Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo
10 aprile 2019
Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.
Questo saggio di fagocitosi in vivo consente ai ricercatori di effettuare schermi genetici e studi di associazione a livello genomico per identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi nelle cellule del sangue adulte. Questo esperimento è quantitativo, facile da eseguire e può essere applicato allo screening di animali vivi per fattori ospiti che influenzano il riconoscimento, l'assorbimento e la clearance degli agenti patogeni. Dopo aver tirato capillari in vetro a parete sottile con un estrattore ad ago, utilizzare un micrometro per tenere l'ago al microscopio e utilizzare le pinzette in acciaio inossidabile a punto fine al numero cinque per rompere la punta a un diametro della punta di 100 micrometri.
Per misurare il volume di liquido che verrà iniettato in ogni mosca, caricare un ago capillare con colorazione sterile del 5% degli alimenti in PBS ed espellere il liquido su una goccia di olio minerale su un micrometro a stadio di 0,01 millimetri. Distribuire 10 microlitri da 1,6 milligrammi per particelle millilitre su un piccolo quadrato di Parafilm e tirare il liquido nell'ago. Montare l'ago nell'ugello dell'iniettore e allineare le mosche anestetizzate lungo la loro area designata sul fly pad, lato ventrale verso l'alto, con le teste orientate verso la parte anteriore del pad.
Posizionare le fiale nelle aree corrispondenti sul banco e iniettare le mosche nell'angolo superiore dell'addome con cinque pompe di liquido da 100 millisecondi per fornire circa 10 nanolitri di particelle in totale. Trasferire ogni mosca nella fiala appropriata mentre viene iniettata, notando il tempo sul flaconcino. Successivamente, caricare un nuovo ago con la soluzione 0.4%Trypan Blue e impostare l'iniettore pneumatico su gated, per consentire un flusso costante di aria per spingere il liquido fuori dall'ago.
30 minuti dopo l'iniezione iniziale, iniettare ogni addome di mosca con Trypan Blue fino a quando gli addome sono pieni e distesi. Montare le mosche su vetrini al microscopio con nastro elettrico, lato ventrale verso il basso, spingendo le ali sul lato della mosca per fissarle al nastro. Quindi, spingere delicatamente la testa nel nastro per assicurarsi che la mosca non si muova.
Subito dopo che tutte le mosche sono state fissate, immagini gli insetti, uno alla volta, con un ingrandimento 25 o 32 volte superiore su un microscopio a fluorescenza invertito collegato a una fotocamera digitale e a un computer, concentrandosi sul vaso dorsale di ogni mosca utilizzando il software del computer per la fotocamera digitale. Quindi, registrare il tempo di esposizione e l'ingrandimento tra gli esperimenti. Per quantificare la fluorescenza, aprire un programma di analisi dell'imaging appropriato e aprire un'immagine.
Per misurare l'intensità di fluorescenza del vaso dorsale, disegnare un poligono attorno al vaso dorsale e selezionare Misura per registrare l'intensità della fluorescenza all'interno del poligono. Per determinare l'intensità della fluorescenza di fondo, copiare il primo poligono e spostarlo in un'area adiacente al vaso dorsale di ogni mosca. Quindi, selezionate Misura (Measure) e registrate l'intensità di fluorescenza dell'area di sfondo.
Per normalizzare la fluorescenza del vaso dorsale per la fluorescenza di fondo, dopo aver misurato le intensità di fluorescenza del resto delle mosche, dividere la fluorescenza del vaso dorsale per la fluorescenza di fondo e calcolare l'intensità media di fluorescenza del vaso dorsale normalizzata di tutte le mosche in un unico ceppo. Dopo essere stati montati sul lato ventrale verso il basso su un pezzo di nastro elettrico, i primi due segmenti dell'addome, dove si trova il vaso dorsale, sono chiaramente visibili. Le principali fonti di errore sperimentale si verificano nelle fasi di iniezione e imaging della procedura.
L'uso dello stesso ago per iniettare più mosche può causare l'intasarsi di tessuto di mosca o particelle. Mosche che non ricevono abbastanza fluorescenza Trypan Blue brillantemente in tutto il loro addome, il che può ridurre il rapporto tra il vaso dorsale e la fluorescenza di fondo, diminuendo così il vero rapporto di intensità della fluorescenza dell'animale. Le mosche dovrebbero essere fotografate mentre sono immobilizzate dall'anidride carbonica, poiché le mosche in movimento attivo producono immagini sfocate che non possono essere quantificate.
Una linea mutante della collezione Zuker di mosche trattate con etile metanosulfonato non è in grado di flegocitosi batteri gram-negativi e gram-positivi e non mostra quasi nessuna fluorescenza del vaso dorsale nel saggio di fagocitosi in vivo, accoppiata al ceppo di Zuker di fondo isogenico e a un altro comune ceppo di controllo di laboratorio. Tieni traccia del tempo e dell'ordine in cui le mosche vengono iniettate per garantire che le mosche si trovano in fasi comparabili di riconoscimento e assorbimento degli agenti patogeni quando vengono immagini. I meccanismi molecolari alla base dei difetti fagocitici possono essere determinati studiando singoli emociti con microscopia confocale o dopo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza o mediante isolamento magnetico delle perline di emociti adulti.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un saggio di fagocitosi in vivo in Drosophila melanogaster adulte per quantificare il riconoscimento e l'eliminazione da parte dei fagociti delle infezioni microbiche. Questo esperimento è quantitativo, semplice da eseguire e può essere applicato allo screening di animali vivi per identificare fattori dell'ospite che influenzano il riconoscimento, l'assorbimento e l'eliminazione dei patogeni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Immunologia
- Genetica
Sfondo
- La fagocitosi è una risposta immunitaria fondamentale.
- Drosophila melanogaster funge da organismo modello.
- Comprendere la funzione dei fagociti può rivelare informazioni importanti sulla regolazione del sistema immunitario.
- Questo saggio consente schermate genetiche per identificare i geni coinvolti.
Scopo dello studio
- Quantificare l'attività dei fagociti in risposta a infezioni microbiche.
- Identificare nuovi geni che regolano la fagocitosi.
- Approfondire la comprensione delle interazioni ospite-patogeno.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di capillari di vetro sottile per l'iniezione.
- Utilizzo di colorante alimentare sterile in PBS per la misurazione del liquido.
- Distribuzione delle particelle su Parafilm per l'iniezione nelle mosche.
- Posizionamento delle mosche anestetizzate per un'iniezione precisa.
Risultati principali
- Quantificazione riuscita del riconoscimento e della rimozione da parte dei fagociti.
- Identificazione dei fattori genetici che influenzano la fagocitosi.
- Dimostrazione dell'applicabilità del saggio a organismi viventi.
- Agevolazione di ulteriori ricerche sulle risposte immunitarie.
Conclusioni
- Il saggio di fagocitosi in vivo è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Permette di esplorare l'influenza genetica sulla funzione immunitaria.
- Studi futuri potranno basarsi su questi risultati per migliorare la ricerca immunologica.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo saggio di fagocitosi in vivo in Drosophila melanogaster fornisce un sistema geneticamente manipolabile per valutare le interazioni ospite-patogeno e identificare i regolatori genetici dell'immunità cellulare. Il suo risultato quantitativo e riproducibile consente la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei programmi di scoperta incentrati sull'immunologia. Il saggio supporta campagne di screening per individuare priorità tra i bersagli terapeutici con un'elevata affidabilità predittiva riguardo alla funzione immunitaria innata.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando l'assorbimento e la distruzione di particelle in animali vivi.
- Valore operativo: Favorisce la riduzione del rischio biologico mediante schermate genetiche per identificare nuovi geni che influenzano la fagocitosi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio collegando l'attività degli emociti ai meccanismi di riconoscimento e rimozione dei patogeni.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative della fluorescenza che consentono una valutazione standardizzata dell'efficienza fagocitica in diversi contesti genetici.
- Valore operativo: Offre un flusso di lavoro scalabile e di facile esecuzione, compatibile con lo screening su animali vivi per identificare fattori dell'ospite.
- Valore di riproducibilità: Garantisce risultati costanti grazie a un dosaggio controllato delle particelle e alla normalizzazione dell'intensità di fluorescenza nel vaso dorsale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Fornisce un sistema rilevante per la patologia per lo studio di meccanismi immunitari innati conservati, con allineamento traslazionale dei biomarcatori.
- Valore operativo: Permette decisioni di avanzamento aggiustate per il rischio, correlando difetti fagocitici con fenotipi mutanti.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio meccanicistica identificando fattori genetici che modulano l'assorbimento e l'eliminazione dei patogeni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il saggio si colloca nella fase iniziale della scoperta per supportare la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nell'ambito dell'immunologia, con un'utilità diretta nell'identificazione di candidati promettenti mediante lo screening genetico di fattori ospite che influenzano l'eliminazione dei microrganismi.
- Biologia della scoperta: Permette la verifica di ipotesi sui meccanismi fagocitici misurando l'assunzione di particelle negli emociti di Drosophila in condizioni controllate.
- Screening: Fornisce prontezza del saggio e output quantitativi per valutare varianti genetiche che influenzano il riconoscimento e l'assunzione di patogeni.
- Analisi: Genera letture di intensità di fluorescenza normalizzate che consentono il confronto dell'attività fagocitica tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica sfruttando percorsi immunitari conservati nell'evoluzione tra invertebrati e mammiferi.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di screening riutilizzabile per bersagli di immunologia grazie alla sua manipolabilità genetica e al design quantitativo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle risposte immunitarie cellulari.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso l'iniezione precisa di particelle e la quantificazione della fluorescenza.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione sperimentale consentendo la rilevazione precoce di difetti fagocitici in ceppi mutanti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, in funzione del loro impatto sull'efficienza di eliminazione dei patogeni.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio di Drosophila, microiniezione e microscopia a fluorescenza.
- Si basa su iniettori pneumatici, aghi capillari e sistemi di imaging per un'erogazione e un rilevamento costanti delle particelle.
- Necessita di protocolli standardizzati per l'immobilizzazione dei moscerini e il montaggio ventrale al fine di garantire un imaging riproducibile.
- Richiede considerazioni adattative quando si estende il saggio a diversi tipi di particelle o modelli di infezione.
- I limiti pratici includono l'ostruzione degli aghi causata dai tessuti dei moscerini e la variabilità nell'iniezione di Blu di Tripano che influisce sulla fluorescenza di fondo.
