Name: Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula allinterno di vescicoli giganti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri la coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti utilizzando il metodo di trasferimento a goccia. Questa tecnica consente l'osservazione diretta della crescita batterica in microbiologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un'iniziativa leader per eccellenti giovani ricercatori (LEADER, n. 16812285) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone, un Grant-in-Aid per la ricerca sui giovani scienziati (n. 18K18157, 16K21034) dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) a M.M., e Grant-in-Aid da MEXT a K.K. (n. 17H06417, 17H06413).

1. Preparazione di GV contenenti cellule batteriche con il metodo di trasferimento goccia
<ol><li>Preparare soluzioni di riserva lipididiche di 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC, 10 mM, 1 mL) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleglycol)-2000] (biotin-PEG-DSPE, 0,1 mM, 1 mL) in cloroformio/ soluzione di metanolo (2/1, v/v) e conservare il brodo a -20 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparazione di una soluzione di olio contenente lipidi
	<ol>
<li>Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (Figura1b (i)).</li>
		<li>Evaporare il solvente organico per flusso d'aria per formare una pellicola lipida e posizionare la pellicola in un desiccatore per 1 h per far evaporare completamente il solvente organico (Figura1b (ii)). NOT:</</c4> È necessario far evaporare il solvente organico in un cappuccio fumatore.</li>
		<li>Aggiungere alla fiala del vetro 200 - L di olio minerale (0,84 g/mL, tabella deimateriali) alla fiala di vetro (Figura 1b (iii)).</li>
		<li>Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con pellicola e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 h (Figura1b iii )). Le concentrazioni finali di POPC e biotina-PEG-DSPE sono rispettivamente di 1 mM e 0,002 mM.</li>
	</ol></li>
	<li>Pre-coltura di cellule batteriche
	<ol>
<li>Inoculare E. coli in 1x LB medio (1 g di estratto di lievito, 2 g di bacto tryptone, e 2 g di cloruro di sodio in 200 mL di acqua deionizzata) da una piastra LB e incubare a 37 gradi centigradi per 12-14 h (peruna pernotata).</li>
		<li>Dopo l'incubazione, raccogliere 20 l della soluzione di coltura e trasferire a 1,98 mL di mezzo fresco 1x LB, e ricolturare le cellule per 2 h.</li>
		<li>Controllare la densità ottica a 600 nm (OD600) valore della soluzione di pre-coltura (preparata nel passaggio 1.3.2). Deve essere utilizzata una soluzione pre-cultura di OD600 - 1,0 – 1,5.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione delle soluzioni acquose esterne e interne dei GV
	<ol>
<li>Sciogliere il glucosio in 1x lB medio per preparare una soluzione acquosa esterna di GV. Preparare 20 mL di una soluzione di glucosio a scorta (500 mM).</li>
		<li>Diluire la soluzione di glucosio stock con 1x LB medio a 200 mM (Tabella 1).</li>
		<li>Sciogliere il saccarosio in 1 x lb medio per preparare una soluzione acquosa interna di GV. Preparare 20 mL di una soluzione di saccarosio di riserva (500 mM).</li>
		<li>Mescolare la soluzione di pre-coltura (OD600 - 1,0–1,5), la soluzione di saccarosio (500 mM) e il supporto 1x LB (tabella1). Il valore finale oD600 della soluzione di coltura deve essere 0,01–0,015 e la concentrazione finale di saccarosio dovrebbe essere 200 mM. NOT:</</c6> Fare attenzione a evitare la pressione osmotica. È necessario bilanciare la concentrazione tra la soluzione acquosa interna ed esterna.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di goccioline acqua-in-olio (W/O) contenenti cellule batteriche
	<ol>
<li>Aggiungete 2 -L della soluzione acquosa interna dei GV (preparati al punto 1.4.4) a 50 -L della soluzione di olio contenente lipidi (olio minerale con POPC e biotina-PEG-DSPE) in un tubo di plastica laidded da 0,6 mL (Figura1b (iv)).</li>
		<li>Emulsionare i due componenti nel tubo di plastica toccando il tubo a mano (Figura1b (v)).</li>
	</ol></li>
	<li>Formazione di GV contenenti cellule batteriche
	<ol>
<li>Aggiungere 50 l di soluzione esterna abossesy dei GV (preparati al punto 1.4.2) in un tubo di plastica con coperchio da 1,5 ml (Figura1b (vi)) e strato delicatamente 150 l della soluzione ad olio contenente lipidi (olio con POPC e biotina-PEG-DSPE) sulla superficie dell'esterno acquoso (Figura1b (vii)). Incubare questo campione a temperatura ambiente (RT, 25 gradi centigradi) per 10-15 min. Verificare che l'interfaccia dell'olio e le soluzioni acquose siano piatte.</li>
		<li>Aggiungere 50 l della soluzione di gocciolina W/O (preparata al punto 1.5.2) sull'interfaccia dell'olio e soluzione acquosa utilizzando una pipetta (Figura1b (viii)).</li>
		<li>Centrifugare il tubo di plastica coperchiato 1,5 mL (dal punto 1.6.2) per 10 min a 1.600 x g a RT in una centrifuga desktop (Figura 1b (ix)). Dopo la centrifuga, aspirare l'olio (strato superiore) dal tubo di plastica scartato da 1,5 ml usando una pipetta e raccogliere i GV contenenti cellule batteriche (Figura 1b (x)).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione di un sistema di osservazione GV (sistema di coltura cellulare batterica)
<ol><li>
Preparazione di piccole vesciche (SV) per constructi ng a membrana bistrato supportato
	<ol>
<li>Versare in un tubo di vetro 20 - L della soluzione POPC e 4 -L della soluzione biotina-PEG-DSPE (utilizzando la stessa composizione lipidica utilizzata per la preparazione del GV nel passaggio 1.1).</li>
		<li>Evaporare il solvente organico per flusso d'aria per formare una pellicola lipida e mettere questo campione in un desiccatore per 1 h per far evaporare completamente il solvente organico.</li>
		<li>Aggiungere alla fiala di vetro 200 ml di glucosio 200 mM nel mezzo 1x LB (la soluzione acquosa esterna dei gV).</li>
		<li>Avvolgere la parte iniziale della fiala di vetro con pellicola e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni (120 W) per almeno 1 h.</li>
		<li>Preparare gli SV con il metodo di estrusione21 utilizzando una membrana mini-estrusore e policarbonato con dimensioni dei pori di 100 nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di una camera fatta a mano
	<ol>
<li>Forare un foro di 7 mm con un punzone cavo su una guarnizione a doppia faccia (10 mm x 10 mm x 1 mm).</li>
		<li>Incollare la guarizione bifronte con il foro su un vetro di copertura (30 mm x 40 mm, spessore 0,25–0,35 mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparazione di una membrana bistrato supportata sul vetro di copertura nel foro della camera
	<ol>
<li>Aggiungere 30 l della soluzione SV al foro della camera (preparato nella sezione 2.2) e incubare RT per 30 min.</li>
		<li>Lavare delicatamente il foro due volte con 20 x L di 1x lB medio contenente 200 m di glucosio (la soluzione esterna acquosa dei GV) mediante pipettaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immobilizzazione dei membrana bistrato supportato sul vetro di copertura nel foro della camera
	<ol>
<li>Introduci 10 L di neutravidina con la soluzione aquessa esterna dei GV (1 mg/mL) nel foro e incuba a RT per 15 min.</li>
		<li>Lavare delicatamente il foro due volte con 20 x L di 1x lB medio contenente 200 m di glucosio (la soluzione esterna acquosa dei GV) mediante pipettaggio.</li>
		<li>Aggiungere tutta la soluzione contenente i GV (preparati al punto 1.6.3) nel foro della camera e sigillare con un vetro di copertura (18 mm x 18 mm, spessore 0,13–0,17 mm) (Figura 2b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Osservazione microscopica della crescita delle cellule batteriche all'interno dei GV
	<ol>
<li>Impostare un microscopico sistema di fase di riscaldamento con un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad apertura numerica 40x/0.6 (NA) con una lunga distanza di lavoro (Figura 2b).</li>
		<li>Posizionare la camera sul sistema di fase di riscaldamento microscopico (Figura 2b). Incubare i GV contenenti cellule batteriche nella camera in una condizione statica per 6 h a 37 .</li>
		<li>Cattura e registra immagini al microscopio della crescita delle cellule batteriche all'interno di GV ogni 30 min utilizzando una telecamera scientifica a semiconduttore di ossido di metallo complementare (sCMOS).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307, 1962-1965 (2005).</li>
<li>Eldar, A., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+for+noise+in+genetic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional roles for noise in genetic circuits.</a> Nature. 467, 167-173 (2010).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-driven+growth+rate+gain+in+clonal+cellular+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Noise-driven growth rate gain in clonal cellular populations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3251-3256 (2016).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Vincent, M. E., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+confinement+of+single+cells+of+bacteria+in+small+volumes+initiates+high-density+behavior+of+quorum+sensing+and+growth+and+reveals+its+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Microfluidic confinement of single cells of bacteria in small volumes initiates high-density behavior of quorum sensing and growth and reveals its variability.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48, 5908-5911 (2009).</li>
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<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (51), 17669-17674 (2004).</li>
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<li>Chowdhuri, S., Cole, C. M., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+Living+Cells+within+Giant+Phospholipid+Liposomes+Formed+by+the+Inverse-Emulsion+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of Living Cells within Giant Phospholipid Liposomes Formed by the Inverse-Emulsion Technique.</a> ChemBioChem. 17, 886-889 (2016).</li>
<li>Morita, M., Katoh, K., Noda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+bacterial+growth+in+giant+unilamellar+vesicles%3A+a+novel+tool+for+bacterial+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Direct observation of bacterial growth in giant unilamellar vesicles: a novel tool for bacterial cultures.</a> ChemistryOpen. 7, 845-849 (2018).</li>
<li>Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Unilamellar+Vesicles+Using+an+Inverted+Emulsion%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion.</a> Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).</li>
<li>Hope, M. J., Bally, M. B., Webb, G., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+unilamellar+vesicles+by+a+rapid+extrusion+procedure.+Characterization+of+size+distribution%2C+trapped+volume+and+ability+to+maintain+a+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure. Characterization of size distribution, trapped volume and ability to maintain a membrane potential.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 812, 55-65 (1985).</li>
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<li>Kurokawa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cytoskeleton+for+stabilizing+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">DNA cytoskeleton for stabilizing artificial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 7228-7233 (2017).</li>
<li>Nourian, Z., Roelofsen, W., Danelon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggered+gene+expression+in+fed-vesicle+microreactors+with+a+multifunctional+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Triggered gene expression in fed-vesicle microreactors with a multifunctional membrane.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 3114-3118 (2012).</li>
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<li>Trantidou, T., Dekker, L., Polizzi, K., Ces, O., Elani, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalizing+cell-mimetic+giant+vesicles+with+encapsulated+bacterial+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">Functionalizing cell-mimetic giant vesicles with encapsulated bacterial biosensors.</a> Interface Focus. 8, 20180024(2018).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, descriviamo un metodo per coltivare le cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno dei GV. Questo semplice metodo prevede la formazione di GV contenenti cellule batteriche a livello di singola cellula utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole. Rispetto ad altri approcci per ottenere GV contenenti cellule batteriche, questo metodo presenta due vantaggi: (i) è facile da sviluppare e (ii) è necessario un piccolo volume (2 -L) della soluzione campione per preparare i GV. Il metodo di trasferi...

La coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula ha ricevuto una crescente attenzione. Coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di uno spazio ristretto può chiarire le funzioni batteriche come la variabilità fenotipica1,2,3,4, il comportamento cellulare5, 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9, e resistenza agli antibiotici10,11. A causa dei recenti progressi nelle tecniche di coltura, la coltura di singoli batteri può essere raggiunta all'interno di uno spazio confinato, come in un pozzo4,7,8, goccia di gel12,13 e gocciolatore acqua in olio (W/O)5,11. Per promuovere la comprensione o l'utilizzo di singole cellule batteriche, sono necessari ulteriori sviluppi tecnici delle tecniche di coltivazione.
Le vescicole che imitano la membrana cellulare biologica sono compartimenti sferici costituiti da molecole anfifile e possono contenere vari materiali. Le vesciche sono classificate in base alle dimensioni e includono piccole vesciche (SV, diametro < 100 nm), grandi vescicle (LV, <1 m) e vescicle giganti (GV, >1 m). SV o LV sono comunemente utilizzati come portatori di droga a causa della loro affinità con la membrana cellulare biologica14. I GV sono stati utilizzati anche come sistema di reattori per la costruzione di protocelle15 o cellule artificiali16. L'incapsulamento di cellule biologiche in GV è stato segnalato17,18, e quindi i GV mostrano il potenziale come sistema di coltura cellulare quando combinati con il sistema del reattore.
Qui, insieme a un video di procedure sperimentali, descriviamo come i GV possono essere utilizzati come nuovi vasi di coltura cellulare19. I GV contenenti batteri sono stati realizzati con il metodo di trasferimento delle goccioline20 e sono stati poi immobilizzati su una membrana supportata su un vetro di copertura. Abbiamo usato questo sistema per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula all'interno dei GV in tempo reale.

<table><tbody><tr><td>Bactotryptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>032-21921</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura (18 &volte; 18 mm)</td><td>Matsunami Vetro Ind.</td><td>C018181</td><td>spessore 0,13&ndash; 0,17 mm</td></tr><tr><td>Vetro di copertura (30 & 40 mm)</td><td>Vetro Matsunami Ind.</td><td>Spessore dell'ordine personalizzato</td><td>0,25 ... Centrifuga da tavolo da 0,35 mm</td></tr><tr><td></td><td>Hi-Tech Co.</td><td>ATT101</td><td>tipo di rotore oscillante</td></tr><tr><td>Guarnizione bifacciale (10 & volte; 10 &volte; 1 mm)</td><td>Nitoms</td><td>T4613</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di vetro</td><td>AS ONE</td><td>6-306-01</td><td>Tubo di fermentazione Durham</td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>049-31165</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>IX-73</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>133-16771</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di riscaldamento microscopico</td><td>TOKAI HIT</td><td>TP-110R-100</td><td></td></tr><tr><td>Olio minerale</td><td>Nacalai Tesque</td><td>23334-85</td><td></td></tr><tr><td>Mini-estrusore</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Olympus</td><td>LUCPLFLN 40&times;/0.6 NA</td><td></td></tr><tr><td>Membrane in policarbonato</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005</td><td>dimensione dei pori 100 nm</td></tr><tr><td>telecamera sCMOS</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 plus</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Wako Pure Chemicals</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>AS ONE</td><td>ASU-3D</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Biosciences</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in plastica con coperchio da 0,6 mL</td><td>Watson</td><td>130-806C</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in plastica con coperchio da 1,5 mL</td><td>Sumitomo Bakelite Co.</td><td>MS4265-M</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocolina</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td>POPC</td></tr><tr><td>1,2-distearoil-snglycero-3-fosfoethanolamine-N-[biotinil(polietilenglicole)-2000]</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129P</td><td>Biotin-PEG-DSPE</td></tr></tbody></table>

coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

Bacterial Cell Culture at the Single-cell Level Inside Giant Vesicles

Abbiamo sviluppato un metodo per coltivare cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti (GV). La coltura delle cellule batteriche è importante per comprendere la funzione delle cellule batteriche nell'ambiente naturale. A causa dei progressi tecnologici, varie funzioni delle cellule batteriche possono essere rivelate a livello di singola cellula all'interno di uno spazio confinato. I GV sono compartimenti sferici di micro-dimensioni composti da molecole lipidiche anfifili e possono contenere vari materiali, comprese le cellule. In questo studio, una singola cellula batterica è stata incapsulata in 10-30 GV con il metodo di trasferimento delle goccioline e i Env contenenti cellule batteriche sono stati immobilizzati su una membrana supportata su un substrato di vetro. Il nostro metodo è utile per osservare la crescita in tempo reale di singoli batteri all'interno dei GV. Abbiamo coltivato cellule di Escherichia coli (E. coli) come modello all'interno di GV, ma questo metodo può essere adattato ad altri tipi di cellule. Il nostro metodo può essere utilizzato nei campi scientifici e industriali della microbiologia, della biologia, della biotecnologia e della biologia sintetica.

Presentiamo un metodo semplice per generare GV contenenti singole cellule batteriche utilizzando il metodo di trasferimento delle gocciole (Figura 1). La figura 1a mostra un'immagine schematica della precipitazione di GV contenenti batteri. Le goccioline W/O contenenti batteri vengono trasferite attraverso l'interfaccia olio-acqua (strato di lipidi) dalla centrifugazione per formare i GV. La differenza di densità tra il saccarosi...

Dimostriamo la coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicoli giganti (GV). I GV contenenti cellule batteriche sono stati preparati con il metodo di trasferimento delle goccioline e sono stati immobilizzati su una membrana sostenuta su un substrato di vetro per l'osservazione diretta della crescita batterica. Questo approccio può anche essere adattabile ad altre cellule.

Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

We developed a method for culturing bacterial cells at the single-cell level inside giant vesicles (GVs). Bacterial cell culture is important for ...

Questo protocollo fornisce un mezzo per coltivare cellule batteriche a livello di una singola cellula all'interno di vescicole giganti. È facile sviluppare le vescicole giganti e per preparare le vescicole è necessario solo un volume molto piccolo di soluzione campione. A dimostrare la procedura sarà Yuri Ota, dottorando del nostro laboratorio.Inizia aggiungendo 20 microlitri di soluzione POPC appena preparata e quattro microlitri di soluzione biotina-PEG-DSPE appena preparata a una fiala di vetro. Evaporare il solvente organico per flusso d'aria fino a formare un film lipidico. Mettere il film in un essiccatore per un'ora per evaporare completamente il solvente organico.Quindi aggiungere 200 microlitri di olio minerale al flaconcino. Coprire l'apertura del flaconcino con pellicola di paraffina di plastica e sonicare il contenuto del flaconcino in un bagno ad ultrasuoni a 120 watt per almeno un'ora. Per una piccola preparazione di vescicola, creare un film lipidico, come appena dimostrato, e aggiungere 200 microlitri di glucosio di 200 millimetri nel mezzo LB al film.Quindi sonicare il film a 120 watt per almeno un'ora, seguito dall'estrusione delle vescicole giganti risultanti in piccole vescicole usando un mini estrusore e una membrana in policarbonato con una dimensione dei pori di 100 nanometri. Per la precoltura delle cellule batteriche, inoculare E.coli da una piastra LB in millilitri di mezzo LB per una coltura notturna a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, trasferire 20 microlitri del supernatante della coltura a 1,98 millilitri di mezzo LB fresco per altre due ore di coltura.Al termine dell'incubazione, controllare la densità ottica a 600 nanometri, o valore OD 600, della soluzione pre-coltura su uno spettrofotometro. Deve essere utilizzata una soluzione pre-coltura con OD 600 da uno a 1,5. Quindi mescolare la soluzione pre-coltura con soluzione di saccarosio preparata al momento e mezzo LB fresco, secondo la tabella uno.Per la formazione di vescicole giganti, aggiungere 50 microlitri di una soluzione acquosa esterna preparata al momento di vescicole giganti a un tubo di plastica lidded da 1,5 millilitri. Strato delicato 150 microlitri della soluzione di olio contenente lipidi sulla soluzione acquosa esterna di vescicole giganti. Incubare la soluzione risultante per 10-15 minuti a temperatura ambiente, prima di verificare che l'interfaccia dell'olio e delle soluzioni acquose sia piatta.Per le cellule batteriche dell'acqua e dell'olio contenenti formazione di goccioline, aggiungere due microlitri di una soluzione acquosa interna appena preparata di vescicole giganti a 50 microlitri della soluzione di olio sonicato contenente lipidi in un tubo di plastica lidded da 0,6 millilitri. Quindi, toccare il tubo per emulsionare i due componenti. Successivamente, utilizzare una pipetta per aggiungere 50 microlitri di acqua e soluzione di goccioline di olio all'interfaccia dell'olio e della soluzione acquosa e sedimentare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche mediante centrifugazione.Quindi aspirare lo strato superiore di olio e raccogliere le vescicole giganti. Per preparare una camera fatta a mano, praticare un foro di sette millimetri con un punzone cavo su una guarnizione a doppia faccia da 10 per 10 per un millimetro, quindi incollare la guarnizione a doppia faccia su un vetro di copertura da 30 per 40 millimetri. Per preparare una membrana bistrato supportata, aggiungere 30 microlitri della piccola soluzione di vescicola al foro della camera fatta a mano.Incubare le vescicole a temperatura ambiente per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di mezzo LB, integrati con glucosio da 200 millimiller. Per immobilizzare vescicole giganti sulla membrana bistrato del sostenitore, introdurre 10 microlitri di neutravidina nella soluzione di vescicola gigante acquosa esterna al foro per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente.Al termine dell'incubazione, lavare delicatamente il foro due volte con 20 microlitri di mezzo LB, integrati con glucosio da 200 millimiller, e aggiungere l'intero volume di soluzione vescicolare gigante al foro nella camera. Quindi sigillare il foro con un vetro di copertura da 18 a 18 millimetri. Per monitorare la crescita batterica all'interno delle vescicole giganti, selezionare l'obiettivo 40X su un microscopio invertito e posizionare la camera sul sistema di stadio di riscaldamento del microscopio.Quindi incubare le vescicole giganti contenenti cellule batteriche nella camera in condizioni statiche per sei ore a 37 gradi Celsius, catturando e registrando immagini della crescita delle cellule batteriche ogni 30 minuti, con la telecamera scientifica complementare a semiconduttore di ossido di metallo. Le vescicole giganti contenenti cellule batteriche in genere variano da 10 a 30 micrometri. Per entrambe le dimensioni delle vescicole giganti, le cellule E.coli subiscono processi di allungamento e divisione, con alcune cellule E.coli che crescono fino a raggiungere un numero molto elevato di cellule durante il periodo di osservazione di sei ore.La frequenza relativa delle vescicole giganti contenenti un singolo livello cellulare è circa il 10% delle vescicole giganti ottenute, e le vescicole giganti incapsulate a livello di singola cellula sono circa il 50% delle vescicole giganti contenenti cellule batteriche. La stabilità dell'interfaccia olio-acqua è importante per ottenere vescicole giganti contenenti cellule batteriche. Fare attenzione ad aspirare l'olio con attenzione prima della correzione gigante della vescicola.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltura delle cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di singole vescicole giganti. Il nostro metodo di coltura batterica è un nuovo strumento in microbiologia per coltivare batteri ambientali sconosciuti per ottenere o analizzare i loro prodotti metabolici.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Watson, DC, et.al. Isolamento e purificazione scalabili di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra l'isolamento e la concentrazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dalla membrana esterna di batteri geneticamente modificati. Il processo prevede la coltura dei batteri per rilasciare le vescicole extracellulari, seguita da fasi sequenziali di centrifugazione e filtrazione per rimuovere cellule e detriti. Infine,...

Isolamento e arricchimento di vescicole extracellulari derivate dalla membrana esterna da batteri

Fonte: Morita, M., et al. Coltura cellulare batterica a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti. J. Vis. Exp. (2019).Questo video mostra un metodo per la coltura e l'osservazione di singole cellule batteriche incapsulate all'interno di vescicole giganti ancorate a un doppio strato lipidico supportato. Il sistema consente l'imaging stabile e a lungo termine delle dinamiche di crescita di singole cellule in un microambiente confinato e fisiologicamente rilevante.

Coltura unicellulare di batteri all'interno di vescicole giganti

Fonte: Cabeen, M. T., et al. Analisi microfluidica a singola cellula di Bacillus subtilis. J. Vis. Esp. (2018)Il video mostra l'uso di un dispositivo microfluidico per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula. Mostra come le cellule batteriche non mobili, confinate in trincee su scala microscopica, vengano continuamente nutrite e imaggiate sotto un microscopio a fluorescenza. L'installazione consente la visualizzazione in tempo reale della divisione cellulare e del...

Monitoraggio della crescita batterica a risoluzione di singola cellula in un sistema microfluidico

In questo protocollo viene introdotta la fabbricazione, l'impostazione e il funzionamento di base di un bioreattore microfluidico picolitro (PLBR) per l'analisi di singole cellule di microrganismi procarioti. I microrganismi rilevanti a livello industriale sono stati analizzati come prova di principio che consente di comprendere il tasso di crescita, la morfologia e l'eterogeneità fenotipica in determinati periodi di tempo, difficilmente possibili con i metodi convenzionali.

Bioreattore microfluidico picolitro per l'analisi microbica di singole cellule: fabbricazione, configurazione del sistema e funzionamento

Le vescicole giganti contenenti componenti altamente impacchettati di dimensioni micrometriche sono utili modelli cellulari. Il metodo di centrifugazione dell'emulsione acqua-in-olio è uno strumento semplice e potente per la preparazione di vescicole giganti con materiali incapsulati.

Preparazione di giganti Vescicole Encapsulating microsfere mediante centrifugazione di una emulsione acqua-in-olio

Presentiamo un metodo per l'analisi di microfluidica di lignaggi di singola cellula batterica utilizzando Bacillus subtilis come esempio. Il metodo sormonta le imperfezioni dei tradizionali metodi analitici in microbiologia, consentendo l'osservazione di centinaia di generazioni di cellulari in condizioni di crescita uniforme e ben controllabile.

Analisi Microfluidic unicellulare del Bacillus subtilis

Qui, descriviamo un metodo di microaspirazione a singola cellula per la separazione delle amebe infette. Al fine di separare le sottopopolazioni virali in Vermamoeba vermiformis infettate da Faustovirus e virus giganti sconosciuti, abbiamo sviluppato il protocollo descritto di seguito e dimostrato la sua capacità di separare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

I batteri secernono vescicole extracellulari (EV) di dimensioni nanometriche che trasportano molecole biologiche bioattive. La ricerca EV si concentra sulla comprensione della loro biogenesi, del ruolo nelle interazioni e malattie microbo-microbo e ospite-microbo, nonché sulle loro potenziali applicazioni terapeutiche. Viene presentato un flusso di lavoro per l'isolamento scalabile dei veicoli elettrici da vari batteri per facilitare la standardizzazione della ricerca sui veicoli elettrici.

Isolamento scalabile e purificazione di vescicole extracellulari da Escherichia coli e altri batteri

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento, la concentrazione e la caratterizzazione di vescicole extracellulari da colture cianobatteriche. Vengono inoltre discussi gli approcci per purificare le vescicole da colture a diverse scale, i compromessi tra le metodologie e le considerazioni per lavorare con i campioni sul campo.

Isolamento e caratterizzazione delle vescicole extracellulari cianobatteriche

Questo protocollo descrive il metodo dell'emulsione invertita utilizzato per incapsulare un sistema di espressione libera da cellule (CFE) all'interno di una vescicola unilamellare gigante (GUV) per lo studio della sintesi e dell'incorporazione di una proteina modello di membrana nel doppio strato lipidico.

Ricostituzione del canale del recettore del glutammato batterico mediante incapsulamento di un sistema di espressione libero da cellule

Questo articolo presenta un metodo per la preparazione di vescicole unilamellari giganti composte (cGUV) con una struttura vescicola nella vescicola, con conducibilità elettrica personalizzata nelle regioni interne, anulari ed esterne. L'elettroformazione sintetizza semplici GUV, che vengono trasformati in stomatociti e cGUV tramite shock osmotico, fornendo un modello prezioso per lo studio della biofisica delle cellule nucleate.

Sintesi di vescicole unilamellari giganti composte: un modello biomimetico di cellule nucleate

Scopri la coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicole giganti utilizzando il metodo di trasferimento a goccia. Questa tecnica consente l'osservazione diretta della crescita batterica in microbiologia.

Coltura di cellule batteriche a livello di singola cellula all'interno di vescicoli giganti

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