Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare

Il muscolo scheletrico del topo fisiologicamente intatto può produrre modelli di diffrazione a raggi X di alta qualità contenenti molte informazioni strutturali in grado di fornire informazioni sui processi fisiologici. La diffrazione a raggi X è l'unica tecnica che consente l'acquisizione di informazioni strutturali ad alta risoluzione dal tessuto muscolare vivente in condizioni fisiologiche reali in tempo fisiologico reale. Molte malattie muscolari sono ereditate.

Con una maggiore disponibilità a modificare geneticamente la maggior parte dei modelli di miopatie, la diffrazione dei raggi X può fornire approfondimenti strutturali nei meccanismi della malattia e indicare strategie terapeutiche. La maggior parte dei muscoli estensori digitorum longus e soleus sono particolarmente convenienti per questo scopo. Ma molti altri muscoli di piccoli animali possono essere sezionati intatti e maneggiati in modo simile.

Prima di iniziare la procedura, accendere il trasduttore combinato della forza del motore, il controller del trasduttore della forza del motore con uno stimolatore di corrente bifasica ad alta potenza e un sistema di controllo dell'acquisizione dei dati di controllo del computer. Successivamente, spruzzare la pelle sull'arto posteriore del mouse con la soluzione fredda di Ringer e utilizzare forbici a dissezione fine per tagliare la pelle intorno alla coscia. Usando le forcette numero cinque, tirare rapidamente la pelle verso il basso per esporre i muscoli e amputare l'arto posteriore.

Posizionare l'arto in una sezionatura rivestita di elastomero contenente la soluzione di Ringer ossigenata e posizionare il piatto sotto un microscopio di sezionatura binoculare. Per raccogliere il muscolo soleo, inchiodare l'arto posteriore con il muscolo gastrocnemio rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici fini per tagliare il tendine distale del gruppo muscolare gastrocnemio/soleo.

Tagliare la fascia su entrambi i lati del muscolo gastrocnomio per consentire ai muscoli di essere sollevati delicatamente e lentamente lontano dall'osso. Quindi liberare il tendine prossimale del muscolo soleo. Inchiodare il gruppo muscolare contenente il muscolo gastrocnemio e il tendine distale nel piatto.

Sollevare delicatamente il muscolo soleo attraverso il tendine prossimale per separarlo dal muscolo gastrocnemio, lasciando intatto il più possibile il tendine distale soleus. Per raccogliere il muscolo estensore digitorum longus o EDL, inchiodare l'arto posteriore nel piatto con il muscolo anteriore tibiale rivolto verso l'alto e tagliare la fascia lungo il muscolo anteriore tibiale. Utilizzare le flessione per liberare la fascia e tagliare il tendine distale del muscolo anteriore della tibialis.

Sollevare il muscolo tibiale anteriore e tagliarlo con attenzione senza tirare il muscolo EDL e tagliare il lato laterale del ginocchio per esporre i due tendini. Tagliare il tendine prossimale, lasciandoci gran parte del tendine il più possibile ancora attaccato al muscolo e tirare delicatamente il tendine per sollevare il muscolo EDL. Quindi tagliare il tendine distale una volta esposto.

Per montare il muscolo raccolto, fissare il muscolo attraverso i tendini e tagliare il maggior numero possibile di grasso, fascia e tendine extra. Inserire un tendine in un nodo pre-legato e utilizzare le forcep di legatura della sutura per legare saldamente la sutura. Legare il secondo nodo attorno al gancio metallico e ripetere la procedura sull'altra estremità del tendine.

Quindi attaccare il gancio corto sul fondo della camera sperimentale e il lungo gancio al motore del trasduttore di forza a doppia modalità. Bollare la soluzione nella camera sperimentale con 100% di ossigeno. Per ottimizzare il protocollo di stimolazione e la lunghezza muscolare regolare i micro manipolatori collegati al motore del trasduttore per generare una tensione di base compresa tra 15 e 20 millinewton per trovare i migliori parametri di stimolo per allungare il muscolo.

Impostare la tensione di stimolazione su 40 volt. La corrente di stimolazione verrà sistematicamente aumentata fino a quando non vi sarà alcun aumento aggiuntivo della forza di contrazione. Per trovare la lunghezza ottimale, aumentare la lunghezza muscolare e attivare il muscolo con una singola contrazione fino a quando la forza attiva smette di aumentare.

Eseguire una contrazione tetanica di un secondo per testare il montaggio e allungare il muscolo alla forza di base ottimale, se necessario. Quindi registrare la lunghezza muscolare in millimetri con una pinza digitale. Per determinare la posizione del fascio, utilizzare un pezzo di carta sensibile ai raggi X che produce una macchia scura in risposta ai raggi X e un generatore di mirino video per creare un mirino allineato con il segno di bruciatura sulla carta.

Utilizzando l'interfaccia utente grafica fornita da BioCAT al posizionatore del campione, centrare il muscolo sulla posizione del fascio e spostare lo stadio del campione per oscillare la camera del campione a 10-20 millimetri al secondo per distribuire la dose di raggi X su tutto il muscolo durante l'esposizione. Osservare il campione mentre si muove per evitare grandi regioni di fascia che contengono collagene e per assicurarsi che rimanga illuminato durante l'intero percorso del suo viaggio. Armare il rilevatore e attendere il trigger dal sistema di acquisizione dati.

Quindi attivare i dati meccanici e a raggi X contemporaneamente per sincronizzarli. I modelli a raggi X verranno raccolti continuamente in tutto il protocollo con un tempo di esposizione di 10 millisecondi e un periodo di esposizione di 50 millisecondi. In questa contrazione tetanica isometrica rappresentativa il muscolo EDL è stato tenuto a riposo per 0,5 secondi prima di essere attivato per un secondo, seguito da un rilassamento di 1,5 secondi.

Il modello di diffrazione dei raggi X muscolari può fornire informazioni strutturali sulla risoluzione nanometrica dalle strutture all'interno del sarcomero. Le linee di strato a base di miosina contenenti filamenti spessi sono forti e affilate nei modelli dei muscoli a riposo, mentre le linee di strato a base di actina contenenti filamenti sottili sono più prominenti nei modelli di contrarre i muscoli. I modelli di differenza ottenuti sottraendo il modello di riposo dal modello di contrazione possono far luce sui cambiamenti strutturali durante lo sviluppo della forza nel muscolo sano e mato.

Seguendo questi cambiamenti strutturali alla scala temporale millisecondo degli eventi molecolari durante la contrazione muscolare e il rilassamento, i modelli di diffrazione dei raggi X possono rivelare informazioni strutturali sostanziali. In questa rappresentante analisi delle riflessioni equatoriali usando la routine equatore nel pacchetto MuscleX open source, il rapporto di intensità equatoriale indica la vicinanza della miosina all'actina nel muscolo a riposo ed è strettamente correlato al numero di ponti trasversali attaccati nel contrarre il muscolo scheletrico murino. La distanza tra la riflessione 1, 0 è inversamente correlata alla spaziatura dell'interfilamento.

Una dissezione pulita è la chiave per un esperimento a raggi X muscolare intatto di successo, quindi cerca di evitare danni meccanici durante la preparazione muscolare. Qualsiasi protocollo fisiologico standard con muscoli interi può essere implementato in questi esperimenti e può essere utilizzato per studiare l'attivazione muscolare, il rilassamento e il comportamento cross-bridge durante la rapida caescenza meccanica. La manipolazione genetica dei topi sta diventando sempre più sofisticata.

I nuovi modelli di topi transgenici consentiranno di progettati esperimenti più specifici e approfonditi per indicare nuove direzioni terapeutiche per le miopatie umane.