Name: Valutazione dellangiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Scopri la valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello murino di ischemia degli arti posteriori. Questo metodo permette analisi funzionali, istologiche e molecolari per testare agenti angiogenici.

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Ringraziamo José Rino e Taria Carvalho, capi della struttura di bioimaging e Del Laboratorio di Patologia Materica e Patologia Comparata dell'Instituto de Medicina Molecular Joo Lobo Antunes, rispettivamente. Ringraziamo anche Vyacheslav Sushchyk del Dipartimento di Anatomia della Nova Medical School/Faculdade de Cioncias Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Finanziamento di riferimento: progetto finanziato da UID/IC/0306/2016 Fundao para a Ciància e a. Paula de Oliveira è sostenuta da una borsa di studio (SFRH/BD/80483/2011) di Fundao para a Ciància e Tecnologia.

Tutte le procedure sugli animali sono conformi alla direttiva 2010/63/EU e sono state approvate dall'Institutional Animal Welfare Body e autorizzate dalla DGAV, l'autorità competente portoghese per la protezione degli animali (numero di licenza 023861/2013)
AVVISO: Molte delle sostanze chimiche utilizzate nei protocolli sono tossiche e nocive. Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate e attrezzature protettive personali (guanti, camice da laboratorio, pantaloni a figura intera e scarpe chiuse)
1. Il modello murino dell'ischemia dell'arto posteriore
NOTA: Tutti gli esperimenti vengono eseguiti su topi di 22 settimane di vita femminile.
<ol><li>Preparazione delle soluzioni
	<ol>
<li>
Preparazione della soluzione anestetica Nota: Questa combinazione anestetica (medetomidina e ketamina) fornisce fino a 30 min immobilizzazione e una finestra chirurgica di 15 min. L'effetto può essere annullato dalla somministrazione di atipamezolo.<ol>
<li>Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 1 mL di medetomidina (1 mg/kg di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungilo a un tubo falco da 15 mL.</li>
			<li>Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 0,75 mL di Ketamina (75 mg/kg di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungila a un tubo falco da 15 mL contenente la medetomina.</li>
			<li>Aggiungere 8,25 mL di salina sterile (0,9% NaCl), al fine di ottenere 10 mL di soluzione anestetica.</li>
			<li>Identificare il tubo con il nome dei composti, la data mista e la data di scadenza.</li>
			<li>Conservare al buio a 4 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparazione della soluzione antiseddativa
		<ol>
<li>Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 1 mL di atipamezolo (5 mg/kg di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungilo a un tubo falco da 15 mL.</li>
			<li>Aggiungere 9 mL di salina sterile (0,9% NaCl), al fine di ottenere 10 mL di soluzione di reversione.</li>
			<li>Identificare il tubo con il nome dei composti, la data mista e la data di scadenza.</li>
			<li>Conservare al buio a 4 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Preparazione della soluzione analgesia post-operatoria
		<ol>
<li>Con una siringa pulita da 1 cc, preleva 0,5 mL di buprenorfine (100 l/15-30 g di peso corporeo), elimina le bolle d'aria per misurazioni accurate e aggiungile a un tubo di falco da 15 mL.</li>
			<li>Aggiungere 9,5 mL di salina sterile (0,9% NaCl), al fine di ottenere 10 mL di soluzione analgesia.</li>
			<li>Identificare il tubo con il nome dei composti, la data mista e la data di scadenza.</li>
			<li>Conservare al buio a 4 gradi centigradi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione chirurgica dell'ischemia dell'arto posteriore
	<ol>
<li>Strumenti chirurgici necessari per questo intervento: pinze appuntite, forbici a molla, porta aghi oftalmici, forbici chirurgiche e un supporto di aghi. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in un autoclave prima dell'uso. Utilizzare tamponi di cotone per la dissezione del grasso sottocutaneo.</li>
		<li>Caricare la siringa con la soluzione di anestesia prima di tenere premuto il mouse.</li>
		<li>Restringere l'animale applicando la forza dietro le orecchie contro la griglia della gabbia, tenendo più pelle possibile per mantenere il mouse immobile.</li>
		<li>Mantenere l'animale inclinato con la testa abbassata ed eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione di anestesia, mantenendo la siringa ad un angolo di 45 gradi con il corpo del mouse.</li>
		<li>Verificare l'assenza di riflessi di ritiro del pedale, per valutare la profondità dell'anestesia.</li>
		<li>Rimuovere i capelli dall'arto posteriore destro utilizzando un rasoio elettrico. Utilizzare uno scrub per il sapone disinfettante al cloro per la preparazione della pelle. Utilizzare un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il suds. Applicare uno scrub chirurgico clorhesidine e proteggere la zona della pelle con un drappo sterile prima di trasportare i topi nella suite sterile chirurgica.</li>
		<li>Posizionare l'animale in decubito dorsale e trattenerlo con i quattro arti divaripiati e fissati con nastro adesivo. AGGIORNAMENTO: Eseguire la procedura su un cuscinetto riscaldato per mantenere stabile la temperatura corporea dell'animale; la procedura chirurgica viene eseguita utilizzando un microscopio di dissezione a ingrandimento 10x o 20x.</li>
		<li>Applicare una soluzione antisettica clobroxidina utilizzando garza sterile per finalizzare la preparazione della pelle. Utilizzando una lama bisturi chirurgica numero 11 eseguire un'incisione cutanea di 1 cm sovrastante la coscia dell'arto posteriore destro.</li>
		<li>Grasso sottocutaneo contundente esponendo il fascio neurovascolare. Utilizzando le pinze appuntite, le forbici a molla e il supporto dell'ago oftalmico, aprono la membranosa diottuga il-femorale per esporre i vasi iliaci e femorali esterni distali.</li>
		<li>Dissezionare e separare i vasi (arteriosa e vena) dal nervo. Utilizzando un sutura in polipropilene 7.0 non assorbibile, legiano l'arteria e la vena iliache esterne distese e l'arteria e la vena femorale distale.</li>
		<li>Transettale il segmento dell'arteria ilio-femorale e le vene tra i nodi distale e prossimale con le forbici primaverili.</li>
		<li>Chiudere l'incisione con una sutura assorbibile (ad esempio, sutura Vicryl 5.0).</li>
		<li>Caricare la siringa con la soluzione antisederativa e utilizzare lo stesso metodo descritto in 1.2.3 e 1.2.4 per eseguire un'iniezione intraperitale della soluzione antisederativa.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitoraggio post-operatorio NOTA: Gli animali sono attentamente osservati ogni 15-20 min per assicurarsi che tutti gli animali si riprendano bene dall'anti-sedativo; animali anestesizzati non vengono mai lasciati incustoditi.<ol>
<li>Valutare il recupero dall'anestesia: 1) monitorare la velocità e la profondità della respirazione; 2) valutare i riflessi degli animali (posizione del pedale e degli occhi)</li>
		<li>Eseguire un'iniezione sottocutanea dell'analgesia post-operatoria ogni 8-12 h.</li>
		<li>Monitorare gli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico che registra una breve descrizione dello stato di salute dell'animale e l'aspetto del sito chirurgico, assicurarsi che tutte le suture siano chiuse.</li>
		<li>Ri-sutura l'incisione, se si verifica la dehiscenza. In caso di esito negativo, applicare una pellicola di barriera cutanea sull'incisione per proteggere da urina, escrezioni fecali, attrito e taglio della pelle e per aiutare il processo di guarigione.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Valutazione dell'effetto angiogenico
NOTA: Dopo l'induzione dell'ischemia, applicare l'agente terapeutico nello studio e ottenere le seguenti procedure. Le misure intraprese in altri momenti sono descritte in dettaglio nella sezione corrispondente.
<ol><li>Immagini perfusione Laser Doppler
	<ol>
<li>Rimuovere i capelli da entrambe le zampe posteriori un giorno prima dell'analisi utilizzando un rasoio elettrico seguito da crema depilatoria.</li>
		<li>Anestetizza recitizzai i topi utilizzando la soluzione anestetica.</li>
		<li>Posizionare l'animale su una piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi per 5 min per garantire che la temperatura non cambi durante la procedura</li>
		<li>Posizionare l'animale in posizione supina con le gambe fissate in posizione estesa. Misurare la distanza tra le zampe e i piedi destro e sinistro per ogni animale poiché il posizionamento dell'animale deve essere simile ogni volta che la procedura deve essere ripetuta per seguire i cambiamenti nella perfusione dell'arto posteriore nel tempo.</li>
		<li>Iniziare ad acquisire dati utilizzando un imager perfusione Doppler laser.</li>
		<li>Al termine dell'acquisizione, ripristinare l'anestesia con la soluzione antisederativa.</li>
		<li>Aprire il software di analisi delle immagini e disegnare la regione di interesse (ROI) intorno all'arto posteriore ischemico e un ROI simile intorno all'arto posteriore non ischemico.</li>
		<li>Osservare i valori del flusso e determinare la perfusione come un rapporto tra la perfusione nell'arto ischemico a quella nell'arto non ischemico. Le variazioni del rapporto di perfusione vengono misurate nel tempo.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi immunoistochimica e densità capillare
	<ol>
<li>Dopo l'anestesizzazione, sacrificare i topi con la lussazione cervicale.</li>
		<li>Per raccogliere i muscoli gastrocnemius di entrambe le gambe, in primo luogo, rimuovere la pelle da entrambe le zampe posteriori.</li>
		<li>Identificare il tendine d'Achille e separare il tendine dall'osso utilizzando un bisturi a 11 lama.</li>
		<li>Tenere il tendine d'Achille e separare il muscolo dalla tibia e dal perone fino all'articolazione del ginocchio con le forbici primaverili.</li>
		<li>Separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemius.</li>
		<li>Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti dei muscoli gastrocnemius a livello articolare del ginocchio.</li>
		<li>Posizionare i muscoli gastrocnemius raccolti in un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero con l'aiuto del 10% di tragacanth.</li>
		<li>Agganciare i campioni in isopentane liquido raffreddato ad azoto e conservarli a -80 gradi fino alla sezionamento.</li>
		<li>Tagliare 7 sezioni di m degli esemplari muscolari su un criostato e montare su vetrini di vetro. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
		<li>Fissare i vetrini di vetro in una bottiglia contenente acetone puro raffreddato (circa 50 mL) per 10 min, a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Aggiungere la perossia di idrogeno 0,3% diluita in metanolo (50 mL) per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare due volte in salina con buffer fosfato (PBS) (50 mL) per un totale di 10 min.</li>
		<li>Utilizzare una penna idrofobica intorno alle sezioni. NOTA: L'uso di una penna idrofobica consente di ridurre la quantità di soluzioni spese durante il protocollo. Per tutte le incubazioni utilizzare 100 l di tutte le soluzioni, per sezione.</li>
		<li>Applicare una soluzione di blocco del 5% di siero di coniglio in PBS per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubare gli esemplari per 1 h a temperatura ambiente con anticorpo monoclonale anti-CD31 diluito all'1:500 nell'1 % di albumina di siero bovino (BSA) in PBS.</li>
		<li>Lavare tre volte in PBS per un totale di 30 min.</li>
		<li>Aggiungere un anticorpo igG anti-ratto di coniglio biotinylato secondario a 1:200 in 1% BSA in PBS e 5% siero di coniglio per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare in PBS come prima e aggiungere etichettato complesso di perossidasi avidin-coniugato per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Risciacquare 3 volte in PBS per 5 min e aggiungere diaminobenzidina (DAB) peroxidase kit substrato per altri 5 min.</li>
		<li>Controsta le sezioni con ematossilina per 10 s prima del montaggio.</li>
		<li>Misurare le densità capillari utilizzando un microscopio a campo luminoso verticale (cioè, numero di capillari per numero di miociti) in 2 diverse sezioni di 4 aree anatomiche distinte in ogni esemplare.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusione agente di contrasto
	<ol>
<li>Anestetizza recitizzai i topi utilizzando la soluzione anestetica.</li>
		<li>Eseguire una laparotomia mediana utilizzando una lama bisturi numero 15.</li>
		<li>Esporre l'aorta addominale e la cavodale vena cava, dopo aver ritrattato lateralmente il piccolo intestino e utilizzando forbici primaverili.</li>
		<li>Inserire un catetere calibro 26 cranialmente nell'aorta addominale e un altro nella cava caudale nella stessa direzione.</li>
		<li>Cateteri sicuri in posizione utilizzando una sutura di seta 5/0 per eseguire una sutura di soggiorno.</li>
		<li>Lavare il sistema vascolare con una soluzione salina a 37 gradi centigradi contenente l'eparina (500 unità/100 mL) spinta nell'aorta addominale utilizzando una siringa da 10 mL. Continuare la perfusione delicata fino a quando non si vede una soluzione chiara che esce dal catetere posto all'interno della vena cava caudale. NOTA: Di solito sono necessari da 30 a 40 mL di una soluzione salina eparana per sciacquare il sistema vascolare di un ratto adulto.</li>
		<li>Somministrare una miscela di adenosina (1 mg/L) e papaverina (4 mg/L) per 2 min.</li>
		<li>Iniettare nel catetere aortico 10 mL di una miscela di 50% solfato di barium e 5% gelatina. NOTA: La soluzione deve essere mantenuta a 60 gradi centigradi per evitare l'ispessimento.</li>
		<li>Lasciare i topi a - 4 gradi centigradi per almeno 4 h, al fine di consentire al cast vascolare di solidificare.</li>
		<li>Rimuovere la pelle dal corpo inferiore di ogni mouse.</li>
	</ol></li>
	<li>Diafonizzazione - Tecnica Spalteholz
	<ol>
<li>Fissare i topi per immersione in una soluzione di formaldeide 10% per almeno 72 h.</li>
		<li>Sbiancare i topi per immersione in una soluzione di perossido di idrogeno del 30% per 24 h.</li>
		<li>Disidratare i topi utilizzando la tecnica di sostituzione del congelamento. Questa metodologia consiste nel sottoporre i topi a passaggi successivi (in media quattro) di acetone puro a - 20 gradi centigradi per 24 h ciascuno.</li>
		<li>Chiarire i topi immergendoli in una soluzione contenente una miscela di benzoato 100% benzile e salicilato di metile 100% in una proporzione 3:5 (questa miscela è anche conosciuta come soluzione Spalteholz) 13.</li>
		<li>Lasciare i topi immersi nella soluzione Spalteholz all'interno di una camera a vuoto fino a quando non diventa diafano, che di solito richiede da 5 a 7 giorni.</li>
		<li>Sostituire la soluzione, se diventa scura prima che il campione diventi chiaro.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificazione delle navi multilaterali
	<ol>
<li>Osservare i topi sospesi nella soluzione Spalteholz sotto traslazione utilizzando un microscopio stereotassico. Utilizzare pinze microchirurgiche per afferrare delicatamente e spostarlo.</li>
		<li>Fotografa interi arti utilizzando una fotocamera digitale collegata al microscopio.</li>
		<li>Ottenere intere fotografie dell'arto utilizzando il software appropriato.</li>
		<li>Eseguire una segmentazione manuale dei vasi collaterali evidenziandoli utilizzando il software appropriato. NOTA: I vasi collaterali sono definiti secondo la definizione di Longland, uno stelo definito, una zona intermedia e un rientrante, con un diametro compreso tra 20 e 300 m, escluse le arterie femorali, sapheno e popliteali e tutte le strutture venose.</li>
		<li>Definire i ROI in ogni topo nella stessa regione anatomica nell'adduttore, circostante e sotto l'occlusione chirurgica.</li>
		<li>Quantificare la densità dei recipienti collaterali (CVD) in ROI equivalenti pari al 20% della superficie totale degli arti. Il CVD viene calcolato come rapporto tra l'area vascolare e le aree ROI. Tutte le misurazioni della densità vengono eseguite utilizzando il software ImageJ. NOTA: Si presume che il valore CVD dell'arto non ischemico per ogni topo corrisponda al 100% per escludere le variazioni nelle procedure di anatomia, perfusione o diafonizzazione. La percentuale di CVD nell'arto ischemico è stata, quindi, calcolata rispetto a quella non ischemica.</li>
		<li>Determinare la percentuale di aumento CVD come differenza tra la percentuale di CVD tra gli arti ischemici e nonicimici.</li>
	</ol></li>
	<li>Microdissezione laser di cattura dei capillari
	<ol>
<li>Dopo l'anestesizzazione, sacrificare i topi con la lussazione cervicale.</li>
		<li>Per raccogliere i muscoli gastrocnemius di entrambe le gambe, rimuovere la pelle dai topi entrambi gli arti posteriori.</li>
		<li>Identificare il tendine d'Achille e separare il tendine dall'osso utilizzando un bisturi a 11 lama.</li>
		<li>Tenere il tendine d'Achille e separare il muscolo dalla tibia e dal perone fino all'articolazione del ginocchio con le forbici primaverili.</li>
		<li>Separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemius.</li>
		<li>Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti dei muscoli gastrocnemius a livello articolare del ginocchio.</li>
		<li>Posizionare i muscoli gastrocnemius raccolti in un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero con l'aiuto del 10 % tragacanth.</li>
		<li>Agganciare i campioni in isopentane liquido raffreddato ad azoto e conservarli a -80 gradi fino alla sezionamento.</li>
		<li>Tagliare su un criostat 12 sezioni m degli esemplari muscolari e montare su vetrini di vetro. NOTA: Per la protezione dell'RNA, prendere uno scivolo preraffreddato e toccare il retro del vetrino con il dito (guanti) per riscaldare solo la regione per posizionare la sezione. Trasferire la sezione dal coltello criostato toccando con la zona riscaldata e asciugare a -20 gradi centigradi nel criostato per 2-3 min. Il protocollo può essere messo in pausa qui.<ol>
<li>Fissare i vetrini di vetro in una bottiglia contenente acetone puro raffreddato (circa 50 mL) per 5 min a -20 gradi centigradi e asciugarli ad aria.</li>
			<li>Utilizzare una penna idrofobica intorno alle sezioni. NOTA: L'uso della penna idrofobica aiuta a ridurre la quantità di soluzioni spese durante il protocollo. Per tutte le incubazioni utilizzare 100 l di tutte le soluzioni, per sezione.</li>
			<li>Reidratare con 2 M NaCl/PBS a 4 gradi centigradi e incubare i campioni durante la notte a 4 gradi con anticorpi monoclonali anti-CD31 ratto a 1:500 in 2M NaCl/PBS.</li>
			<li>Lavare due volte in 2M NaCl/PBS per un totale di 6 min.</li>
			<li>Aggiungere un anticorpo igG anti-ratto di coniglio biotinylato secondario a 1:200 in 2M NaCl/PBS e il 5% di siero di coniglio per 30 min a 4 gradi centigradi.</li>
			<li>Lavare in 2 M NaCl/PBS come prima e aggiungere etichettato complesso di perossidasi avidino per 30 min a 4 gradi centigradi.</li>
			<li>Sciacquare e aggiungere il kit substrato DAB perossidasi per 5 min.</li>
			<li>Disidratare le sezioni in etanolo freddo 90 % seguite dal 100 % di etanolo e lasciarle asciugare.</li>
			<li>Dissect 10 000 capillari per topi utilizzando un sistema di microdissezione laser dotato di un laser a stato solido pulsato 355 nm e catapultare i capillari sezionati in un adesivo-cap tubo di microfuge.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Estrazione di RNA, sintesi cDNA, pre-amplificazione e RT-PCR
	<ol>
<li>Isolare l'RNA totale dai capillari microotteded utilizzando un kit appropriato, l'RNA totale ottenuto è compreso tra 1,5-3 ng/L.</li>
		<li>Utilizzare un kit di sintesi cDNA per la sintesi e due cicli di pre-amplificazione, utilizzando i primer descritti nella Tabella 1.</li>
		<li>Eseguire RT-PCR per le stesse destinazioni descritte nel passaggio precedente. Utilizzare un programma composto da una fase di denaturazione iniziale a 95 gradi centigradi per 10 min, seguito da 50 cicli a 95 gradi centigradi per 15 s e a 60 gradi centigradi per 1 min.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I modelli Murine di CLI sono per lo più costituiti in legatura dell'arteria femorale appena distale all'origine della profunda femoris 4,5,6,7,8,9. Questo ha dimostrato di lasciare intatta la maggior parte della circolazione collaterale, che ripristina il flusso sanguigno all'arto entro 7 giorni 9. La ...

La malattia arteriosa periferica (PAD) colpisce prevalentemente gli arti inferiori. La TORca è causata dall'aterosclerosi, un'ostruzione arteriosa che può causare gravi restrizioni al flusso sanguigno negli arti inferiori1. La claudicazione intermittente è la prima manifestazione del PAD e si riferisce al dolore muscolare quando si cammina. La CLI è lo stadio più grave del PAD, diagnosticata in pazienti che mostrano dolore ischemico di riposo, ulcere o cancrena2. I pazienti con CLI hanno un alto rischio di amputazione, soprattutto se non trattati3. La risanamento degli arti inferiori (sia per chirurgia aperta che per una procedura endovascolare) è attualmente l'unico modo per ottenere il recupero degli arti. Tuttavia, circa il 30% dei pazienti CLI non è adatto a queste procedure, per motivi che includono la localizzazione delle lesioni, il modello di occlusione arteriosa e l'ampia comorbilità4,5. Pertanto, sono necessarie nuove terapie per questi pazienti altrimenti non trattabili, con la promozione dell'angiogenesi è la strategia in un'indagine più intensa.
Prima di effettuare test nell'uomo, l'efficacia e la sicurezza delle nuove terapie in vivo devono essere considerate nei modelli animali. Diversi modelli sono stati sviluppati per lo studio di CLI, principalmente inducendo l'ischemia dell'arto posteriore (HLI) nei topi6,7,8,9,10. Tuttavia, questi modelli differiscono in diversi aspetti, tra cui la natura delle arterie che vengono legate e/o eccitate e se le vene e i nervi circostanti sono sezionati come pure6,7,8, 9,10. Nel loro insieme, questi aspetti influenzeranno la gravità della lesione ischemiera-reperfusione in ogni animale, rendendo i risultati difficili da confrontare. Pertanto, è fondamentale sviluppare un protocollo efficace in cui la procedura per indurre l'ischemia e la valutazione dei diversi obiettivi dovrebbe essere standardizzata per valutare se una determinata terapia angiogenica sarà efficace. Un protocollo sperimentale progettato per coprire tutti questi aspetti fornirebbe una comprensione completa dei meccanismi con cui le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti e una misura della loro efficacia a ciascuno dei loro risultati. Due opere distinte recentemente pubblicate dal nostro team sono un buon esempio11,12, in cui diversi approcci per indurre l'angiogenesi terapeutica sono stati valutati utilizzando lo stesso protocollo che sarà descritto con più dettagli in questo protocollo.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere un modello sperimentale riproducibile in grado di imitare gli effetti della CLI e gettare le basi sperimentali per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari della putagenia angiogenica Agenti.

<table><tbody><tr><td>7500 Fast Real-Time PCR</td><td>Strumento Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merk</td><td>1000141000</td><td>Reagente; Attenzione - altamente infiammabile</td></tr><tr><td>Adenosina</td><td>Valdepharm</td><td></td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Atipamezolo</td><td>OrionReagente</td><td></td><td>farmaceutico</td></tr><tr><td>Solfato di bario (Micropaque)</td><td>Guebert</td><td>8671404 (ref. Infarmed)</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>RichterReagente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>farmaceutico Carl Zeiss Opmi-1 FC Microscopio operatorio</td><td>Carl Zeiss, Germania</td><td></td><td>Strumento</td></tr><tr><td>cDNA RT2 PreAMP Kit di sintesi di cDNA</td><td>Qiagen</td><td>7335730</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Criostato Leica CM</td><td>Leica Microsystems</td><td>3050S</td><td>Strumento</td></tr><tr><td>DAB kit substrato perossidasi</td><td>DAKO; Vector Laboratories</td><td>K3468</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>perossidasi di idrogeno</td><td>Merk</td><td>1072090250</td><td>; Attenzione - nocif</td></tr><tr><td>penna idrofobica</td><td>Dako</td><td>411121</td><td>Reagente; Attenzione - tossico</td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>Richterpharma</td><td>CN:580393,7 630/01/12 Reagente Dfvf</td><td></td></tr><tr><td>Imager di perfusione laser Doppler moorLDI2-HIR</td><td>MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK</td><td>5710</td><td>Strumento</td></tr><tr><td>Leica DM2500 microscopio verticale a campo chiaro</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Medetor</td><td>Virbac</td><td>037/01/07RFVPT</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>metanolo</td><td>VWR</td><td>UN1230</td><td>Reagente; Attenzione - tossico e altamente infiammabile</td></tr><tr><td>Reagente</td><td>Papaverine</td><td>Labesfal</td><td></td></tr><tr><td>Pentano Isso</td><td>Merk</td><td>1060561000</td><td>Reagente; Attenzione - Potere altamente infiammabile</td></tr><tr><td>SYBR&reg; Green</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>4309155 Reagente</td></tr><tr><td>Purificato anti-topo CD31</td><td>Pharmingen</td><td>550274</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>RNeasy Micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Surgic-Pro 6.0</td><td>Medtronic (Coviden)</td><td>VP733X</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC HRP Kit (Perossidasi, Rat IgG)</td><td>Vectastain ABC kit; Vector Laboratories</td><td>PK-4004</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Vicryl5.0/ Vicryl 6.0</td><td>Medtronic (Covidien)</td><td>UL202/ UL101</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>Zeiss PALM MicroBeam Sistema di microdissezione laser</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Germania</td><td>1023290916</td><td>Strumento</td></tr><tr><td>Microscopio stereotassico</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Germania</td><td></td><td>Strumento</td></tr><tr><td>Fotocamera digitale</td><td>Linux</td><td></td><td>strumento</td></tr></tbody></table>

valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello murine di ischemia hindlimb

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

L'ischemia degli arti critici (CLI) è una condizione grave che comporta un alto rischio di amputazione degli arti inferiori. Nonostante la risvascolarizzazione sia la terapia gold-standard, un numero considerevole di pazienti CLI non è adatto per la vascolarizzazione chirurgica o endovascolare. Le terapie angiogeniche stanno emergendo come opzione per questi pazienti, ma sono attualmente ancora in fase di studio. Prima dell'applicazione nell'uomo, tali terapie devono essere testate in modelli animali e i suoi meccanismi devono essere chiaramente compresi. Un modello animale di ischemia dell'animale (HLI) è stato sviluppato dalla legatura e dall'escissione delle arterie e delle vene esterne distale nei topi. È stato assemblato un gruppo completo di test per valutare gli effetti dell'ischemia e delle terapie angiogeniche putative a livello funzionale, istologico e molecolare. Laser Doppler è stato utilizzato per la misurazione del flusso e la valutazione funzionale della perfusione. La risposta dei tessuti è stata valutata dall'analisi della densità capillare dopo la colorazione con l'anticorpo anti-CD31 sulle sezioni istologiche del muscolo gastrocnemio e dalla misurazione della densità dei vasi collaterali dopo la diafonizzazione. L'espressione di geni angiogenici è stata quantificata da RT-PCR mirando a fattori angiogenici selezionati esclusivamente nelle cellule endoteliali (EC) dopo la microdissezione di cattura laser dai muscoli gastrocnemius dei topi. Questi metodi erano sensibili nell'identificare le differenze tra gli arti ischemici e non ischemici e tra gli arti trattati e non trattati. Questo protocollo fornisce un modello riproducibile di CLI e un quadro per testare le terapie angiogeniche.

Utilizzando il protocollo descritto, le cellule staminali mesenchymal del cordone ombelicale e le radiazioni ionizzanti a basse dosi (LDIR) sono state testate come terapie angiogeniche putative 11,12. Le letture della perfusione di Laser Doppler sono state ottenute prima dell'induzione dell'ischemia e a tempi pre-specificati che vanno da subito dopo l'induzione dell'ischemia a 45 giorni dopo l'ischemia. Le letture perfusione di tessuti di Doppler laser sono state...

Qui viene presentato un modello sperimentale critico di ischemia dell'arto posteriore seguito da una batteria di test funzionali, istologici e molecolari per valutare l'efficacia delle terapie angiogeniche.

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...

L'obiettivo generale di questo esperimento, il nostro modello di ischemia hindlimb è quello di illuminare l'esperimento come base per una valutazione completa degli effetti funzionali, istologici e molecolari degli agenti angiogenici putativi. Questo protocollo eroga uno standard per il test di possibili terapie angiogeniche in un piccolo modello animale con il potenziale per applicazioni future nel contesto clinico. Poiché la rivascolarizzazione non è adatta nel venti-trenta per cento dei pazienti critici con ischemia, l'angiogenesi terapeutica è emersa come una nuova strategia per migliorare la profusione di sangue nel sito ischemico.Questo protocollo sperimentale potrebbe fornire una comprensione completa dei meccanismi attraverso i quali le terapie angiogeniche esercitano i loro effetti nella misura della loro efficacia in ciascuno dei loro risultati. Dopo aver confermato la mancanza di risposta al dito del piede in un topo femmina C57 nero di 22 settimane, radersi i capelli dall'arto posteriore destro e fissare l'animale nella posizione dorsale a cubito su un cuscinetto riscaldato. Posizionare l'animale al microscopio di sezionamento.E usa una lama chirurgica bisturi numero undici per fare un'incisione cutanea di un centimetro sulla coscia dell'arto posteriore destro. Sezionare contundente il grasso sottocutaneo per esporre il fascio neurovascolare. E usa pinzi appuntiti, forbici a molla e un portaaghi oftalmici per aprire la fodera ileofemorale membraneale per esporre i vasi iliac e femoral esterni distale.Dopo aver sezionato e separato l'arteria e la vena dal nervo, utilizzare sette suture di polipropilene non assorbibili per legare l'arteria e la vena femorale distale e l'arteria iliaca esterna distale e la vena. L'identificazione dell'arteria iliaca esterna distale e la legatura e l'escissione dell'arteria iliaca esterna distale e femorale e delle vene sono fondamentali per il successo della procedura. Usa le forbici a molla per trasliare il segmento dell'arteria iliofemorale e le vene tra i nodi distale e prossimale.E chiudere l'incisione con una sutura assorbibile. Quindi, fornire inter-peritonealmente soluzione antisedativa nell'animale e riportare il topo nella sua gabbia di casa con monitoraggio fino al pieno recupero. Per raccogliere i muscoli gastroclio, rimuovere la pelle da entrambi gli arti posteriori.E usa il batuffolo di cotone per separare la pelle dai muscoli. Tenendo il tendine d'Achille, utilizzare le forbici a molla per separare il muscolo dalla tibia e dalla perone fino all'articolazione del ginocchio. E separare il bicipite femoris dal muscolo gastrocnemio.Utilizzare le forbici a molla per tagliare gli inserimenti del muscolo gastrocnemio a livello dell'articolazione del ginocchio. E usa il 10%trigasanth per posizionare i muscoli raccolti con un orientamento trasversale su un piccolo disco di sughero. Quindi, snap congelare i campioni in azoto liquido raffreddato isopentane per meno 80 gradi Celsius stoccaggio.Per la cattura laser a microdisezione capillare, dopo aver ottenuto sezioni di 12 micrometri dei campioni muscolari, fissare i tessuti alle diapositive in 50 millilitri di acetone puro raffreddato per cinque minuti a meno venti gradi Celsius. Dopo l'essiccazione dell'aria e cerchiare ogni esemplare con una penna idrofobica. E reidratare i campioni con due cloruri di sodio molare in PBS a quattro gradi Celsius.Al termine della reidratazione, etichettare i campioni con l'anticorpo primario appropriato di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. Seguito da due lavaggi di tre minuti in cloruro di sodio molare fresco in PBS per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, etichettare le sezioni con un anticorpo secondario appropriato per trenta minuti a quattro gradi Celsius seguito da due lavaggi in cloruro di sodio in PBS come dimostrato.Successivamente, etichettare i campioni con complesso di perossidasi coniugato avidina per trenta minuti a quattro gradi celsius. Seguito da un lavaggio e cinque minuti di etichettatura con substrato di perossidasi DAB. Al termine dell'incubazione, disidratare i tessuti in ghiaccio freddo sequenziale al 90% di etanolo e al 100% di emersioni di etanolo.Quindi, utilizzare un successivo sistema di microdisezione, dotato di un laser a stato solido da 355 nanometri per sezionare 10.000 capillari per topo e catapultare i capillari della seziona in un cappuccio adesivo a tubo di microfugo. Come illustrato, una completa perdita di perfusione dell'arto posteriore si osserva immediatamente dopo l'induzione dell'ischemia dell'arto posteriore. La valutazione quantitativa del flusso sanguigno, espressa come rapporto tra isc e arto NISC, ha dimostrato una perfusione di sangue degli arti significativamente migliorata nei topi esposti allo stimolo pro-angiogenico ai giorni 15 e 45 post-HLI.La quantificazione dei capillari positivi cd31 nelle sezioni istologiche delle sezioni del tessuto muscolare gastrocnomio mostra che la densità capillare è maggiore nell'arto ischemico rispetto all'arto non ischemico. Come previsto. Ma questo effetto viene ulteriormente amplificato dopo il trattamento con l'agente pro-angiogenico.Anche la densità collaterale del vaso aumenta costantemente nell'arto ischemico e questo aumento è significativamente più elevato dopo l'esposizione con lo stimolo pro-angiogenico. L'analisi inversa della reazione a catena della transcriptasi polimerasi dell'espressione genica pro-angiogenica nelle cellule endoteliali positive del CD31 dimostra una chiara variazione nell'espressione genica tra topi esposti o meno all'agente pro-angiogenico. È importante utilizzare un ago oftalmico più vecchio per aprire la fodera iliofemorale membraneale per evitare lo strappi dell'arteria e della vena durante la dissezione del vaso.Il vaso risponde all'ischemia hindlimb nelle misurazioni perfusioni basate su doppler laser e la quantificazione istologica della densità capillare del vaso ci consente di valutare l'angiogenesi.

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La procedura chirurgica per l'induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterale è dimostrato, con la conferma di ischemia da imaging laser Doppler perfusione.

Modello murino di ischemia degli arti posteriori

Normale adulto tessuto vascolarizzato mammiferi che manca l'angiogenesi fisiologica e che non è stata esposta a un intervento chirurgico viene utilizzato per studiare: (i) l'avvio e lo sviluppo di angiogenesi in seguito alla somministrazione intraperitoneale di agenti di test, e (ii) la modifica di angiogenesi dopo somministrazione sistemica di selezionati agenti di test.

Rat mesentere angiogenesi Assay

Inizia con un ratto sottoposto a occlusione dell'arteria cerebrale media, una procedura chirurgica che blocca temporaneamente il flusso sanguigno al tessuto cerebrale.Questo induce un ictus ischemico, con conseguente danno al tessuto cerebrale.Quindi, rimuovere il blocco per ripristinare il flusso sanguigno.Seleziona i ratti che presentano deficit neurologici per garantire la pertinenza dello studio.Quindi, somministrare il farmaco di prova al gruppo sperimentale mentre si inietta soluzione...

Valutazione degli effetti dell'angiogenesi di un farmaco in prova in un modello di ictus ischemico su ratto

Dimostriamo un nuovo modello murino legatura arteriosa nei muscoli spinotrapezius, tra cui un passo-passo la procedura e la descrizione della strumentazione necessaria. Descriviamo l'intervento chirurgico e di misurare i risultati pertinenti relativi al rimodellamento della rete vascolare e la vasodilatazione funzionale usando la microscopia confocale e intravitale.

Modello murino Spinotrapezius per valutare l&#39;impatto della legatura arteriolare sulla funzione microvascolare e rimodellamento

Osmotica Drug Delivery per arti posteriori ischemico e la perfusione dei vasi con Microfil per Micro-Tomografia Computerizzata Imaging

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

L'induzione chirurgica dell'ischemia degli arti posteriori nel topo è utile per esaminare l'angiogenesi, tuttavia questa è compromessa in alcuni ceppi di topi consanguinei che mostrano una marcata necrosi tissutale indotta da ischemia. Vengono descritti metodi per indurre l'ischemia subacuta degli arti utilizzando costrittori ameroidi per aggirare questo problema attraverso l'induzione di un'occlusione arteriosa graduale.

Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per indurre l'ischemia periferica nei conigli con iperlipidemia e diabete. Questo intervento chirurgico agisce come un modello preclinico per le condizioni sperimentate nella malattia dell'arteria periferica nei pazienti. L'angiografia è anche descritta come un mezzo per misurare l'entità dell'ischemia introdotta e il recupero della perfusione.

Modello preclinico di ischemia degli arti posteriori nei conigli diabetici

Questo articolo dimostra un approccio chirurgico efficiente per stabilire l'ischemia acuta nei topi con una piccola incisione. Questo approccio può essere applicato dalla maggior parte dei gruppi di ricerca senza aggiornamenti di laboratorio.

Un modello chirurgico modificato di ischemia dell'arto posteriore in ApoE-/- Topi utilizzando un'incisione in miniatura

Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Scopri la valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello murino di ischemia degli arti posteriori. Questo metodo permette analisi funzionali, istologiche e molecolari per testare agenti angiogenici.

Valutazione dell'angiogenesi terapeutica in un modello Murine di Ischemia hindlimb

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