Name: Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Impara a generare organoidi biliari extraepatici da topi adulti per studiare la biologia dei colangiociti. Questo metodo riproducibile e conveniente consente di coltivare un numero quasi illimitato di cellule per ricerche su rigenerazione tissutale.

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Questo lavoro è stato supportato dalla associazione americana per il premio di studio del fegato malattie Pinnacle (di N.R.) e il National Institutes of Health, National Institute of Diabetes e digestivo e delle malattie renali (premi P30 DK34933 di N.R., P01 DK062041 a J.L.M.). Ringraziamo il dottor Ramon Ocadiz-Ruiz (Università del Michigan) per la sua assistenza con lo sviluppo di questa metodologia.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of Michigan.
1. preparazione di attrezzature e materiali per l'isolamento EHBD Mouse
<ol><li>Preparare mezzo semina e tampone di lavaggio (Tabella materiali) in 50 mL provette coniche e conservare a 4 ° C o su ghiaccio fino all'utilizzo.</li>
	<li>Istituito un tavolo chirurgico (Figura 1B). Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzati (Figura 1).</li>
	<li>Posizionare una piastra a 24 pozzetti sterile nell'incubatore 37 ° C coltura tissutale per pre-riscaldarla.</li>
	<li>Trasferire un'aliquota di matrice seminterrato sul ghiaccio. Matrice di seminterrato uso solo quando esso è completamente liquefatto.</li>
</ol>2. EHBD isolamento e coltura di Organoid biliare
<ol><li>
Isolamento e la preparazione di una sospensione unicellulare del mouse EHBD
	<ol>
<li>Eutanasia di un topo adulto (età superiore a 2 mesi) secondo le linee guida istituzionali. Posizionare il mouse in posizione supina. Aprire la cavità addominale usando un metodo del midline e ritrarre il fegato a riposare sul diaframma.</li>
		<li>Identificare il dotto biliare comune situato immediatamente sotto l'ILO del fegato tirando delicatamente il duodeno prossimale con una pinza emostatica. Separare EHBD dai tessuti circostanti usando un bisturi. Tenendo l'estremità prossimale del dotto biliare comune con il forcipe, disseccarla distale appena sopra la giuntura con il duodeno, quindi sezionare l'estremità prossimale del dotto dal fegato (Figura 1). Inserire subito isolato EHBD (Figura 1E) nel tampone di lavaggio.</li>
		<li>Togliere il tampone di lavaggio EHBD e tritare in sezioni di 0,5 mm usando un bisturi sterile. Posizionare il tessuto su una lastra di vetro sul ghiaccio durante la procedura (Figura 1B).</li>
		<li>Inserire le sezioni EHBD in una provetta contenente 500 µ l di buffer di dissociazione. Incubare per 20 min a 37 ° C. Neutralizzare il buffer di dissociazione aggiungendo 500 µ l di terreno di coltura cellulare ghiacciata.</li>
		<li>Triturare la sospensione cellulare su e giù per progredire attraverso aghi 18 G e 20 G, 20 volte ciascuno. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 70 µm e raccogliere il flusso continuo in una provetta da 50 mL. Nota: La pre-condizione del filtro con 500 µ l di sterile tampone fosfato salino (PBS) prima del filtraggio per facilitare il passaggio della sospensione delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Che istituisce EHBD organoids
	<ol>
<li>Centrifugare il flusso continuo dal punto 2.1.5 a 300 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Rimuovere con cautela il supernatante. Risospendere le cellule in 1 mL di PBS sterile ghiacciata. Trasferire la risospensione in una nuova provetta da 1,5 mL. Ripetere il punto 2.2.1.</li>
		<li>Dopo la centrifugazione, rimuovere attentamente il surnatante da cellule lavate raccolte nella parte inferiore del tubo. Risospendere il pellet cellulare in 120 µ l di matrice liquefatto seminterrato ghiacciata pipettando su e giù utilizzando P200 consigli. Nota: Risospensione di pellet di cella nella matrice seminterrato deve essere effettuato il bagno di ghiaccio.</li>
		<li>Piastra 40 µ l della risospensione delle cellule nella matrice seminterrato nel centro di un pozzo in una piastra a 24 pozzetti pre-riscaldato. Nota: Evitare l'aspirazione di aria durante la manipolazione di matrice seminterrato per evitare la formazione di bolle.</li>
		<li>Restituire la piastra con le cellule risospese in matrice seminterrato nell'incubatore di coltura del tessuto di 37 ° C per 15 minuti o fino a matrice seminterrato è solidificato. Aggiungere 600 µ l del mezzo semina riscaldato fino a 37 ° C in ogni pozzetto (Tabella materiali). Riporre la piastra nell'incubatore di coltura del tessuto di 37 ° C.</li>
		<li>Sostituire il mezzo di semina con 600 µ l di terreno di coltura fresco organoid in 3 giorni e da allora in poi ogni 3 giorni. Monitorare la crescita organoid con un microscopio invertito. Uso organoids per un'applicazione a valle o Spalato ogni 7 a 9 giorni prima accumulazione del collasso di detriti e organoid intraluminal sono osservati (Figura 2A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHBD Organoid passaggio e deposito
<ol><li>
Passaggio dei organoids EHBD 1:3 a 1:4 ogni 7-9 giorni
	<ol>
<li>Rimuovere il supporto dal pozzo e aggiungere 400 µ l di PBS ghiacciata. Risospendere il organoids pipettando delicatamente la miscela su e giù 10 volte nel pozzo. Trasferire il composto in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Passaggio la miscela attraverso un ago 25 G 4 volte per dissociare il organoids. Centrifugare la miscela a 400 x g per 4 min a 4 ° C.</li>
		<li>Rimuovere con cautela il supernatante e risospendere le cellule in matrice di seminterrato (1:3 a 1:4) per ulteriore coltura (passaggio 2.2.4.) o lavare le cellule con PBS freddo ghiaccio per un'ulteriore elaborazione. Nota: In genere, 250-300 cellule sono placcate nella piastra a 24 pozzetti per applicazioni a valle. Efficienza di placcatura può essere valutata da microscopia luminosa del campo utilizzando un microscopio invertito il giorno 3-5 dopo passaggio contando il numero di organoids e calcolando la percentuale dal numero iniziale delle cellule. mRNA può essere isolato da EHBDOs lavate in PBS utilizzando il protocollo standard mediante estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio di guanidinium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Archiviazione a lungo termine dei organoids EHBD
	<ol>
<li>Rimuovere il supporto dal pozzo e lavare il organoids con temperatura ambiente PBS. Rimuovere PBS dal pozzo senza disturbare la goccia di matrice del seminterrato.</li>
		<li>Aggiungere 500 µ l di mezzo al pozzo di congelamento delle cellule ghiacciata. Risospendere il organoids nel seminterrato liquefatto matrix e medie di congelamento delle cellule delicatamente e trasferire il composto in fiale criogeniche.</li>
		<li>Conservare i flaconi a-80 ° C per 48 h. trasferimento le fiale ad un serbatoio di azoto per l'archiviazione a lungo termine in una fase di vapore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EHBD Organoid Pprocessing per inclusione in paraffina
<ol><li>Risospendere il EHBDOs in 500 µ l di PBS ghiacciata (4 ° C) pipettando su e giù per 5 a 10 volte. Raccogliere il sedimento EHBDO in matrice liquefatto seminterrato in una provetta da 1,5 mL. Nota: Per evitare la rottura organoids, tagliare il fondo 2-3 mm di una punta di P1000 e rimuovere il surnatante con molta attenzione.</li>
	<li>Centrifuga EHBD organoids a 350 x g per 5 min, rimuovere con cautela il supernatante senza disturbare il pellet organoid.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di gelida paraformaldeide al 4% (PFA) per il organoids e incubare la organoids nel 4% PFA durante la notte a 4° C. Rimuovere i 4% PFA da organoids utilizzando una punta di P1000 dopo incubazione overnight.</li>
	<li>Aggiungere 1000 µ l di PBS di temperatura per il tubo con la organoids e incubare per 5 min a temperatura ambiente (TA). Centrifugare la provetta con organoids in PBS a 350 x g per 5 min, ripetere questo processo due volte.</li>
	<li>Rimuovere PBS e aggiungere 1 mL di etanolo al 30% per il organoids. Incubare per 5 min a RT.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 350 x g per 5 min a RT. Remove 30% etanolo. Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% e incubare per 5 minuti a TA.</li>
	<li>Centrifugare a 350 x g per 5 min. Remove etanolo al 70%. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% e incubare per 5 minuti a TA. Nota: Organoids può essere mantenuto in etanolo al 100% a temperatura ambiente fino a 48 h prima della trasformazione ulteriore.</li>
	<li>Gel di trattamento campione in un forno a microonde per 20 di calore s o fino a quando liquefatto. Aggiungere 50 µ l di campione gel nel tubo con organoids di elaborazione. Posizionare il tubo sul ghiaccio fino a quando il trattamento gel dei campioni sono solidificato.</li>
	<li>Rimuovere la goccia di gel con organoids dal tubo di trattamento dei campioni e tra le pastiglie di spugna blu in una cassetta per l'ulteriore elaborazione nel processore del tessuto. Utilizzare 15 min per ogni passaggio in embedder la paraffina durante un'ulteriore elaborazione...</li>
	<li>Sezione organoids paraffina-incastonato nel trattamento dei campioni gel a 4 µm. procedere come descritto in precedenza16di macchiatura immunohistochemical.</li>
</ol>

<ol><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholangiopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem%2FProgenitor+Cell+Niches+Involved+in+Hepatic+and+Biliary+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem/Progenitor Cell Niches Involved in Hepatic and Biliary Regeneration.</a> Stem Cells International. 2016, 3658013(2016).</li>
<li>DiPaola, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intramural+epithelial+networks+linked+to+peribiliary+glands+that+express+progenitor+cell+markers+and+proliferate+after+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Identification of intramural epithelial networks linked to peribiliary glands that express progenitor cell markers and proliferate after injury in mice.</a> Hepatology. 58 (4), 1486-1496 (2013).</li>
<li>Venter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+functional+characterization+of+extrahepatic+cholangiocyte+lines+from+normal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+And+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Development and functional characterization of extrahepatic cholangiocyte lines from normal rats.</a> Digestive And Liver Disease. 47 (11), 964-972 (2015).</li>
<li>Glaser, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+heterogeneity+of+the+mouse+intrahepatic+biliary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional heterogeneity of the mouse intrahepatic biliary epithelium.</a> Laboratry Investigation. 89 (4), 456-469 (2009).</li>
<li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+stem%2Fprogenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes%2C+cholangiocytes%2C+and+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li>
<li>De Assuncao, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cholangiocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratry+Investigation%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cholangiocytes.</a> Laboratry Investigation. 95 (6), 684-696 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Kruitwagen, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Adult+Feline+Liver+Organoid+Cultures+for+Disease+Modeling+of+Hepatic+Steatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Adult Feline Liver Organoid Cultures for Disease Modeling of Hepatic Steatosis.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 822-830 (2017).</li>
<li>Spence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+the+Wild+West+of+Organoids%2C+Enteroids%2C+and+Mini-Guts%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Taming the Wild West of Organoids, Enteroids, and Mini-Guts.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 5 (2), 159-160 (2018).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+Modeling+in+Stem+Cell-Derived+3D+Organoid+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems.</a> Trends In Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Sampaziotis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Building better bile ducts.</a> Science. 359 (6380), 1113(2018).</li>
<li>Sampaziotis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+mouse+extrahepatic+biliary+tree+using+primary+human+extrahepatic+cholangiocyte+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the mouse extrahepatic biliary tree using primary human extrahepatic cholangiocyte organoids.</a> Nature Medicine. 23 (8), 954-963 (2017).</li>
<li>Nakagawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+epithelial+injury-induced+regenerative+response+by+IL-33+promotes+cholangiocarcinogenesis+from+peribiliary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Of+The+Natural+Academy+Of+Science+Of+The+United+States+Of+America%22%5BJournal%5D)">Biliary epithelial injury-induced regenerative response by IL-33 promotes cholangiocarcinogenesis from peribiliary glands.</a> Proceedings Of The Natural Academy Of Science Of The United States Of America. 114 (19), E3806-E3815 (2017).</li>
<li>Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+modulates+IL-33-dependent+extrahepatic+bile+duct+cell+proliferation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Communications%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling modulates IL-33-dependent extrahepatic bile duct cell proliferation in mice.</a> Hepatology Communications. , (2018).</li>
<li>Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+formation+and+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Bile formation and secretion.</a> Comprehensive Physiology. 3 (3), 1035-1078 (2013).</li>
<li>Carpino, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biliary+tree+stem%2Fprogenitor+cells+in+glands+of+extrahepatic+and+intraheptic+bile+ducts%3A+an+anatomical+in+situ+study+yielding+evidence+of+maturational+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Biliary tree stem/progenitor cells in glands of extrahepatic and intraheptic bile ducts: an anatomical in situ study yielding evidence of maturational lineages.</a> Journal Of Anatomy. 220 (2), 186-199 (2012).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Williamson, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Organoid+Microinjection+Platform+to+Study+Gastrointestinal+Microbiota+and+Luminal+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+And+Molecular+Gastroenterology+And+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Organoid Microinjection Platform to Study Gastrointestinal Microbiota and Luminal Physiology.</a> Cellular And Molecular Gastroenterology And Hepatology. 6 (3), 301-319 (2018).</li>
<li>Wan, A. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+Cell-Cell+Interactions+for+Organoid+Construction+-+Are+Biomaterials+Dispensable%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+In+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recapitulating Cell-Cell Interactions for Organoid Construction - Are Biomaterials Dispensable?</a> Trends In Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

Questo lavoro descrive la generazione di un modello 3-dimensionale organotipiche del mouse EHBD colangiociti. Passi importanti nella generazione di cultura EHBDO includono dissezione meticolosa EHBD per evitare la contaminazione delle cellule di pancreas, mantenimento di condizioni di sterilità per evitare contaminazioni batteriche e fungine e un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione per evitare il perdita di materiale cellulare. Una stretta aderenza alle condizioni di temperatura descritto è necessaria. Ci sono ...

Cholangiopathies sono incurabili disordini progressivi cronici che colpiscono le cellule biliari situate in intra e dotti biliari extrahepatic (EHBDs)1. Alcuni cholangiopathies, come colangite sclerotica primaria, colangiocarcinoma, atresia biliare e le cisti del coledoco, interessano principalmente EHBDs. Sviluppo di terapie per cholangiopathies è limitato dalla disponibilità limitata di modelli preclinici. Inoltre, studi precedenti incentrato su cholangiopathies raggruppati: fegato, intra- ed EHBDs. Tuttavia, intra - ed EHBDs hanno un'origine embrionale distinta e, quindi, dovrebbe essere considerata come patologie molecolari distinte. Dotti biliari intraepatici sviluppano dalle piastre ductal intraepatiche e della parte cranica del diverticolo epatico, tutta EHBDs sviluppare da parte caudale del diverticolo epatico2. Si affidano anche compartimenti cellulari differenti progenitore per adulto omeostasi, compresi canali di Hering in dotti biliari intraepatici e ghiandole peribiliari in EHBDs2,3. Uso di modelli animali per studi preclinici è limitata dalla spesa e deve essere ridotto al minimo per motivi etici. Di conseguenza, riduzionista, riproducibile, tempo e costo-efficienti modelli in vitro sono altamente desiderabili.
Maggior parte degli studi precedente di cholangiopathies utilizzato mouse normale o modelli di ratto del cancro o colangiocarcinoma umano linee cellulari derivate da intra - ed EHBDs4,5,6,7. Tuttavia, questi sono modelli di cellule trasformate e non ripassare biologia dei colangiociti normale omeostasi o in uno stato sano. Recenti progressi nello sviluppo di modelli di coltura organotypic ha permesso lo sviluppo di strutture 3-dimensionale da diversi tipi di tessuto, compresi i tessuti di hepatobiliary, anche se non normale mouse EHBDs8,9, 10. Queste strutture di "organo-come" puntato che imita il tessuto primario e sono cresciute in una nicchia artificiale sostegno auto-rinnovamento delle cellule staminali/progenitrici di organo-specifiche cellule11.
"Organoid" è un vasto termine che più comunemente vengono descritti modelli 3-dimensionale del tessuto derivate da cellule staminali. Organoids può essere generato da riprogrammate pluripotenti le cellule staminali rappresentata da cellule staminali embrionali e cellule staminali pluripotenti indotte. Inoltre possono essere generate da cellule staminali adulte di organo-specific12. Sono stati proposti alcuni modelli di organoid dei colangiociti in precedenti studi di ricerca. Così, organoids derivato da cellule staminali pluripotenti umane sono stati segnalati7,9,13 e fornire uno strumento efficiente di prezioso, tempo che consente la generazione simultanea di diversi tipi di cellule. Tuttavia, questi organoids derivati da cellule staminali pluripotenti non riflettono completamente la struttura e la funzionalità del primario adulto EHBD colangiociti.
Organoids derivate da cellule staminali adulte del umano9 e felino10 del fegato sono stati anche proposti. Modelli di felini non sono ampiamente disponibili e hanno limitato armamentario di strumento per motivi di studio. Inoltre, questi fegato-derivate organoids derivati da cellule staminali di adulti non modellare extrahepatic colangiociti ma piuttosto intraepatico colangiociti.
Generazione di organoid EHBD è stato segnalato da umano normale EHBDs14 e mouse EHBD colangiocarcinoma15. Tuttavia, accesso ai tessuti umani EHBD è estremamente limitato e organoids derivata da un modello genetico murino di colangiocarcinoma15 non rappresentano dei colangiociti sano biologia all'omeostasi e sono derivati dalle cellule geneticamente modificate.
Per risolvere le limitazioni di pluripotent derivati da cellule staminali e fegato dei colangiociti organoid modelli e l'accesso limitato ai tessuti umani necessari in modelli preclinici, abbiamo sviluppato un modello murino di organoid EHBD (Figura 1A). Questo manoscritto descrive lo sviluppo di una tecnica per mouse organoids EHBD-derivate da tessuto adulto. Questi organoids EHBD denominato EHBDOs sarà un importante strumento in vitro per lo studio dei meccanismi alla base di EHBDs dei colangiociti omeostasi e processi di malattia, come ad esempio cholangiopathies.

<table><tbody><tr><td><forte>L-WRN terreno per colture cellulari</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>1%</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Tampone di lavaggio</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td> <td>50 mL</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>125 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Amfotericina B&nbsp;</td><td>6.25 &micro; g/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td></tr><tr><td>Terreno di coltura per organoidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Terreno condizionato&nbsp;</td><td>1:1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>1:1</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>100 U/mL</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td></tr><tr><td>N-Glutammina</td><td>10 &; l/mL</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td></tr><tr><td>N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico, HEPES</td><td>10 mM</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td></tr><tr><td>B27</td><td>10 &; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td></tr><tr><td>N2</td><td>10 &micro; l/mL</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td>Terreno di semina per organoidi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura per organoidi&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico (EGF)</td><td>50 ng/mL</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-10 (FGF10)</td><td>100 ng/mL</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td></tr><tr><td>Anticorpi primari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Citocheratina 19 (CK19), Coniglio</td><td>1:250</td><td>Abcam</td><td>ab53119</td></tr><tr><td>Regione determinante il sesso Anticorpo Y-Box 9 (SOX9), Anticorpo Coniglio</td><td>1:200</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20095</td></tr><tr><td>Anticorpo Pancreatic Duodenal Homeobox 1 (PDX1), Anticorpo</td> E-caderina <td>Rabbit 1:2000</td><td>DSRB</td><td>F109-D12</td></tr>, <tr><td>Anticorpo E-caderina Capra</td><td>1:500</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-31020</td></tr><tr><td>Acetilato,</td> Anticorpi <td></td><td></td><td></td> secondari Sigma-Aldrich T6793 Mouse 1:500 Sigma-Aldrich T6793</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 marcato anti-coniglio, Donkey IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td></tr><tr><td>594 marcato anti-capra, Donkey IgG</td><td>1:1000</td><td>Invitrogen</td><td>A-11058</td></tr><tr><td>568 marcato anti-topo, Goat IgG2b</td><td>1:500</td><td>Invitrogen</td><td>A-21144</td></tr><tr><td>TopFlash Wnt reporter assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TopFlash HEK293 cell line</td><td></td><td>Kit</td><td></td></tr><tr><td></td><td>per il dosaggio della luciferasi</td> ATCC CRL-1573 <td>Biotium</td><td>30003-2</td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue Solution</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td></tr><tr><td>Materiali e reagenti aggiuntivi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice basale, senza fenoli Matrigel</td><td></td><td>CORNING</td><td>356237</td></tr><tr><td>Tampone di dissociazione, Accutase</td><td></td><td>Gibco</td><td>A1110501</td></tr><tr><td>Terreno di congelamento per colture cellulari, Recovery</td><td></td><td>Life Technologies</td><td>12648010</td></tr><tr><td>Filtro cellulare (70 &; micro; Fisherbrand</td><td></td> <td>22363548</td>Estrazione di RNA tiocianato-fenolo guanidinio, TRIzol Invitrogen 15596026 Gel per la lavorazione dei campioni, HistoGel Thermo Fisher Scientific HG-4000-012 Kit universale per il rilevamento del micoplasma ATCC 30-1012K Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL Fisherbrand <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>05-408-129</td></tr><tr>Piastra <td></td><td>da 24 pozzetti</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7524</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga conica da 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td>Microscopio a fluorescenza Nikon Eclipse E800 Microscopio invertito Biotium 30003-2 Vassoio per necroscopia Fisherbrand 13-814-61 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione dei organoids da dotti biliari extrahepatic mouse

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, che interessano i dotti biliari extrahepatic (EHBDs), includono atresia biliare, colangite sclerosante primitiva e colangiocarcinoma. Non hanno nessuna opzione terapeutica efficace. Strumenti per studiare EHBD sono molto limitati. Il nostro scopo era di sviluppare un modello dei colangiociti preclinici, derivati da cellule staminali organo-specifiche, versatile, adulto che può essere facilmente generato da wild type e topi geneticamente modificati. Quindi, segnaliamo sulla nuova tecnica di sviluppare un sistema di coltura EHBD organoid (EHBDO) da EHBDs di topo adulto. Il modello è costo-efficiente, in grado di essere facilmente analizzati, e ha molteplici applicazioni a valle. In particolare, descriviamo la metodologia di isolamento EHBD mouse e dissociazione singola cella, organoid cultura iniziazione, propagazione e mantenimento a lungo termine e deposito. Questo manoscritto descrive anche EHBDO elaborazione per immunoistochimica, microscopia fluorescente e quantificazione di abbondanza del mRNA da reazione a catena della polimerasi in tempo reale di trascrizione d'inversione quantitativa (qRT-PCR). Questo protocollo ha significativi vantaggi oltre a produrre organoids EHBD specifici. L'uso di un medium condizionato dalle cellule L-WRN riduce significativamente il costo di questo modello. L'uso del mouse EHBDs fornisce quasi illimitato del tessuto per la generazione di cultura, a differenza di tessuto umano. EHBDOs del mouse generati contengono una popolazione pura di cellule epiteliali con marcatori del progenitore endodermico e biliare cellule differenziate. Colta organoids mantenere omogenea morfologia attraverso passaggi multipli e possono essere recuperate dopo un lungo periodo di conservazione in azoto liquido. Il modello consente lo studio di proliferazione delle cellule progenitrici biliare, può essere manipolato farmacologicamente e può essere generato da topi geneticamente modificati. Gli studi futuri sono necessari per ottimizzare le condizioni di coltura al fine di aumentare l'efficienza di placcatura, valutare la maturità funzionale delle cellule e differenziazione cellulare diretto. Sviluppo di modelli di co-coltura e una matrice extracellulare più biologicamente neutra sono anche auspicabile.

Il nostro protocollo descrive la generazione di mouse EHBD organoids che sono tessuto-specifici e adulto derivati da cellule staminali. Dopo il organoids sono coltivate, una formazione di struttura cistica può essere osservata più presto 1 giorno dopo l'isolamento EHBD. Contaminazione con i fibroblasti non è osservata tipicamente durante la generazione di cultura. EHBDO efficienza di placcatura è di circa il 2% quando isolato da neonatale o adulto (età superiore a 2 mesi) topi (<strong cl...

Questo protocollo descrive la produzione di un sistema di 3-dimensionale organoid del mouse dei dotti biliari extrahepatic. Questi organoids biliare può essere mantenute in coltura per studiare biologia dei colangiociti. Organoids biliare esprimono marcatori di cellule progenitrici e cellule biliari e sono composte da cellule epiteliali polarizzate.

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Questo sistema organoide del condotto biliare extraepatico murino può affrontare il limitato accesso ai modelli di colangiopatie precliniche e i limiti dei modelli organoidi di cellule staminali pluripotenti e corigiociti derivati dal fegato. Il nostro modello è specifico per i tessuti adulti, riduzionista, riproducibile ed efficiente in termini di tempo e costi. Sarà di particolare beneficio per i laboratori che non hanno accesso ai tessuti umani.La nostra tecnica consente la coltivazione di un numero quasi illimitato di conlangiociti del condotto biliare extraepatico per studiare la rigenerazione dei tessuti e le interazioni cellula-cellula. A dimostrare la procedura sarà Junya Shiota, un post-doc del mio laboratorio. Per l'isolamento intraepatico del condotto biliare, posizionare il topo adulto in posizione supina e aprire la cavità addominale lungo la linea mediana.Ritrarre il fegato per riposare sul diaframma e utilizzare un emostato per estrarre delicatamente il duodeno prossimale per rivelare il condotto biliare comune immediatamente sotto l'hilum epatico. Utilizzare un bisturi per separare il condotto biliare extraepatico dai tessuti circostanti. Tenendo l'estremità prossimale del condotto biliare comune con le forcep, sezionare il condotto distally appena sopra la sua congiuntura con il duodeno prima di sezionare l'estremità prossimale del condotto dal fegato.Posizionare immediatamente il condotto biliare extraepatico isolato in una piastra di vetro contenente tampone di lavaggio freddo sul ghiaccio, quindi pulire il condotto biliare dal tessuto circostante e tritare in sezioni di 0,5 millimetri. Quando tutto il tessuto è stato tritato, trasferire le sezioni in un tubo contenente 500 microlitri di tampone di dissociazione per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della dissociazione, neutralizzare il tampone con 500 microlitri di terreno di coltura delle cellule ghiacciate e triturare la sospensione tissutale 20 volte attraverso un ago calibro 18 e quindi 20 volte attraverso un ago calibro 20.Quindi filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Per stabilire una coltura organoide biliare, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimuovere con cura il supernatante. Rimorsi il pellet in un millilitro di PBS sterile e ghiacciato e trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri per una seconda centrifugazione.Rimostrare il pellet lavato in 120 microlitri di matrice seminterrata liqueficata e ghiacciata e piastra 40 microlitri di cellule al centro di ciascuno dei tre pozzi di una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius e 24 po ', quindi posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale di 37 gradi Celsius per circa 15 minuti. Quando la matrice del seminterrato si è solidificata, aggiungere 600 microlitri di 37 gradi Celsius mezzo di semina ad ogni pozzo prima di restituire la piastra all'incubatore. Dopo tre giorni e tre giorni dopo, sostituire il mezzo di semina con 600 microlitri di mezzo di coltura organoide fresco, monitorando regolarmente la crescita organoide con un microscopio invertito.Per passare le colture extraepatiche del condotto biliare, pipettare gli organoidi in ogni pozzo con 400 microlitri di PBS ghiacciato 10 volte per pozzo prima di trasferire il contenuto del pozzo su singoli tubi da 1,5 millilitri. Passare ogni miscela attraverso un ago calibro 25 quattro volte per dissociare gli organoidi e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi rimospendare le celle nella matrice del seminterrato al rapporto appropriato per la ri-placcatura.Per la conservazione organoide del condotto biliare extraepatico a lungo termine, lavare ogni pozzo di organoidi con PBS a temperatura ambiente senza disturbare le gocce della matrice del seminterrato e aggiungere 500 microlitri di mezzo gelido ghiacciato ad ogni pozzo. Rimostrare delicatamente gli organoidi e trasferire la miscela in singole fiale criogeniche, quindi posizionare le fiale a meno 80 gradi Celsius per 48 ore prima di trasferire gli organoidi in un serbatoio di azoto per lo stoccaggio a lungo termine in una fase di vapore. Per preparare gli organoidi per l'incorporamento della paraffina, sostituire il mezzo con 500 microlitri di quattro gradi Celsius PBS e trasferire la sospensione da ogni pozzo in singoli tubi da 1,5 millilitri contenenti matrice seminterrata liquefatta.Raccogliere gli organoidi per centrifugazione e utilizzare una punta di pipetta P1000 modificata per rimuovere con cura i supernatanti senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo, paraformaldeide al 4% agli organoidi per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, sostituire il fissatore con un millilitro di PBS a temperatura ambiente per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e lavare gli organoidi con centrifugazione tre volte.Dopo l'ultimo lavaggio, resuspend gli organoidi in un millilitro di 30% di etanolo per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, seguita da un'incubazione di cinque minuti in un millilitro di 70% di etanolo a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione del 70% di etanolo, raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione e rimosorne gli organoidi in un millilitro di etanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione al 100% di etanolo, il gel di lavorazione del campione di calore in un forno a microonde per 20 secondi o fino a quando non viene liquefatto e aggiungere 50 microlitri del gel liquefatto a ciascun tubo di organoidi.Posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando il gel di lavorazione del campione non viene solidificato e trasferire la goccia di organoidi da ciascun tubo a tra i cuscinetti di spugna blu in una cassetta per un'ulteriore lavorazione nell'incorporatore di paraffina. Posizionare la cassetta in un processore tissutale programmato per 15 minuti per passaggio, quindi sessare gli organoidi incorporati nella paraffina nel gel di lavorazione del campione a quattro micrometri per sezione per la colorazione e l'analisi immunoistochimica secondo protocolli standard. L'efficienza di placcatura organoide del condotto biliare extraepatico è di circa il 2% se isolata da topi neonatale o adulto.Dopo il secondo passaggio, l'efficienza di placcatura degli organoidi del condotto biliare extraepatico derivati da topi adulti aumenta all'11% e rimane stabile. La maggior parte degli organoidi dimostra una morfologia cistica in tutti i passaggi con rari organoidi irregolari. Gli organoidi raggiungono un picco di crescita da cinque a sette giorni, dopo di che iniziano ad accumulare detriti intraluminali e si deteriorano.Pertanto, per il mantenimento della coltura organoide, gli organoidi devono essere divisi ogni sette-10 giorni. Se analizzati con immunofluorescenza, gli organoidi del condotto biliare extraepatico consistono in una popolazione pura di cellule epiteliali marcate da E-cadherina. Le cellule organoidi dimostrano anche marcatori di cellule progenitrici biliari e marcatori di differenziazione biliare.È importante sottolineare che un'alta percentuale di cellule organoidi possiede un cilio primario segnato da alfa tubulina acetilata, che è una caratteristica dei normali corilangiociti e suggerisce un'appropriata polarizzazione delle cellule organoidi. È necessaria una stretta aderenza alla condizione di temperatura descritta. La meticolosa dissezione del condotto biliare previene la contaminazione delle cellule del pancreas.La perdita di materiale cellulare può essere evitata con un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione. Questi organoidi possono essere usati come modelli preclinici, geneticamente e farmacologicamente manipolati, o utilizzati per testare farmaci e gli effetti degli agenti infettivi. Questo metodo può essere utilizzato da laboratori che vogliono sfruttare modelli di topi geneticamente modificati per studiare ulteriormente i meccanismi della biologia dei conlangiociti.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Una tecnica per isolare colangiociti dai dotti biliari extraepatici di topi neonati è descritto. I condotti sono meticolosamente sezionato, e poi le cellule sono isolate da escrescenza in gel di collagene di spessore. Questo metodo fornisce un utile strumento per lo studio dello sviluppo del dotto biliare extraepatico e patologia.

Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

Il metodo di coltura tridimensionale descritto in questo protocollo ricapitola sviluppo pancreas dispersi da progenitori topo pancreas embrionali, compresa la loro notevole espansione, differenziazione e morfogenesi in un organo ramificato. Questo metodo è suscettibile di immagini, interferenze funzionali e manipolazione della nicchia.

In Vitro Pancreas Organogenesis da dislocati embrionali di topo Progenitori

Vi presentiamo un metodo piuttosto semplice e sensibile per la quantificazione accurata della densità del condotto biliare nel fegato del topo. Questo metodo può aiutare a determinare gli effetti dei modificatori genetici e ambientali e l'efficacia delle potenziali terapie nei modelli murini delle malattie biliari.

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Mostriamo un metodo per la necropsia e la dissezione dei modelli di cancro alla prostata del topo, concentrandosi sulla dissezione del tumore alla prostata. Viene inoltre presentato un protocollo passo-passo per la generazione di organoidi tumorali della prostata del topo.

Generazione di organidi tumorali da modelli murini geneticamente ingegnerizzati del cancro alla prostata

I sistemi cellulari tridimensionali (3D) sono modelli rilevanti per lo studio dell'organogenesi. Viene proposto un metodo a base di idrogel per la produzione di cisti biliari e la loro caratterizzazione. Questo protocollo svela le barriere della caratterizzazione 3D, con un metodo semplice e affidabile per valutare l'efficienza di formazione delle cisti, le dimensioni e testarne la funzionalità.

Generazione e caratterizzazione quantitativa di cisti epiteliali biliari funzionali e polarizzate

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Per l'osservazione dei disturbi del dotto biliare neonatale murino, sono necessari un dotto biliare intatto e una preparazione efficiente. Pertanto, è stato sviluppato con successo un nuovo approccio per isolare l'intero sistema dei dotti biliari extraepatici nei neonati murini mantenendo l'integrità del dotto biliare.

Dotto biliare extraepatico e dissezione della cistifellea nei neonati di topo di nove giorni

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Gli organoidi generati dai tumori dei pazienti vengono iniettati ortotopicamente nel fegato del topo. La resezione del tessuto epatico non tumorale porta a un ambiente rigenerativo nel tessuto epatico in cui si trova il tumore.

Un modello di xenotrapianto di organoidi derivato da pazienti con carcinoma epatocellulare per studiare l'impatto della rigenerazione epatica sulla crescita del tumore

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Impara a generare organoidi biliari extraepatici da topi adulti per studiare la biologia dei colangiociti. Questo metodo riproducibile e conveniente consente di coltivare un numero quasi illimitato di cellule per ricerche su rigenerazione tissutale.

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

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