Magie, C. R., Daly, M., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis+occurs+via+invagination+not+ingression%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in the cnidarian Nematostella vectensis occurs via invagination not ingression.</a> Developmental Biology. 305 (2), 483-497 (2007).</li>
<li>Nakanishi, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockouts+reveal+an+endogenous+role+for+ancient+neuropeptides+in+regulating+developmental+timing+in+a+sea+anemone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockouts reveal an endogenous role for ancient neuropeptides in regulating developmental timing in a sea anemone.</a> eLife. 7, e39742(2018).</li>
<li>He, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+axial+Hox+code+controls+tissue+segmentation+and+body+patterning+in+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An axial Hox code controls tissue segmentation and body patterning in Nematostella vectensis.</a> Science. 361 (6409), 1377(2018).</li>
<li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TALEN+and+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nature Communications. 5, 5486(2014).</li>
<li>Servetnick, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-mediated+excision+of+Nematostella+brachyury+disrupts+endoderm+development%2C+pharynx+formation+and+oral-aboral+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cas9-mediated excision of Nematostella brachyury disrupts endoderm development, pharynx formation and oral-aboral patterning.</a> Development. 144 (16), 2951-2960 (2017).</li>
<li>Kraus, Y., Aman, A., Technau, U., Genikhovich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-bilaterian+origin+of+the+blastoporal+axial+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-bilaterian origin of the blastoporal axial organizer.</a> Nature Communications. 7, 11694(2016).</li>
<li>Fritzenwanker, J. H., Genikhovich, G., Kraus, Y., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+and+axis+specification+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Early development and axis specification in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Developmental Biology. 310 (2), 264-279 (2007).</li>
<li>Lee, P. N., Kumburegama, S., Marlow, H. Q., Martindale, M. Q., Wikramanayake, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+developmental+potential+along+the+animal-vegetal+axis+in+the+anthozoan+cnidarian%2C+Nematostella+vectensis%2C+is+mediated+by+Dishevelled%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric developmental potential along the animal-vegetal axis in the anthozoan cnidarian, Nematostella vectensis, is mediated by Dishevelled.</a> Developmental Biology. 310 (1), 169-186 (2007).</li>
<li>Shinzato, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Acropora+digitifera+genome+to+understand+coral+responses+to+environmental+change%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Using the Acropora digitifera genome to understand coral responses to environmental change.</a> Nature (London). 476 (7360), 320-323 (2011).</li>
<li>Gold, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+the+jellyfish+Aurelia+and+the+evolution+of+animal+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">The genome of the jellyfish Aurelia and the evolution of animal complexity.</a> Nature Ecology & Evolution. 3 (1), 96-104 (2019).</li>
<li>Clevesa, P. A., Strader, M. E., Bay, L. K., Pringle, J. R., Matz, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+genome+editing+in+a+reef-building+coral%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated genome editing in a reef-building coral.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (20), 5235-5240 (2018).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+doses+of+CRISPR%2FCas9+ribonucleoprotein+efficiently+induce+gene+knockout+with+low+mosaicism+in+the+hydrozoan+Clytia+hemisphaerica+through+microhomology-mediated+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High doses of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein efficiently induce gene knockout with low mosaicism in the hydrozoan Clytia hemisphaerica through microhomology-mediated deletion.</a> Scientific Reports. 8, 11734(2018).</li>
<li>Artigas, G. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gonad-expressed+opsin+mediates+light-induced+spawning+in+the+jellyfish+Clytia%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A gonad-expressed opsin mediates light-induced spawning in the jellyfish Clytia.</a> eLife. 7, e29555(2018).</li>
</ol>

L'autore non ha nulla da rivelare.

Descritto qui un protocollo basato su PCR per genotipare un singolo embrione di anemone di mare senza sacrificare l'animale. Dopo la deposizione delle uova e la de-jellying, le uova fecondate sono autorizzate a svilupparsi in gastrulae. La regione aborale di ogni embrione di gastrula viene rimossa chirurgicamente e il tessuto aborale isolato viene utilizzato per la successiva estrazione genomica del DNA, mentre i restanti embrioni post-chirurgia guariscono e continuano lo sviluppo. Gli estratti di gDNA vengono quindi uti...

I cnidariani rappresentano un gruppo eterogeneo di animali che includono meduse, coralli e anemoni di mare. Sono diploblasti, composti da ectodermi ed endodermi separati da una matrice extracellulare (mesoglea). Cnidaria è un gruppo gemello per speciosiare Bilateria, a cui i modelli animali tradizionali come Drosophila e Mus appartengono1. Inoltre, si pensa che la divergenza di Cnidaria-Bilateria si sia verificata nel periodo pre-Cambriano2. Come tale, gli studi comparativi di cnidariani e bilateriani sono essenziali per ottenere informazioni sulla biologia del loro antenato comune più recente. Recentemente, la genomica comparativa ha rivelato che i cnidariani e i bilateriani condividono molti geni del toolkit di sviluppo come tacca e bHLH, il che implica che il loro antenato comune aveva già questi geni3. Tuttavia, il ruolo di questi geni del toolkit di sviluppo nell'ultimo antenato comune di Cnidaria e Bilateria è comparabilmente meno ben compreso. Per affrontare questo problema, è fondamentale studiare come funzionano questi geni profondamente conservati nei cnidariani.
Uno dei modelli genetici cnidariani emergenti è l'antozoo Nematostella vectensis. Il suo genoma è stato sequenziato3, e una varietà di strumenti genetici, tra cui il knockdown genico mediato da morfolino, la transgenesi mediata da meganucle e le knockine e knockout genici mediati da CRISPR-Cas9, sono ora disponibili per l'uso in questo animale. Inoltre, lo sviluppo di Nematostella è relativamente ben compreso. Durante l'embriogenesi, la gastrazione si verifica per invaginazione4e l'embrione si sviluppa in una larva di planula che nuota liberamente. La planula successivamente si trasforma in un polipo sessile con bocca e tentacoli circumorali. Il polipo poi cresce e raggiunge la maturità sessuale.
La mutagenesi mirata mediata da CRISPR-Cas9 è ora abitualmente utilizzata per studiare la funzione genica nella vectensis 5 di Nematostella5,6,7,8,9. Per generare mutanti knockout a Nematostella, un cocktail contenente RNA a guida singola specifici di locus e la proteina Cas9 endonuclease viene iniettato per la prima volta in uova non fecondate o fecondate per produrre animali fondatori F0 che in genere mostrano Mosaicism. Gli animali F0 vengono successivamente allevati alla maturità sessuale e incrociati tra loro per produrre una popolazione di F1, un sottoinsieme dei quali può essere mutanti ad eliminazione diretta6. In alternativa, gli animali F0 sessualmente maturi possono essere incrociati con animali di tipo selvatico per generare animali eterozigoti F1, e gli eterozigoti F1 che portano un allele da urlo nel locus di interesse possono quindi essere incrociati tra loro per produrre F2 prole, un quarto di cui dovrebbero essere mutanti ad eliminazione diretta5. Entrambi gli approcci richiedono un metodo per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea. I tentacoli polipici possono essere utilizzati per estrarre il DNA genomico per la genotipizzazione6,7. Tuttavia, nei casi in cui si sta studiando la funzione dello sviluppo del gene di interesse e gli embrioni mutanti non raggiungono lo stadio polipo (cioè a causa della letalità larvale associata alla mutazione), i mutanti knockout devono essere identificati precocemente nell'ontogenesi. Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare singoli animali allo stadio gastrula senza sacrificare l'animale, che consente l'identificazione di mutanti knockout da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h.

<table><tbody><tr><td>Drosophila Peltier incubatrice refrigerata</td><td>Shellab</td><td>SRI6PF</td><td>Utilizzato per l'induzione della deposizione delle uova</td></tr><tr><td>Sale marino istantaneo dell'oceano</td><td>Oceano istantaneo</td><td>138510</td><td></td></tr><tr><td>Cisti di gamberetti in salamoia</td><td>Aquatic Eco-Systems, Inc.</td><td>BS90</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteina cloridrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale standard, modello 3500</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>TRIS-HCl, 1M, pH8.0</td><td>QUALITÀ BIOLOGICA</td><td>351-007-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>VWR</td><td>BDH9258</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 M pH8</td><td>VWR</td><td>BDH7830-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet-P40 Sostituto</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K soluzione (20 mg/mL), RNA grado</td><td>ThermoFisher</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>VWR</td><td>710</td><td></td></tr><tr><td>Micro Porta aghi da dissezione</td><td>Roboz</td><td>RS-6060</td><td></td></tr><tr><td>Ago da dissezione in tungsteno</td><td>Roboz</td><td>RS-6063</td><td></td></tr><tr><td>PCR Eppendorf Mastercycler Termociclatori</td><td>Eppendorf</td><td>E6336000024</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>GLWamide primer universale in avanti</td><td></td><td></td><td>5'- CATGCGGAGACCAAGCGCAAGGC-3'</td></tr><tr><td>Innesco inverso specifico per glw-a</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGATGCCTGGTGATAC-3'</td></tr><tr><td>Innesco inverso specifico per glw-c </td><td></td><td></td><td>5'- CGGCCGGCGCATATATAG-3'</td></tr></tbody></table>

genotipizzazione dell'anemone marino durante lo sviluppo precoce

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Descritto qui è un protocollo basato su PCR per genotipare l'embrione dello stadio gastrula del cnidariano anthozoano Nematostella vectensis senza sacrificare la vita dell'animale. Dopo la fecondazione in vitro e la de-jellying, gli zigoti sono autorizzati a svilupparsi per 24 h a temperatura ambiente per raggiungere la fase iniziale-medio gastrula. Gli embrioni di gastrula vengono poi posti su un letto di gel di agarose in un piatto Petri contenente acqua di mare. Al microscopio dissezioso, un ago di tungsteno viene utilizzato per separare chirurgicamente un frammento di tessuto aborale da ogni embrione. Gli embrioni post-chirurgia sono poi autorizzati a guarire e continuare lo sviluppo. Il DNA genomico viene estratto dal frammento di tessuto isolato e utilizzato come modello per la PCR specifica per il locus. Il genotipo può essere determinato in base alle dimensioni dei prodotti PCR o alla presenza/assenza di prodotti PCR specifici per alleli. Gli embrioni post-chirurgia vengono poi ordinati in base al genotipo. La durata dell'intero processo di genotipizzazione dipende dal numero di embrioni da vagliare, ma richiede minimamente 4-5 h. Questo metodo può essere utilizzato per identificare i mutanti knockout provenienti da una popolazione geneticamente eterogenea di embrioni e consente l'analisi dei fenotipi durante lo sviluppo.

Il genoma di Nematostella ha un singolo locus che codifica una proteina precursore per il neuropeptide GLWamide. Tre alleli mutanti knockout in questo locus (glw-a, glw-be glw-c) sono stati precedentemente segnalati5. Quattro maschi eterozigoli che trasportavano un allele di tipo selvaggio ( ) e l'allele da urlo glw-cal locus GLWamide (genotipo: / glw-c) sono stati i...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di genottare l'anemone di mare Nematostella vectensis durante la gastrulation senza sacrificare l'embrione.

Genotipizzazione dell'Anemone marino durante lo sviluppo precoce

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Questo protocollo consente a un ricercatore di identificare gli anemoni marini mutanti durante l'embriogenesi precoce in modo da poter analizzare il fenotipo dello sviluppo post-embrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzato per genotipare singoli anemoni marini all'inizio dell'ontogenia senza sacrificare la vita dell'animale. A dimostrare questa procedura sarà Miguel Silva, uno studente laureato del mio laboratorio.Il giorno prima dell'induzione della deposizione delle uova, posizionare l'anemone nematostella vectensis in un incubatore a temperatura e controllato dalla luce, programmando l'incubatore in modo che gli animali siano esposti a otto ore di luce a 25 gradi Celsius. Il giorno seguente, rimuovere gli animali dall'incubatrice e lasciarli su un piano di panca a temperatura ambiente con la luce alta per consentire la deposizione delle uova, che si verificherà entro le successive da una ora e mezza a due ore. Utilizzare una pipetta di trasferimento che viene tagliata per ingrandire l'apertura per posizionare i pacchetti di uova dal contenitore femminile in un contenitore maschile contenente spermatozoi e lasciarli nel contenitore maschile per almeno 15 minuti per consentire la fecondazione.Dopo la fecondazione, per svalutare le confezioni di uova, metterle in acqua di mare contenente il 3%di cisteina su una piastra di Petri di vetro e agitare delicatamente su uno shaker per 12 minuti. Quindi rompere i grumi con una pipetta di plastica e continuare ad agitarsi per altri due o tre minuti fino a completa dejellied. Mantenere le uova fecondate sullo stesso piatto a 16 gradi Celsius o a temperatura ambiente.Il giorno successivo, preparare il buffer di estrazione del DNA come descritto nel manoscritto, mescolare bene con il vortice e aliquotarlo in tubi PCR aggiungendo 20 microlitri a ciascun tubo. Sciogliere l'1% di agarosio in acqua di mare, versarlo in una piastra di Petri per coprire il fondo e raffreddare su un piano di panca per fare un letto in gel. Coprire il letto in gel con acqua di mare fresca.Trasferire embrioni post-fecondazione 24 ore su 24 utilizzando una pipetta nella piastra di Petri contenente il letto in gel di agarosio. Inserire un ago di tungsteno in un supporto necessario e sterilizzare immergere la punta in alcool e posizionare in fiamme per bruciare l'alcol. Al microscopio sezionato, fare una depressione sull'agarosio usando l'ago di tungsteno per rimuovere un pezzo di agarosio superficiale delle dimensioni di un embrione da manipolare.Quindi, usando l'ago di tungsteno, posizionare l'embrione nella depressione con il suo lato laterale rivolto verso il basso al fine di limitare il movimento dell'embrione per la microchirurgia. Al fine di eseguire un intervento chirurgico di successo, è fondamentale limitare il movimento dell'embrione. Con l'ago di tungsteno, rimuovere chirurgicamente un pezzo di tessuto aborale lungo l'asse aborale orale, situato di fronte all'apertura blastoporale orale.Con una pipetta P20, trasferire il tessuto aborale isolato in un tubo PCR contenente 20 microlitri di tampone di estrazione del DNA. Trasferire l'embrione post-intervento chirurgico in un pozzo di una piastra di 24 po 'contenente almeno 500 microlitri di acqua di mare fresca. E posizionare la piastra contenente embrioni post-operatori in un'incubatrice a 16 gradi Celsius fino al completamento del genotipizzazione.Per estrarre il DNA genomico da singoli embrioni, prima spingi brevemente giù i tubi PCR contenenti il tampone di estrazione del DNA e i tessuti embrionali isolati usando una mini centrifuga. Quindi incubare i tubi a 55 gradi Celsius per tre ore mentre si vortice per 30 secondi ogni 30 minuti per garantire la rottura dei grumi cellulari e migliorare la lisi cellulare. Dopo aver inattivato la proteinasi K a 95 gradi Celsius per quattro minuti, impostare una reazione PCR utilizzando il DNA genomico estratto come modello per amplificare il luogo di interesse.Progettare i primer desiderati come descritto nel manoscritto. Impostare una reazione PCR a 20 microliter. Dopo aver completato la PCR, eseguire l'elettroforesi del gel di agarosio per determinare le dimensioni e la presenza o l'assenza di prodotti PCR, assicurandosi di regolare le condizioni dell'elettroforesi del gel di agarosio a seconda delle dimensioni previste dei prodotti PCR.Utilizzare i risultati della PCR per quanto riguarda le dimensioni e la presenza o l'assenza o i prodotti PCR per assegnare un genotipo a ciascun embrione post-chirurgico e quindi ordinare gli embrioni in base al loro genotipo. Il genoma della nematostella ha un singolo locus che codifica una proteina precursore per il neuropeptide GLWamide. Tre alleli mutanti knockout al locus sono stati precedentemente segnalati.I risultati della PCR da embrioni campionati casualmente tra la progenie di un incrocio di F1 tra una femmina eterozigote che porta un allele knockout A e maschi eterozigoti che portano un allele knockout C mostrano diversi genotipi. Gli embrioni uno e due mostrano una singola banda PCR corrispondente alla dimensione prevista di un allele knockout. Gli embrioni tre e sei mostrano due bande PCR con le dimensioni previste per gli alleli knockout A e C.Embryos quattro, sette e otto mostrano una singola banda PCR corrispondente alla dimensione prevista dell'allele knockout C.L'embrione 5 non mostra bande, suggerendo la mancanza di legame del primer. Per escludere la possibilità di un fallimento dell'estrazione genomica del DNA, un altro PCR è stato eseguito utilizzando un primer inverso che può legarsi alla sequenza di tipo selvaggio. Dove è stato rilevato un prodotto PCR di dimensioni previste, l'estrazione genomica del DNA ha avuto successo.Mentre nessun prodotto ha suggerito un guasto nell'estrazione. Sebbene questo protocollo sia progettato per gli embrioni di anemoni marini, sarà sicuramente possibile applicare questo metodo ad altri cnidari, come coralli e meduse, dove le informazioni genomiche e gli embrioni sono accessibili. Seguendo questa procedura, i mutanti identificati vengono utilizzati per valutare il fenotipo dello sviluppo.Ad esempio, tecniche istologiche come l'immunostaining possono essere utilizzate per valutare difetti nella morfologia, mentre l'ibridazione in situ, l'RT-PCR quantitativo in tempo reale e l'RNA-seq possono essere utilizzate per valutare i difetti nell'espressione genica. Inoltre, l'imaging dal vivo può essere utilizzato per valutare difetti nel comportamento durante lo sviluppo post-embrionale, come nelle larve o nei primi polipi.

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