Diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico Murine intatto come strumento per studiare la base strutturale della malattia muscolare
18 luglio 2019
Vi presentiamo protocolli dettagliati per l'esecuzione di esperimenti di diffrazione a raggi X a piccolo angolo utilizzando muscoli scheletrici del topo intatti. Con l'ampia disponibilità di modelli murini transgenici per le malattie umane, questa piattaforma sperimentale può costituire un utile banco di prova per chiarire la base strutturale delle malattie genetiche muscolari
Il muscolo scheletrico del topo fisiologicamente intatto può produrre modelli di diffrazione a raggi X di alta qualità contenenti molte informazioni strutturali in grado di fornire informazioni sui processi fisiologici. La diffrazione a raggi X è l'unica tecnica che consente l'acquisizione di informazioni strutturali ad alta risoluzione dal tessuto muscolare vivente in condizioni fisiologiche reali in tempo fisiologico reale. Molte malattie muscolari sono ereditate.
Con una maggiore disponibilità a modificare geneticamente la maggior parte dei modelli di miopatie, la diffrazione dei raggi X può fornire approfondimenti strutturali nei meccanismi della malattia e indicare strategie terapeutiche. La maggior parte dei muscoli estensori digitorum longus e soleus sono particolarmente convenienti per questo scopo. Ma molti altri muscoli di piccoli animali possono essere sezionati intatti e maneggiati in modo simile.
Prima di iniziare la procedura, accendere il trasduttore combinato della forza del motore, il controller del trasduttore della forza del motore con uno stimolatore di corrente bifasica ad alta potenza e un sistema di controllo dell'acquisizione dei dati di controllo del computer. Successivamente, spruzzare la pelle sull'arto posteriore del mouse con la soluzione fredda di Ringer e utilizzare forbici a dissezione fine per tagliare la pelle intorno alla coscia. Usando le forcette numero cinque, tirare rapidamente la pelle verso il basso per esporre i muscoli e amputare l'arto posteriore.
Posizionare l'arto in una sezionatura rivestita di elastomero contenente la soluzione di Ringer ossigenata e posizionare il piatto sotto un microscopio di sezionatura binoculare. Per raccogliere il muscolo soleo, inchiodare l'arto posteriore con il muscolo gastrocnemio rivolto verso l'alto. Utilizzare forbici fini per tagliare il tendine distale del gruppo muscolare gastrocnemio/soleo.
Tagliare la fascia su entrambi i lati del muscolo gastrocnomio per consentire ai muscoli di essere sollevati delicatamente e lentamente lontano dall'osso. Quindi liberare il tendine prossimale del muscolo soleo. Inchiodare il gruppo muscolare contenente il muscolo gastrocnemio e il tendine distale nel piatto.
Sollevare delicatamente il muscolo soleo attraverso il tendine prossimale per separarlo dal muscolo gastrocnemio, lasciando intatto il più possibile il tendine distale soleus. Per raccogliere il muscolo estensore digitorum longus o EDL, inchiodare l'arto posteriore nel piatto con il muscolo anteriore tibiale rivolto verso l'alto e tagliare la fascia lungo il muscolo anteriore tibiale. Utilizzare le flessione per liberare la fascia e tagliare il tendine distale del muscolo anteriore della tibialis.
Sollevare il muscolo tibiale anteriore e tagliarlo con attenzione senza tirare il muscolo EDL e tagliare il lato laterale del ginocchio per esporre i due tendini. Tagliare il tendine prossimale, lasciandoci gran parte del tendine il più possibile ancora attaccato al muscolo e tirare delicatamente il tendine per sollevare il muscolo EDL. Quindi tagliare il tendine distale una volta esposto.
Per montare il muscolo raccolto, fissare il muscolo attraverso i tendini e tagliare il maggior numero possibile di grasso, fascia e tendine extra. Inserire un tendine in un nodo pre-legato e utilizzare le forcep di legatura della sutura per legare saldamente la sutura. Legare il secondo nodo attorno al gancio metallico e ripetere la procedura sull'altra estremità del tendine.
Quindi attaccare il gancio corto sul fondo della camera sperimentale e il lungo gancio al motore del trasduttore di forza a doppia modalità. Bollare la soluzione nella camera sperimentale con 100% di ossigeno. Per ottimizzare il protocollo di stimolazione e la lunghezza muscolare regolare i micro manipolatori collegati al motore del trasduttore per generare una tensione di base compresa tra 15 e 20 millinewton per trovare i migliori parametri di stimolo per allungare il muscolo.
Impostare la tensione di stimolazione su 40 volt. La corrente di stimolazione verrà sistematicamente aumentata fino a quando non vi sarà alcun aumento aggiuntivo della forza di contrazione. Per trovare la lunghezza ottimale, aumentare la lunghezza muscolare e attivare il muscolo con una singola contrazione fino a quando la forza attiva smette di aumentare.
Eseguire una contrazione tetanica di un secondo per testare il montaggio e allungare il muscolo alla forza di base ottimale, se necessario. Quindi registrare la lunghezza muscolare in millimetri con una pinza digitale. Per determinare la posizione del fascio, utilizzare un pezzo di carta sensibile ai raggi X che produce una macchia scura in risposta ai raggi X e un generatore di mirino video per creare un mirino allineato con il segno di bruciatura sulla carta.
Utilizzando l'interfaccia utente grafica fornita da BioCAT al posizionatore del campione, centrare il muscolo sulla posizione del fascio e spostare lo stadio del campione per oscillare la camera del campione a 10-20 millimetri al secondo per distribuire la dose di raggi X su tutto il muscolo durante l'esposizione. Osservare il campione mentre si muove per evitare grandi regioni di fascia che contengono collagene e per assicurarsi che rimanga illuminato durante l'intero percorso del suo viaggio. Armare il rilevatore e attendere il trigger dal sistema di acquisizione dati.
Quindi attivare i dati meccanici e a raggi X contemporaneamente per sincronizzarli. I modelli a raggi X verranno raccolti continuamente in tutto il protocollo con un tempo di esposizione di 10 millisecondi e un periodo di esposizione di 50 millisecondi. In questa contrazione tetanica isometrica rappresentativa il muscolo EDL è stato tenuto a riposo per 0,5 secondi prima di essere attivato per un secondo, seguito da un rilassamento di 1,5 secondi.
Il modello di diffrazione dei raggi X muscolari può fornire informazioni strutturali sulla risoluzione nanometrica dalle strutture all'interno del sarcomero. Le linee di strato a base di miosina contenenti filamenti spessi sono forti e affilate nei modelli dei muscoli a riposo, mentre le linee di strato a base di actina contenenti filamenti sottili sono più prominenti nei modelli di contrarre i muscoli. I modelli di differenza ottenuti sottraendo il modello di riposo dal modello di contrazione possono far luce sui cambiamenti strutturali durante lo sviluppo della forza nel muscolo sano e mato.
Seguendo questi cambiamenti strutturali alla scala temporale millisecondo degli eventi molecolari durante la contrazione muscolare e il rilassamento, i modelli di diffrazione dei raggi X possono rivelare informazioni strutturali sostanziali. In questa rappresentante analisi delle riflessioni equatoriali usando la routine equatore nel pacchetto MuscleX open source, il rapporto di intensità equatoriale indica la vicinanza della miosina all'actina nel muscolo a riposo ed è strettamente correlato al numero di ponti trasversali attaccati nel contrarre il muscolo scheletrico murino. La distanza tra la riflessione 1, 0 è inversamente correlata alla spaziatura dell'interfilamento.
Una dissezione pulita è la chiave per un esperimento a raggi X muscolare intatto di successo, quindi cerca di evitare danni meccanici durante la preparazione muscolare. Qualsiasi protocollo fisiologico standard con muscoli interi può essere implementato in questi esperimenti e può essere utilizzato per studiare l'attivazione muscolare, il rilassamento e il comportamento cross-bridge durante la rapida caescenza meccanica. La manipolazione genetica dei topi sta diventando sempre più sofisticata.
I nuovi modelli di topi transgenici consentiranno di progettati esperimenti più specifici e approfonditi per indicare nuove direzioni terapeutiche per le miopatie umane.
Panoramica
In questo articolo vengono presentati protocolli per l'esecuzione di esperimenti di diffrazione a raggi X a piccolo angolo su muscoli scheletrici intatti di topo. Il metodo fornisce informazioni sulle basi strutturali delle malattie muscolari genetiche, sfruttando la disponibilità di modelli murini transgenici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Fisiologia Muscolare
Sfondo
- La diffrazione a raggi X fornisce informazioni strutturali ad alta risoluzione da tessuto muscolare vivente.
- La comprensione delle malattie muscolari può trarre vantaggio dagli approfondimenti ottenuti tramite analisi strutturale.
- Modelli murini transgenici sono sempre più disponibili per lo studio delle miopatie.
- Muscoli specifici come l'estensore lungo delle dita e il soleo sono adatti per questi esperimenti.
Scopo dello studio
- Chiarire i cambiamenti strutturali del muscolo durante la contrazione e il rilassamento.
- Fornire una piattaforma per lo studio dei meccanismi delle malattie muscolari ereditarie.
- Indicare possibili strategie terapeutiche basate su informazioni strutturali.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento di muscoli scheletrici integri da topi.
- Impostazione di esperimenti di diffrazione a raggi X in condizioni fisiologiche.
- Utilizzo di un trasduttore di forza a doppia modalità per la stimolazione muscolare.
- Acquisizione di schemi a raggi X per analizzare i cambiamenti strutturali a scala nanometrica.
Risultati principali
- I pattern di diffrazione a raggi X rivelano informazioni strutturali sui sarcomeri.
- Le differenze nei pattern tra muscoli a riposo e in contrazione forniscono indicazioni sui meccanismi di sviluppo della forza.
- I cambiamenti strutturali possono essere monitorati su scale temporali dell'ordine del millisecondo durante l'attività muscolare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della funzione muscolare e dei meccanismi delle malattie.
Conclusioni
- Lo studio dimostra l'utilità della diffrazione a raggi X nella ricerca muscolare.
- Le informazioni ottenute possono orientare gli approcci terapeutici per le malattie muscolari.
- Questo metodo migliora la nostra comprensione della fisiologia e della patologia muscolare.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La diffrazione a raggi X del muscolo scheletrico murino integro consente un'analisi strutturale su scala nanometrica in condizioni fisiologiche, fornendo un collegamento diretto tra genotipo e fenotipo funzionale nei modelli di malattie muscolari. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi terapeutici rivelando le modifiche strutturali del sarcomero durante lo sviluppo della forza, offrendo una riduzione del rischio meccanicistica per le strategie terapeutiche nelle miopatie ereditarie. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici quantificando la distanza interfilamentosa e la dinamica dei ponti trasversali su scale temporali dell'ordine del millisecondo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verifica ipotesi terapeutiche collegando modifiche genetiche a cambiamenti strutturali del sarcomero nel muscolo integro.
- Valore operativo: Permette la validazione funzionale delle target mediante letture strutturali in tempo reale delle interazioni miosina-actina durante la contrazione.
- Valore scientifico: Fornisce un grado predittivo quantificando i correlati strutturali dell'attacco del ponte trasversale e della distanza tra i filamenti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi preservando l'architettura muscolare e la fisiologia native.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi attraverso protocolli di stimolazione controllati e la raccolta sincronizzata di dati a raggi X.
- Valore scientifico: Evidenzia la prontezza per lo screening mediante output strutturali quantitativi come i rapporti di intensità equatoriale e le analisi delle linee stratificate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza clinica collegando i cambiamenti strutturali nei modelli transgenici ai meccanismi della miopatia umana.
- Valore operativo: Descrive la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, consentendo il monitoraggio longitudinale della struttura.
- Valore scientifico: Affronta decisioni di avanzamento corrette per il rischio identificando biomarcatori strutturali della progressione della malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio alla validazione preclinica, fornendo un fenotipaggio strutturale della funzione muscolare in condizioni fisiologiche.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione dei rischi biologici attraverso l'analisi strutturale della dinamica del sarcomero.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità e le uscite quantitative ottenute mediante acquisizione sincronizzata di dati meccanici e a raggi X.
- Analisi: Mette in evidenza le misurazioni, i segnali o gli output statistici che aiutano i gruppi di lavoro a confrontare diverse condizioni, inclusi i rapporti di intensità equatoriale e la distanza tra riflessi.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento con biomarcatori monitorando i cambiamenti strutturali in diversi modelli di malattia.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, grazie a protocolli standardizzati di montaggio e stimolazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio.
Considerazioni per l'Implementazione
- Competenze scientifiche richieste in fisiologia muscolare, diffrazione a raggi X e gestione di modelli transgenici.
- Esigenze di strumentazione e infrastruttura analitica, inclusi fasci di sincrotrone, trasduttori di forza a doppia modalità e sistemi sincronizzati di acquisizione dati.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per le procedure di dissezione, montaggio e stimolazione muscolare nei diversi laboratori.
- Considerazioni sull'adattamento tra sistemi modello, in particolare per diversi muscoli murini e modelli di malattia.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura, tra cui la necessità di una dissezione accurata per evitare contaminazione da fascia e mantenere l'integrità del campione durante l'esposizione.
