Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb
8 giugno 2019
Qui viene presentato un modello sperimentale critico di ischemia dell'arto posteriore seguito da una batteria di test funzionali, istologici e molecolari per valutare l'efficacia delle terapie angiogeniche.
L'obiettivo generale di questo esperimento, il nostro modello di ischemia hindlimb è quello di illuminare l'esperimento come base per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari degli agenti angiogenici putativi. Questo protocollo eroga uno standard per il test di possibili terapie angiogeniche in un piccolo modello animale con il potenziale per applicazioni future nel contesto clinico. Poiché la rivascolarizzazione non è adatta nel venti-trenta per cento dei pazienti critici con ischemia, l'angiogenesi terapeutica è emersa come una nuova strategia per migliorare la profusione di sangue nel sito ischemico.
Questo protocollo sperimentale potrebbe fornire una comprensione completa dei meccanismi attraverso i quali le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti nella misura della loro efficacia in ciascuno dei loro risultati. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piede in un topo femmina C57 nero di 22 settimane, radersi i capelli dall'arto posteriore destro e fissare l'animale nella posizione dorsale a cubito su un cuscinetto riscaldato. Posizionare l'animale al microscopio di sezionamento.
E usa una lama chirurgica bisturi numero undici per fare un'incisione cutanea di un centimetro sulla coscia dell'arto posteriore destro. Sezionare contundente il grasso sottocutaneo per esporre il fascio neurovascolare. E usa pinzi appuntiti, forbici a molla e un portaaghi oftalmici per aprire la fodera ileofemorale membraneale per esporre i vasi iliac e femoral esterni distale.
Dopo aver sezionato e separato l'arteria e la vena dal nervo, utilizzare sette suture di polipropilene non assorbibili per legare l'arteria e la vena femorale distale e l'arteria iliaca esterna distale e la vena. L'identificazione dell'arteria iliaca esterna distale e la legatura e l'escissione dell'arteria iliaca esterna distale e femorale e delle vene sono fondamentali per il successo della procedura. Usa le forbici a molla per trasliare il segmento dell'arteria iliofemorale e le vene tra i nodi distale e prossimale.
E chiudere l'incisione con una sutura assorbibile. Quindi, fornire inter-peritonealmente soluzione antisedativa nell'animale e riportare il topo nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Per raccogliere i muscoli gastroclio, rimuovere la pelle da entrambi gli arti posteriori.
E usa il batuffolo di cotone per separare la pelle dai muscoli. Tenendo il tendine d'Achille, utilizzare le forbici a molla per separare il muscolo dalla tibia e dalla perone fino all'articolazione del ginocchio. E separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemio.
Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti del muscolo gastrocnemio a livello dell'articolazione del ginocchio. E usa il 10%trigasanth per posizionare i muscoli raccolti con un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero. Quindi, snap congelare i campioni in azoto liquido raffreddato isopentane per meno 80 gradi Celsius stoccaggio.
Per la cattura laser a microdisezione capillare, dopo aver ottenuto sezioni di 12 micrometri dei campioni muscolari, fissare i tessuti alle diapositive in 50 millilitri di acetone puro raffreddato per cinque minuti a meno venti gradi Celsius. Dopo l'essiccazione dell'aria e cerchiare ogni esemplare con una penna idrofobica. E reidratare i campioni con due cloruri di sodio molare in PBS a quattro gradi Celsius.
Al termine della reidratazione, etichettare i campioni con l'anticorpo primario appropriato di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. Seguito da due lavaggi di tre minuti in cloruro di sodio molare fresco in PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, etichettare le sezioni con un anticorpo secondario appropriato per trenta minuti a quattro gradi Celsius seguito da due lavaggi in cloruro di sodio in PBS come dimostrato.
Successivamente, etichettare i campioni con complesso di perossidasi coniugato avidina per trenta minuti a quattro gradi celsius. Seguito da un lavaggio e cinque minuti di etichettatura con substrato di perossidasi DAB. Al termine dell'incubazione, disidratare i tessuti in ghiaccio freddo sequenziale al 90% di etanolo e al 100% di emersioni di etanolo.
Quindi, utilizzare un successivo sistema di microdisezione, dotato di un laser a stato solido da 355 nanometri per sezionare 10.000 capillari per topo e catapultare i capillari della seziona in un cappuccio adesivo a tubo di microfugo. Come illustrato, una completa perdita di perfusione dell'arto posteriore si osserva immediatamente dopo l'induzione dell'ischemia dell'arto posteriore. La valutazione quantitativa del flusso sanguigno, espressa come rapporto tra isc e arto NISC, ha dimostrato una perfusione di sangue degli arti significativamente migliorata nei topi esposti allo stimolo pro-angiogenico ai giorni 15 e 45 post-HLI.
La quantificazione dei capillari positivi cd31 nelle sezioni istologiche delle sezioni del tessuto muscolare gastrocnomio mostra che la densità capillare è maggiore nell'arto ischemico rispetto all'arto non ischemico. Come previsto. Ma questo effetto viene ulteriormente amplificato dopo il trattamento con l'agente pro-angiogenico.
Anche la densità collaterale del vaso aumenta costantemente nell'arto ischemico e questo aumento è significativamente più elevato dopo l'esposizione con lo stimolo pro-angiogenico. L'analisi inversa della reazione a catena della transcriptasi polimerasi dell'espressione genica pro-angiogenica nelle cellule endoteliali positive del CD31 dimostra una chiara variazione nell'espressione genica tra topi esposti o meno all'agente pro-angiogenico. È importante utilizzare un ago oftalmico più vecchio per aprire la fodera iliofemorale membraneale per evitare lo strappi dell'arteria e della vena durante la dissezione del vaso.
Il vaso risponde all'ischemia hindlimb nelle misurazioni perfusioni basate su doppler laser e la quantificazione istologica della densità capillare del vaso ci consente di valutare l'angiogenesi.
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Panoramica
Questo articolo presenta un modello sperimentale di ischemia degli arti posteriori progettato per valutare l'efficacia di terapie angiogeniche attraverso valutazioni funzionali, istologiche e molecolari. Il protocollo mira a stabilire una base per testare potenziali agenti angiogenici in un modello animale di piccola taglia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Angiogenesi
- Ischemia
Sfondo
- La rivascolarizzazione non è adatta al 20-30% dei pazienti con ischemia critica.
- L'angiogenesi terapeutica è una strategia innovativa per migliorare la perfusione sanguigna.
- Lo studio mira a comprendere i meccanismi alla base delle terapie angiogeniche.
- Questo modello potrebbe avere applicazioni cliniche future.
Scopo dello studio
- Valutare gli effetti funzionali delle terapie angiogeniche.
- Valutare i cambiamenti istologici in risposta al trattamento.
- Analizzare gli esiti molecolari degli agenti angiogenici.
Metodi Utilizzati
- Creazione di un modello di ischemia dell'arto posteriore nei topi.
- Valutazioni funzionali mediante risposta alla compressione delle dita dei piedi.
- Analisi istologica dopo il trattamento.
- Test molecolari per valutare l'efficacia della terapia.
Risultati principali
- Dimostrato l'efficacia del modello nella valutazione delle terapie angiogeniche.
- Fornito informazioni sugli esiti funzionali e istologici.
- Individuati potenziali meccanismi d'azione degli agenti angiogenici.
- Sostenuto le future applicazioni cliniche dei risultati.
Conclusioni
- Il modello di ischemia dell'arto posteriore è uno strumento prezioso per la ricerca.
- Le terapie angiogeniche mostrano potenzialità nel migliorare le condizioni ischemiche.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni cliniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo stabilisce un modello murino riproducibile di ischemia degli arti inferiori per valutare terapie angiogeniche nell'ischemia critica degli arti, una condizione per cui il 20-30% dei pazienti non è idoneo alla rivascolarizzazione. Permettendo una valutazione funzionale, istologica e molecolare del recupero della perfusione, della densità capillare e dell'espressione genica angiogenica, il modello supporta la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nei programmi preclinici di angiogenesi. Fornisce un quadro traslazionale per selezionare i candidati principali prima dell'investimento clinico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette di verificare ipotesi relative all'angiogenesi terapeutica attraverso esiti quantificabili di perfusione e densità capillare.
- Valore operativo: Fornisce un modello chirurgico standardizzato per isolare l'effetto di stimoli pro-angiogenetici sulla risposta del tessuto ischemico.
- Valore predittivo: Sostiene la validità del bersaglio collegando l'espressione genica angiogenetica nelle cellule endoteliali al recupero funzionale del flusso ematico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera parametri quantitativi tra cui rapporti di perfusione Doppler a laser, densità di capillari positivi per CD31 e conteggio dei vasi collaterali per lo screening di composti.
- Riproducibilità: Utilizza procedure standardizzate di legatura ed escissione per garantire un'induzione consistente dell'ischemia tra i diversi gruppi di studio.
- Scalabilità: Consente la microdissezione laser guidata da cattura di cellule endoteliali per il profilo molecolare tra i diversi gruppi trattati.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Modella la fisiopatologia dell'ischemia critica degli arti per valutare i meccanismi delle terapie angiogeniche in un contesto clinicamente rappresentativo.
- Continuità traslazionale: Collega le firme molecolari angiogeniche agli esiti istologici e funzionali per decisioni allineate ai biomarcatori.
- Progressione aggiustata per il rischio: Permette decisioni di avanzamento o interruzione basate su una validazione multilivello della perfusione, dell'istologia e dell'espressione genica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla sperimentazione dell'efficacia preclinica, fornendo un sistema rilevante per la malattia in cui valutare terapie angiogeniche.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su fattori angiogenici mediante letture funzionali della perfusione e dell'angiogenesi istologica.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per confrontare le risposte dell'arto ischemico e di quello trattato.
- Analisi: Permette il confronto statistico tra rapporti di perfusione, densità capillare ed espressione genica mediante RT-PCR in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Correla l'espressione genica angiogenica nelle cellule endoteliali al rimodellamento vascolare a livello tissutale per ottenere informazioni meccanicistiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di agenti angiogenici in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica correlando l'espressione genica angiogenica con la perfusione funzionale e la crescita capillare.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso flussi di lavoro chirurgici, istologici e molecolari standardizzati.
- Valore strategico: Migliora le decisioni precliniche di avanzamento o interruzione integrando dati di efficacia multiparametrici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio dei candidati angiogenici in base all'interazione con la proteina bersaglio e alla modulazione del percorso biologico validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella legatura microchirurgica e nell'escissione dei vasi in modelli murini.
- È dipendente dalla disponibilità di infrastrutture per l'imaging della perfusione mediante laser Doppler, la colorazione istologica e la microdissezione con laser.
- Necessita di standardizzazione nei processi di preparazione istologica, marcatura con anticorpi e protocolli di RT-PCR per ottenere letture molecolari consistenti.
- Richiede considerazioni di adattamento quando si applica il modello a diversi background genetici o modalità terapeutiche.
- È limitato dalla capacità del modello murino di riprodurre pienamente le comorbidità umane associate all'ischemia critica degli arti.
