Arricchimento delle particelle di lipoproteina nativa con microRNA e successiva determinazione del loro contenuto di microRNA assoluto/relativo e della loro velocità di trasferimento cellulare

Le particelle di lipoproteina sono veicoli di trasporto nativi. L'arricchimento di sostanze estranee ne facilita l'uso come vettore di binari. L'etichettatura specifica di molecole o particelle intere rende possibile misurare l'assorbimento cellulare.

I due metodi di arricchimento sono rapidi e facili da usare e possono essere adattati per un'ampia gamma di sostanze. A dimostrare la procedura saranno Markus Axmann e Andreas Karner, due postdoc del mio laboratorio. Per iniziare la delipidazione in una cappa aspirante, mescolare da uno a due millilitri di soluzione HDL preparata contenente cinque milligrammi di particelle HDL con 50 millilitri di miscela tri-a-due pre-raffreddata di etere dietile etanolo in un tubo di centrifugazione conico.

Incubare per due ore a -20 gradi Celsius. Centrifuga a 2500 volte g per 10 minuti a -10 gradi Celsius. Scartare il supernatante, rimescolare il pellet in 50 millilitri di miscela di etere dietile a etanolo pre-raffreddato e vortice brevemente.

Incubare una seconda volta per due ore a -20 gradi Celsius. Centrifuga di nuovo a 2500 volte g per 10 minuti a -10 gradi Celsius. Quindi inserire tubi che forniscono flusso di gas azoto per asciugare il pellet.

E lo rimospendò in 250 microlitri del tampone A.Determinare la concentrazione proteica usando il saggio proteico di Bradford o un altro appropriato. È fondamentale rimuovere tutti i resti della miscela di etere dietile a base di etanolo, poiché questi solventi inibirebbero la rilipidazione delle apolipoproteine. Successivamente, diluire ad una concentrazione finale di un milligrammo di proteine per 250 microlitri del tampone A.Inserire un tubo che fornisca gas inerte nella parte della soluzione nel tubo.

Se necessario, conservare la soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius sotto l'atmosfera di gas inerte. Per iniziare la ricostituzione, in un tubo di vetro pulito, mescolare 100 microlitri di CO, 13,5 microlitri di C e 500 microlitri di PC. Quindi ruotare il tubo di vetro mentre si scarica il gas azoto all'interno del tubo per asciugare la miscela al fine di produrre uno strato superficiale omogeneo. In un tubo di reazione da 0,5 millilitri, preparare una fresca soluzione di spermina da 30 millimolare nel tampone A.Quindi mescolare 100 microlitri di microRNA sintetico da 10 micromolare con 100 microlitri di soluzione di spermina in un tubo di reazione a due millilitri.

E incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius. Successivamente, trasferire la soluzione incubata da 200 microliter nel tubo di vetro per reidratare lo strato superficiale mastermix PC-CO-C preparato. E poi aggiungere 50 microlitri di una soluzione di deossicorato di sodio da 30 millilitri per millilitro.

Mescolare a quattro gradi Celsius per due ore. Successivamente, aggiungere 250 microlitri della soluzione HDL delipidata nel tubo di vetro. E mescolare a quattro gradi Celsius durante la notte.

Per iniziare la dialisi, aggiungere prima 50 grammi di perline adsorbenti a 800 millilitri di acqua doppia distillata. E utilizzare un agitatore magnetico per mescolare per un minuto. Attendere 15 minuti per le perline di stabilirsi, e decantare il supernatante.

Ripetere la procedura con PBS pre-raffreddato. Cassette di dialisi pre-bagnate in PBS. Utilizzare una siringa per aggiungere la miscela preparata in precedenza nelle cassette secondo le istruzioni del produttore.

Aggiungere le perle adsorbenti trattate con PBS a tre litri di PBS e posizionare le cassette nel PBS per dializzare a quattro gradi Celsius. Le perline mantengono costante il gradiente di densità lungo la membrana di dialisi. Cambiare il buffer e le perline dopo un'ora e due ore.

Dopo 24 ore, con una siringa, estrarre la soluzione dalla cassetta in un tubo di reazione da 1,5 millilitri per recuperare la soluzione di particelle HDL ricostituita. Determinare la concentrazione proteica usando il saggio di Bradford. Fornire gas inerte al tubo di reazione, sigillarlo e conservare la soluzione di particelle HDL ricostituita in atmosfera di gas inerte a quattro gradi Celsius.

In primo luogo, preparare una soluzione fresca di spermina da 30 millimolare in acqua priva di RNAse. Mescolare 100 microlitri di 10 micromolari di microRNA sintetico con 100 microlitri di soluzione di spermina in un tubo di reazione a due millilitri. E incubare per 30 minuti a 30 gradi Celsius.

Quindi aggiungere 100 microlitri di DMSO e 1,2 millilitri di tampone 1X LDL alla soluzione di spermina di microRNA preparata. Diluire la soluzione di particelle LDL precedentemente preparata con PBS ad una concentrazione finale di circa quattro milligrammi per millilitro. Quindi disegnare 450 microlitri della soluzione diluita in un tubo di reazione da 1,5 millilitri e mescolare con 50 microlitri di tampone LDL 10X.

Incubarlo per 10 minuti sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, combinare la soluzione di particelle LDL da 500 microlitri e la soluzione di microRNA-spermina-DMSO da 1,5 millilitri e incubarla per due ore a 40 gradi Celsius. Eseguire la dialisi simile a quanto descritto in precedenza e conservare la soluzione di particelle LDL etichettata in atmosfera di gas inerte a quattro gradi Celsius.

Per iniziare, diluire la soluzione di particelle HDL o LDL in PBS tra uno a 100 e uno a 1.000. Scindere la mica premendo il nastro adesivo contro il substrato di mica e tirando fuori il nastro per rimuovere gli strati superiori di mica. Utilizzare una pipetta per depositare due microlitri su mica appena sciccata per incubare per cinque minuti.

Le particelle di lipoproteina tendono a formare membrane di legame continuo sulle superfici. Di conseguenza, è importante regolare la concentrazione di particelle sulla superficie della mica per ottenere quelle individuali. Dopo l'incubazione, sciacquare il campione con PBS.

Riempire la cella liquida AFM ad alta velocità con PBS e montare lo scanner portamica allo stadio AFM ad alta velocità. Nel software di controllo, avviare il processo di avvicinamento del cantilever alla superficie della mica. Utilizzare dimensioni di scansione inferiori a un micrometro quadrato e mantenere le forze di imaging il più basse possibile.

Immagine dell'esempio in modalità tocco. Caricare i dati nel Gwyddion e rilevare le particelle attraverso i granelli di segno per funzione di soglia. Regolate il valore della soglia di altezza per mascherare le singole particelle.

Di solito, un livello intorno al 50% è un buon punto di partenza. Rimuovere lo sfondo polinomiale per appiattire l'immagine e attivare l'opzione escludi area mascherata. Esportare i valori massimi di altezza delle particelle rilevate utilizzando la distribuzione di varie caratteristiche granulose e ripetere questi passaggi per tutte le immagini registrate.

In questo esperimento, la ricostituzione delle particelle HDL è stata eseguita attraverso la delipidazione delle particelle HDL, seguita da rilipidazione e dialisi. È possibile ottenere una resa del 50% delle particelle HDL ricostitute. Tuttavia, la stessa etichettatura con microRNA non era fattibile per l'etichettatura delle particelle LDL, a causa dell'idrofobicità della proteina apolipoproteina B100.

Pertanto, DMSO è stato utilizzato per la penetrazione del monostrato lipidico delle particelle LDL, con una resa vicina al 100% Durante il controllo di qualità, la diluizione è fondamentale per l'analisi. L'immagine superiore mostra una densità di particelle troppo elevata. L'immagine inferiore è adatta per l'analisi.

Le funzioni di densità di probabilità delle altezze delle particelle sono state calcolate per il confronto delle distribuzioni delle dimensioni delle particelle lipoproteine di controllo native, etichettate ed etichettate. La modifica relativa prima e dopo la procedura di etichettatura è trascurabile. Quando si maneggiano oligonucleotidi RNA, lavorare senza RNA.

Utilizzare materiali di consumo freschi in plastica usa e getta e indossare sempre guanti. Utilizzare solo soluzioni senza nucleasi. L'AFM ad alta velocità è solo un metodo per determinare la forma generale delle lipoproteine.

Un metodo alternativo sarebbe la microscopia elettronica. Indossare adeguate attrezzature di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante durante la manipolazione dell'etere dietile.