Plasmid di DNA ad alto throughput e trasfezione utilizzando la tecnologia di nanoedispensing acustico

Il protocollo di trasfezione basato su NanoDispenser sviluppato per descrivere in questo video rappresenta il primo metodo di trasfezione intuitivo e ad alta produttività che consente anche ai principianti sul campo di avere successo. Questa tecnica ad alta produttività è facile da usare e consente la trasfezione di cellule con 384 condizioni indipendenti. Al momento, il metodo è a basso costo a causa del nano volume di reagente necessario.

Per definire i migliori parametri di trasfezione per tutto il tipo di cellula, suggeriamo di mantenere costante la concentrazione di DNA sorgente e di utilizzare quantità variabili di DNA trasfetto, reagente di trasfezione e numero di cellule. Per l'erogazione delle sospensioni a celle da 40 microliter, montare una cassetta da 10 microliter sul dispositivo di gestione del liquido peristaltico e preparare un programma appropriato. In primo luogo, regolare il parametro della portata a basso per erogare le cellule a bassa velocità per evitare di promuovere potenziali danni alle cellule a causa dello stress e dell'alto impatto sul fondo dei pozzi.

Quindi, regolare l'altezza di erogazione a 11,43 millimetri. L'altezza deve essere abbastanza alta da ridurre l'impatto cellulare sul fondo dei pozzi durante il processo di erogazione, ma abbastanza bassa da evitare la ritenzione delle goccioline sulla testa di erogazione. Successivamente, regolare l'altezza chiara della piastra a 16 millimetri per consentire lo spostamento libero della testa di erogazione sulla piastra dopo aver dispensato ogni riga.

Controllare visivamente le impostazioni corrette dell'altezza della testa del gestore liquido peristaltico. Assicurarsi che non siano conservate gocce sulle punte di erogazione durante l'erogazione. Verificare inoltre che la testa sia abbastanza alta da consentire lo spostamento della testa dopo l'erogazione di ogni riga.

Per generare liste di prelievo per guidare la dispensazione ADE, è stata sviluppata una macro di fogli di calcolo intuitiva per gestire le quantità di DNA e mescolare fino a quattro plasmidi in un formato a piastre di pozzo 384. I volumi ottimali vengono precompilati in alcune celle del foglio di calcolo, ma possono essere modificati. Nei campi rosa, il reagente di trasfezione, o valore della miscela TR, è impostato su 500 nanolitri.

Il valore minimo del volume nei pozzi della piastra di sorgente è impostato su quattro microlitri e il volume massimo nei pozzi della piastra di sorgente è di 11,25 microlitri. Immettere 100 nanogrammi per dna microlitro che iniziano concentrazioni nei campi blu corrispondenti al DNA sottostante. Quindi, inserisci la quantità di DNA desiderata nei campi grigio e verde corrispondente ai 384 pozzi della piastra.

Inserisci le quantità e i nomi plasmidici e assicurati che venga utilizzata la stessa ortografia se lo stesso plasmide deve essere trasfetto in più pozzi. Fare clic su genera elenchi a discesa per verificare i valori immessi e, se richiesto, correggere le celle riempite di arancione che indicano errori o volumi che non possono essere gestiti da NanoDispenser. Se non ne viene rilevato alcuno, la macro genererà la guida all'erogazione del pozzo 384, il file della lista di prelievo del DNA e il file della lista a discesa TR dai dati raccolti sui fogli corrispondenti.

Stampare il modello dal foglio della piastra di origine per visualizzare i pozzi da riempire prima dell'erogazione. Sono indicati nomi plasmidici e volumi di riempimento minimi. I volumi di miscela di reagenti di trasfezione che verranno riempiti nei seguenti pozzi, sono indicati come TR ed evidenziati in verde.

Per preparare la piastra sorgente del DNA, diluire il plasmide di DNA immagazzinato a 100 nanogrammi per microlitro usando acqua distillata. Ora, calibrare la griglia del pozzo 384 in base alle dimensioni della piastra. Aprire l'applicazione 384 Well Pipetting Guide su un tablet.

Posizionare la posizione di origine sulla griglia nella schermata inferiore. Nel menu di calibrazione in alto a sinistra, fare clic su più o meno per migliorare o ridurre le dimensioni della griglia e dei pozzi per regolare i pozzi verdi ai quattro pozzi angolari della piastra. Utilizzando nastro a doppia parte, montare l'adattatore a piastre stampate in 3D sullo schermo per evitare movimenti della piastra sorgente durante l'erogazione.

Se necessario, spostare la griglia calibrata utilizzando le frecce di rotazione e i pulsanti su, giù, destra e sinistra per regolare la griglia in base alla posizione della piastra. Una volta calibrate e posizionate correttamente la griglia e le dimensioni dei pozzi, spuntare la casella di calibrazione del blocco. Fate clic sul file e aprite la guida alla pipettazione a 384 pozzi.

csv. Seguire le istruzioni dello schermo per erogare manualmente il volume indicato di plasmide alla concentrazione specificata nel pozzo evidenziato in bianco che corrisponde alla destinazione target corretta della piastra prevista. Usa frecce meno o più per tornare indietro o più avanti nel processo di erogazione del DNA.

Interrompere l'erogazione al raggiungimento della prima soluzione di reagente di trasfezione da caricare. Una volta terminate le dispensazioni di DNA, rimuovere la piastra di origine dall'adattatore. Se devono essere riempite più piastre sorgente, posizionare una nuova piastra di sorgente sull'adattatore e seguire le istruzioni di erogazione.

Centrifugare le piastre di sorgente riempite di DNA per garantire un corretto livellamento del liquido e rimuovere le bolle che portano all'imprecisione nei trasferimenti di base ADE. Ora, esegui un sondaggio per controllare i volumi erogati manualmente. Nel PC NanoDispenser eseguire il programma NanoDispenser.

Vai alla scheda diagnostica, spunta la posta in uscita della piastra di origine, carica la piastra di origine sul supporto della piastra e spunta per inserire la piastra. Quando richiesto, selezionare 384LDV_AQ_B2 impostare NanoDispenser sulla modalità di erogazione del buffer acquoso e premere OK. Selezionare sondaggio nel menu varie. E clicca sul lancio.

Selezionare i pozzi precompilato da analizzare e fare clic sul pulsante vai. Verificare che i volumi misurati corrispondano a quelli previsti e assicurarsi che non siano stati caricati pozzi con volumi di oltre 12 microlitri. Innescare il tubo con mezzo privo di siero riempiendo un nuovo recipiente sterile con 10 millilitri di mezzo privo di siero pre-riscaldato e immergendovi l'organizzatore del tubo.

Premere il pulsante primo del gestore liquido peristaltico per circa 10 secondi. Assicurarsi che la punta non sia intasata ispezionando visivamente il flusso dalla testa di erogazione. Posizionare una piastra sterile di coltura del pozzo 384 sul supporto peristanziale della piastra del conduttore liquido e rimuovere il coperchio.

Eseguire il programma pre-calibrato per erogare un microliter in ogni pozzo della piastra del pozzo 384. Il tempo di erogazione è di circa otto secondi. Quindi sostituire il coperchio della piastra del pozzo 384.

Per configurare l'erogazione di DNA basata su ADE, eseguire il software della lista di prelievo. Impostare i 384 pozzi provenienti da 384LDV. Impostare il dispositivo sulla modalità di erogazione del buffer acquoso selezionando 384LDV_AQ_B2.

E i tipi di piastre di destinazione da Greiner_384PS_781096. Velocità effettiva di trasferimento ottimizzata senza graduazione. Selezionare la scheda elenco di selezione.

Clicca sull'importazione. E selezionare il file DNA_Picklist_CSV file. Quindi, fai clic su riproduci e salva il protocollo.

Fare clic su simula per eseguire una simulazione delle dispensazioni del programma per assicurarsi che l'elenco a discesa corrisponda al progetto sperimentale previsto. Clicca sul pulsante esegui e avvia il programma di erogazione. Quando richiesto, inserire la targa di origine richiesta.

E poi la targa di destinazione nel NanoDispenser. Per impostare la dispensazione del reagente di trasfezione, lavorare in un armadio di biosicurezza per diluire il reagente di trasfezione lipopoliplex in mezzo privo di siero a una concentrazione finale di una x e vortice del tubo. Erogare immediatamente la miscela TR in base alla piastra di sorgente predefinita degnata dalla macro e utilizzando l'applicazione di guida di tubazione del pozzo 384 pre-calibrata.

Dopo l'erogazione tr, eseguire un'indagine per controllare i volumi caricati TR come fatto in precedenza per il DNA caricato. Selezionare la miscela di reazione di trasfezione dei pozzi precompilato da analizzare. E clicca sul pulsante vai.

Verificare che i volumi misurati corrispondano a quelli previsti. E assicurarsi che nessun pozzo sia stato caricato con volumi di oltre 12 microlitri. Ora esegui un reset dell'elenco a discesa del DNA nel software della lista dei picklist.

Verificare che i parametri del dispositivo siano ancora impostati su buffer acquosi. Immettere i tipi di targa di origine e di destinazione corretti. Nella scheda elenco di prelievo fare clic su reimposta per cancellare l'elenco di esempio.

Quindi clicca su importa e scegli il TR_Picklist. CSV. Clicca sul gioco.

Salvare il protocollo se richiesto ed eseguire una simulazione delle dispensazioni della miscela di reagente di trasfezione del programma per garantire la corretta progettazione facendo clic sul pulsante simula. Come fatto in precedenza, dopo aver fatto clic sul pulsante di esecuzione e aver avviato il programma di erogazione posizionare la piastra di origine e quindi la piastra di destinazione nel NanoDipsenser come richiesto. Per erogare le cellule, riempire un nuovo vaso sterile con la sospensione cellulare preparata e mescolarlo per evitare la sedimentazione che porta all'imprecisione e alla densità cellulare.

Inserire l'organizzatore del tubo nella soluzione. Quindi, premere il pulsante primo fino a quando la sospensione cellulare inizia a sciacquarsi dalla testa di erogazione. Assicurarsi che la punta non sia intasata ispezionando visivamente il flusso dalla testa di erogazione durante lo sciacquone e assicurarsi che ogni tubo sia caricato con sospensioni cellulari.

Ora, caricare la piastra di destinazione del pozzo 384 riempita di DNA e TR sul supporto peristanziale della piastra del gestore del liquido e rimuovere il coperchio. Eseguire il programma pre-calibrato per erogare 40 microlitri della sospensione cellulare sulla piastra completa da 384 pozzi. Il tempo di erogazione è di circa 45 secondi.

Infine, sostituire il coperchio della piastra del pozzo 384. La trasfezione delle cellule HeLa usando il reagente lipopolyplex ebbe successo. Quantità di DNA che vanno da cinque a 30 nanogrammi hanno mostrato la stessa efficienza e fino al 90% di trasfezione cellulare a un volume diluito di microliter.

Al contrario, quantità più elevate hanno comportato una brusca diminuzione della percentuale di cellule trasfette. Sono stati testati vari volumi diluenti che vanno da 15 nanolitri a quattro microlitri e un microlitro è stato identificato come la condizione migliore. Per migliorare ulteriormente la produttività di questo protocollo sono stati testati due efficaci metodi di conservazione del DNA, vale a dire la conservazione a secco della piastra o la conservazione congelata.

Entrambi i metodi di conservazione non hanno portato a risultati significativamente diversi rispetto alla soluzione di DNA appena erosa immagazzinata per un massimo di sette giorni. Poiché la trasfezione al plasma di solito impiega almeno due diversi plasmidi, la capacità di multiplexing del DNA di questo protocollo è stata esaminata utilizzando le migliori condizioni identificate. La proteina fluorescente rossa tdTomato precedentemente usata che esprime plasmide è stata modificata per esprimere mVenus una proteina fluorescente giallo brillante ed entrambe sono state poi utilizzate nei tentativi di cotrasfezione.

L'analisi delle cellule fluorescenti positive rosse o verdi ha mostrato che l'efficienza di trasfezione è di circa l'80%Tuttavia, quasi il 100% dei globuli rossi è stato anche cotrasfetto con il plasmide che esprime mVenus come si può vedere nell'analisi delle immagini rappresentativa basata su software. Una volta che i DNA sono stati dispensati nella piastra di origine. Eseguire un sondaggio per assicurarsi che i volumi previsti siano stati caricati e non superino i 12 microlitri.

Durante l'erogazione del reagente di trasfezione nella piastra di sorgente, cercare di evitare bolle poiché le piastre sovvertenti centrifughe si tradurranno in una completa perdita di efficacia della trasfezione. Questo metodo può essere applicato all'esperimento biologico, ai crimini e alla trasfezione ed è adatto principalmente che può essere eseguito in un formato a piastre di pozzo 384. Una trasfezione fullproof apre la strada a nuove applicazioni come il plasmide basato noto per approcci non di screening con colata più nitida che consentono il monitoraggio dell'effetto intermittente attualmente incapace di essere ordinato in strategie scadenti.