Name: Imaging longitudinale a due fotoni dellippocampo dorsale CA1 in topi vivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri l'imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi per studiare la plasticità neuronale e i meccanismi della memoria. Questa tecnica consente osservazioni ottiche ripetute a risoluzione micrometrica.

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U. A. F. è sostenuta dalla fondazione Schram; C.-W. T. P. e W. G. sono supportati dalla Max Planck Society; L.Y. e R.Y. sono supportati dalla Max Planck Society e dal National Institute of Health (R01MH080047, 1DP1NS096787); A. C. è sostenuto da una sovvenzione del 7PQ del Consiglio europeo delle ricerche, dei programmi ERANET e I-CORE, dell'Ufficio Capo Scienziato del Ministero della Salute israeliano, del Ministero federale dell'istruzione e della ricerca, di Roberto e Renata Ruhman, di Bruno e Di Simone Lich, Nell e Leon Benoziyo Center for Neurological Diseases, l'Henry Chanoch Krenter Institute for Biomedical Imaging and Genomics, the Israel Science Foundation the Perlman Family, Adelis, Marc Besen, Pratt e Irving I. Moskowitz fondazioni; A. A. è supportato dalla Max Planck Society, dalla fondazione Schram e dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Le immagini 3P sono state acquisite durante il Corso Avanzato sulle Tecniche di Neuroimaging presso il Max Planck Florida Institute for Neuroscience. Il corso avanzato sulle tecniche di neuroimaging è supportato dalla Max Planck Society, il programma Florida State Max Planck Scientific Fellowship e dal max Planck Florida Institute Corporation Partnership Program. Ringraziamo Thorlabs, Coherent e SpectraPhysics per aver fornito supporto e attrezzature per il sistema di imaging 2P / 3P durante il corso. Siamo anche grati a Henry Haeberle e Melissa Eberle per l'assistenza con il sistema durante il corso.

Tutti i metodi descritti sono stati approvati dal governo dell'Alta Baviera (licenza 2016_ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-16-48) e dallo Stanford and Max Planck Florida Institute for Neuroscience Administrative Panels on Laboratory Animal Care.
1. Preparazione della cannula di imaging
<ol><li>Tenere un trapano di precisione su un supporto di perforazione fornito con un tavolo righello mobile.</li>
	<li>A clamp un tubo in acciaio inossidabile di 3,0 mm di diametro sul tavolo righello mobile.</li>
	<li>Tagliare il tubo a un anello metallico lungo 1,6 mm. Se i bordi dell'anello non sono smussati dopo il taglio, archiviare le irregolarità.</li>
	<li>Sciacquare l'anello metallico e un coperchio di vetro circolare di 4 mm di diametro in acetone 100% e lasciare asciugare per 5 min.</li>
	<li>Posizionare l'anello di metallo e il coperchio di vetro su un luogo di lavoro liscio, uniforme e pulito, sotto uno stereoscopio.</li>
	<li>Posizionare una goccia di adesivo ottico che cura i raggi UV su una superficie liscia, come una parabola Petri. Utilizzare un ago o una spatola per stendere l'adesivo per formare uno strato sottile (<0,5 mm).</li>
	<li>Utilizzare le pinze per immergere un lato dell'anello metallico nell'adesivo. Prestare particolare attenzione a non sigillare l'interno dell'anello. In questo caso, utilizzare un ago per rompere l'adesivo ottico nell'anello.</li>
	<li>Utilizzando lo stereoscopio, posizionare l'anello metallico al centro della vetrina di vetro con il lato dell'anello coperto da adesivo toccando il coperchio. Un sottile anello di adesivo dovrebbe formarsi all'interfaccia tra l'anello metallico e il coverslip. Evitare qualsiasi diffusione adesiva al centro della coverslip.</li>
	<li>Accendere l'unità di guida LED UV-curing e illuminare (365 nm) per 1 min. AVVISO: la luce UV provoca ustioni cutanee ed è un agente mutageno. Indossare occhiali anti-UV e coprire mani e braccia con guanti e un lab-coat per evitare l'esposizione della pelle.</li>
	<li>Per curare l'adesivo in modo uniforme, assicurarsi che tutti i lati dell'anello siano uniformemente illuminati cambiando la direzione della sorgente luminosa.</li>
	<li>Lasciare indurire l'adesivo per almeno 2 h, preferibilmente, durante la notte.</li>
	<li>Tenere saldamente la cannula dall'estremità aperta dell'anello metallico per mezzo di un emofuta. Utilizzando un trapano dentale dotato di un file rotante e lavorando sotto lo stereoscopio, file fuori la copertina di vetro in eccesso fino a filo con i lati dell'anello (Figura 1A).</li>
</ol>2. Impianto della cannula di imaging sopra l'ippocampo dorsale
<ol><li>Preparazione dell'attrezzatura e configurazione
	<ol>
<li>Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano puliti e sterili. Se si utilizza uno sterilizzatore di perline di vetro per la sterilizzazione, pulire gli strumenti e metterli nello sterilizzatore (impostato a 250 gradi centigradi) per 10 minuti, prima dell'uso. In alternativa, autoclave gli strumenti prima dell'uso.</li>
		<li>Preparare tutti i materiali necessari per l'intervento chirurgico, così come gli strumenti chirurgici, in modo che possano essere raggiunti facilmente.</li>
		<li>Assicurarsi che ci sia abbastanza farmaci appena preparati come antidolorifici o farmaci antinfiammatori.</li>
		<li>Assicurarsi che ci sia abbastanza isoflurane per tutta la durata dell'intervento chirurgico (circa 1 h per intervento chirurgico).</li>
		<li>Accendere il tappeto riscaldante e impostarlo a 37 gradi centigradi per mantenere stabile la temperatura animale durante l'anestesia.</li>
		<li>Assicurarsi che il sistema di scavenging per isoflurane funzioni.</li>
		<li>Aprire la valvola del flusso di ossigeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Induzione dell'anestesia e fissazione animale
	<ol>
<li>Posizionare il topo nella camera di induzione dell'anestesia al 3% di isoflurane in 1 L/min O2 e attendere che perda conoscenza. Valutare l'anestesia utilizzando il test di riflesso del pizzico della dita dei dei pezzi.</li>
		<li>Pesare l'animale.</li>
		<li>Applicare farmaci antinfiammatori (Meloxicam, 1mg/Kg) e antidolorifici (Vetalgin, 200mg/kg).</li>
		<li>Posizionare il mouse sul tappeto riscaldante. Assicurarsi che l'animale non sia a contatto diretto con il tappeto riscaldante per evitare ustioni termiche.</li>
		<li>Fissare la testa all'apparato stereotassico e posizionare il cono naso per coprire il muso. Per mantenere l'anestesia, diminuire l'isoflurane a 1,5-2%. Durante l'intervento, monitorare lo stato del mouse monitorando visivamente la respirazione e testando il riflesso del pizzico dei tipi. Regolare la percentuale di isoflurane, se necessario.</li>
		<li>Applicare unguento oftalmico agli occhi per prevenire la disidratazione e la potenziale cecità. NOTA: Per l'anestesia e i farmaci per animali, sono possibili metodi alternativi e farmaci. Si prega di fare riferimento alla licenza animale e alla relativa letteratura.</li>
	</ol></li>
	<li>Impianto di cannula ottica
	<ol><li>Accendere la sorgente luminosa in fibra ottica.</li>
		<li>Rimuovere i capelli e disinfettare la pelle sopra la testa del topo.</li>
		<li>Utilizzando forbici e pinze, rimuovere il cuoio capelluto del mouse. Inizia facendo un piccolo taglio nel cuoio capelluto in una posizione vicino a lambda. Continuare aprendo il cuoio capelluto sui due lati. Prima muoversi lateralmente nella direzione delle orecchie, poi rotrally, nella direzione delle orbite oculari, per formare un triangolo sull'asse sagittale, circa 4 mm rostral a bregma. Prestare attenzione a non tagliare troppo vicino a orecchie e occhi, ma esporre bregma e lambda, così come le ossa parietali e la metà posteriore delle ossa frontali.</li>
		<li>Applicare una goccia di lidocaina (28,9% v/v in alcool) al cranio.</li>
		<li>Svuotare il periosteo e asciugare il cranio con un tampone di cotone.</li>
		<li>Posizionare le barre dell'orecchio, per fissare la testa del mouse.</li>
		<li>Fare una piccola craniotomia, utilizzando un micro-drill con una bava di 0,5 mm di larghezza. Posizionare il foro nell'osso frontale opposto all'ippocampo immagine, a circa 1,5 mm dalla sutura sagittale e a 2 mm di distanza dalla sutura coronale.</li>
		<li>Alveare una vite ossea in acciaio inossidabile di 0,86 mm nel foro del cranio.</li>
		<li>Se necessario, pulire i detriti e asciugare il cranio.</li>
		<li>Preparazione di una miscela di cemento adesivo rapido
		<ol>
<li>Con un cucchiaio piccolo (4,5 mm di diametro), erogare 1-1,5 palchi di l-polvere in un pozzo di miscelazione.</li>
			<li>Distribuisci 3-4 gocce di Base Rapida nel pozzo.</li>
			<li>Distribuisci 1 goccia di Universal Catalyst nel pozzo.</li>
			<li>Mescolare il mix per 5-10 s utilizzando un applicatore di precisione. NOTA: sono disponibili cementi alternativi. Si prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilizzare applicatori di precisione per applicare rapido cemento adesivo sopra il cranio, vite e pelle circostante. Lasciare asciugare per 30 s a 1 min.</li>
		<li>Utilizzare un trapano trephine di 3,0 mm di diametro per fare una craniotomia nell'osso parietale. Posizionare il foro distante circa 1,5 mm dalla sutura sagittale e distante 2 mm dalla sutura lambdoide.</li>
		<li>Rimuovere con attenzione il lembo osseo.</li>
		<li>Controllare le dimensioni della craniotomia utilizzando la cannula per assicurarsi che si adatti. Utilizzare un micro-drill di 0,5 mm o 0,9 mm di larghezza per ingrandire la craniotomia, se necessario.</li>
		<li>Rimuovere le meningi con pinze Dumont.</li>
		<li>Ablate materia corticale, per raggiungere la capsula esterna. Utilizzare un ago contundente di 0,9 mm (calibro 19) collegato a una pompa a vuoto. Irrigare con salina per evitare la disidratazione del tessuto esposto e per lavare via il sangue residuo dopo il sanguinamento è risolto. Succhiare lentamente il tessuto corticale, 50-100 m alla volta, fino a quando la corteccia si stacca dalla capsula, esponendo le fibre del cingulum o del corpo callosum. Cambiare spesso l'ago, per evitare intasamenti.</li>
		<li>Le fibre si estendono principalmente in tre direzioni (Figura 1B). Sbucciare con attenzione le fibre dorsali fino a quando non sono esposte le fibre più profonde(alveus dell'ippocampo).</li>
		<li>Sciacquare il tessuto con la salina. Utilizzare pinze sottili per immergere la cannula inferiore in salina e posizionarlo sopra il foro del cranio. Cannula e tessuto devono essere sigillati dalla salina per evitare di intrappolare le bolle d'aria tra la cannula e il tessuto.</li>
		<li>Spingere la cannula nel cranio (Figura 1C) fino a quando il coperchio di vetro è a contatto con le fibre.</li>
		<li>Asciugare bene il cranio con triangoli di assorbimento, tamponi di cotone e/o la pompa a vuoto.</li>
		<li>Preparazione di una miscela di cemento adesivo rapido (fare riferimento al passaggio 2.3.10).</li>
		<li>Utilizzare applicatori di precisione per applicare un rapido cemento adesivo sul cranio. Applicare l'adesivo anche sul bordo della cannula. Fare attenzione a non far correre l'adesivo nella cannula. Lasciare asciugare per 30 s a 1 min.</li>
		<li>Utilizzare un braccio stereotassico per posizionare una piastra porta testa sopra la cannula, a contatto con il cranio.</li>
		<li>Preparazione di una miscela di acrilico dentale
		<ol>
<li>Con un cucchiaio di 9 mm di diametro, erogare un misurino di 1 livello (1 parte) di polvere in un pozzo di miscelazione.</li>
			<li>Distribuisci 2-3 parti di liquido nello stesso pozzo. Coprire l'intera polvere con il liquido.</li>
			<li>Mescolare per 1 min utilizzando una spatola. NOTA: sono disponibili acrilici alternativi. Si prega di fare riferimento alle istruzioni del produttore.</li>
		</ol></li>
		<li>Utilizzare una spatola o un applicatore di precisione per applicare l'acrilico attraverso il cranio. Coprire l'intero cranio esposto, la vite e la pelle aperta con acrilico dentale. Questo rende stabile la preparazione. Non lasciare che l'acrilico corri giù per il collo, le orecchie e gli occhi.</li>
		<li>Lasciare asciugare e indurire l'acrilico per circa 15 min.</li>
		<li>Applicare una pellicola adesiva rimovibile sulla piastra del supporto della testa, per evitare che i detriti entrino nella cannula. Si raccomanda che la dimensione della pellicola corrisponda a quella della piastra.</li>
		<li>Spegnere il flusso isoflurane, rimuovere l'animale dall'apparato stereotassico e posizionarlo su una piastra di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea fisiologica mentre si sveglia dall'anestesia.</li>
		<li>Monitorare l'animale fino a quando non ha riacquistato sufficiente consapevolezza per mantenere la recumbency sternale.</li>
		<li>Restituire l'animale che ha subito un intervento chirurgico alla compagnia di altri animali solo quando completamente recuperato.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cura postoperatoria
<ol><li>Controllare lo stato del mouse per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico, monitorando il peso e il comportamento generale.</li>
	<li>Applicare farmaci antinfiammatori (Meloxicam, 1mg/Kg) e antidolorifici (Vetalgin, 200mg/kg) sottocutaneamente per 2 giorni dopo l'intervento chirurgico NOTA: procedure di monitoraggio alternative, farmaci e dosaggi sono possibili per le cure postoperatorie. Si prega di fare riferimento alla licenza animale e alla relativa letteratura.</li>
</ol>4. Preparazione della sessione di imaging
<ol><li>Accendere in anticipo la configurazione dell'imaging e lasciare che il laser si riscaldi e si stabilizzi, se necessario.</li>
	<li>Anestesizzare il mouse (fare riferimento al passaggio 2.2.1).</li>
	<li>Utilizzare le pinze per rimuovere con attenzione la pellicola adesiva dalla piastra del supporto della testa. Tenere il mouse in una mano e la piastra porta testa con le dita. Rimuovere delicatamente la pellicola, per evitare di danneggiare la preparazione.</li>
	<li>Posizionare il mouse sotto il microscopio, sopra il tappeto di riscaldamento e fissare la piastra di testa al supporto (Figura 1D).</li>
	<li>Posizionare il cono nasale per coprire il muso e diminuire l'isoflurane al 1,5-2%.</li>
	<li>Applicare unguento oftalmico agli occhi del mouse.</li>
	<li>Pulire la cannula di imaging risciacquando con acqua deionizzata. Utilizzare una siringa e un ago sottile per far cadere l'acqua nella cannula e una pompa a vuoto per rimuoverla.</li>
</ol>5. Sessione di imaging
<ol><li>Utilizzare obiettivi a bassa ingrandimento e lunga distanza di lavoro per controllare visivamente la cannula per l'acqua residua, sporcizia, integrità e la presenza di fluorescenza.</li>
	<li>Allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci del portatesta.</li>
	<li>Passare agli obiettivi di immersione in acqua 25X 1.0 NA, 4 mm o 40X 0,8 NA, WD 3 mm. Aggiungere abbastanza acqua deionizzata per riempire la cannula e mantenere l'acqua in eccesso sulla parte superiore della cannula. Evitare la formazione di bolle d'aria.</li>
	<li>Utilizzare segnali fluorescenti a 2P e immagini. NOTA: il protocollo di imaging dipende fortemente dal tempo e dalle scale spaziali da immaginare. Fare riferimento alle sezioni risultati rappresentativi e discussione per i dettagli sulle impostazioni di imaging che abbiamo utilizzato per produrre le immagini mostrate in questo articolo.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, viene descritta una procedura per l'imaging 2P ripetuto del CA1 dorsale nei topi vivi. Dopo l'intervento chirurgico, il topo di solito si riprende entro 2 giorni. La procedura induce astrogliosi minima26,43. Emorragia ed edema che potrebbero seguire l'intervento chirurgico sono di solito ri-adsorbito entro 10 a 14 giorni. In generale, da 14 giorni dopo l'impianto in poi la preparazione è sufficientemente chiara per eseguire l'imaging intravitale. Il successo dell'intervento chirurgico non dipende dal lavoro in un ambiente sterile. Tuttavia, è fondamentale mantenere un alto livello di igiene, per evitare complicazioni dovute a infezioni associate alla chirurgia. Ciò si ottiene pulendo meticolosamente gli strumenti chirurgici prima e dopo l'intervento chirurgico e sterilizzandoli a caldo immediatamente prima di ogni utilizzo (passaggio 2.1.1). La cannula ottica viene conservata in un contenitore pulito e sterilizzato e sciacquata con salina sterile poco prima dell'impianto. Anche l'esecuzione di pratiche chirurgiche comuni di disinfezione delle mani e pulizia della stazione chirurgica è molto importante. La preparazione rimane stabile e consente l'imaging a risoluzione cellulare e subcellulare per diverse settimane26,35.
Passaggi critici, modifiche e risoluzione dei problemi.
È importante sbucciare la capsula esterna fino a quando le fibre più profonde sono esposte. La mancata esposizione dell'alveo potrebbe comportare l'incapacità di concentrarsi sul soma dei PN o in spine dendritiche di imaging a risoluzione ridotta, quando si utilizzano obiettivi commerciali con WD da 3 o 4 mm. A questo scopo, è utile ablate la neocorteccia molto lentamente utilizzando un ago di 0,9 mm di diametro e quindi passare a un ago di 0,3-0,5 mm di diametro (24-29 gauge) per un controllo più fine dell'aspirazione quando si rimuovono le fibre più dorsali. In alternativa, le pinze sottili possono essere utilizzate per rimuovere la corteccia rimanente dopo l'esposizione alle fibre36.
Sanguinamento durante l'intervento chirurgico può essere problematico, come il sangue ostruisce la vista. Si raccomanda l'attesa che il coagulo si formi e poi si risciacqua con salina per lavare via il sangue residuo. Se necessario, ripetere l'operazione.
Un aderente tra la cannula e la craniotomia aiuta ad aumentare la stabilità della preparazione mantenendo la cannula in posizione prima dell'applicazione del cemento, soprattutto se il bordo esterno della cannula è a filo con il cranio. Poiché le dimensioni del trapano trephine e della cannula sono abbinate, una vestibilità libera può sorgere a causa di irregolarità sul lato della cannula - che richiedono craniotomie leggermente più grandi per adattarsi (vedi passo 2.3.14) - o da una craniotomia irregolare. Eventuali irregolarità della cannula devono essere archiviate (passaggi 1.3 e 1.12) e la trefine deve essere tenuta perpendicolare al cranio fino al completamento della cranio (passaggio 2.3.12). La rimozione della trefina dal cranio prima del completamento della craniotomia può provocare craniotomie irregolari.
Limitazioni... Invasività e stabilità della preparazione.
È difficile valutare l'effetto dell'ablazione corticale in quanto è difficile definire con precisione le aree colpite direttamente e indirettamente. In generale, l'intervento chirurgico rimuove parte della corteccia parietale e parte della corteccia sensoriale arti visivi e posteriori21. La corteccia ablatata non si proietta direttamente nell'ippocampo e il tessuto ippocampale non viene né toccato né ferito. È importante sottolineare che l'impianto di una cannula di imaging non altera grossolanamente la funzione ippocampale e in particolare l'apprendimento dipendente dall'ippocampo21,36,37,38, 39. Tuttavia, sarebbe importante quantificare in che misura sia la cannula che la parte esterna dell'impianto (piastra del supporto della testa e tappo acrilico dentale) sono fattori di stress cronici valutando i livelli ematici del corticosterone e il peso della ghiandola surrenale rispetto topi non impiantati.
La preparazione rimane generalmente stabile da settimane a mesi26. A lungo termine, la crescita della pelle e delle ossa tende a sposto il cappuccio acrilico e ad aumentare l'instabilità della preparazione dell'imaging.
Limitazioni ottiche.
La microscopia 2P convenzionale consente di imaging fino a circa 1 mm di profondità nel tessuto neocorticale40,41. Coerentemente con questo, è possibile immagine dendriti e spine dendritiche situate nella SR (Figura 2D-F) o SLM36. Tuttavia, l'imaging attraverso una cannula pone limitazioni all'efficace NA. Per ottenere la massima risoluzione, il diametro e la profondità delle cannule di imaging devono essere abbinati all'imaging NA, poiché diametri più piccoli e profondità più lunghe imlimiteranno la luce di alti obiettivi NA. Ad esempio, quando si crea un obiettivo di immersione dell'acqua di 1,0 NA attraverso una cannula lunga 1,6 mm, è necessario un diametro interno di 3,65 mm per mantenere il NA completo. Tuttavia, utilizzando una cannula di questo diametro aumenterà la compressione sull'ippocampo e potrebbe influenzare la salute del tessuto, per questo motivo, usiamo una cannula con un diametro più piccolo. Quando si crea un obiettivo di immersione dell'acqua di 0,8 NA attraverso una cannula lunga 1,6 mm, un diametro interno di 2,5 mm sarebbe sufficiente per mantenere l'intero NA. Tuttavia, gli obiettivi di immersione dell'acqua 0,8 NA hanno un WD più corto (3 mm nel nostro caso), che può impedire di concentrarsi sul SP.
Questi calcoli si applicano al centro del campo visivo nella parte inferiore della cannula. Tuttavia, spostando il campo di imaging della vista lateralmente - più vicino ai bordi della cannula - o concentrandosi più in profondità nel tessuto - più lontano dalla superficie di vetro della cannula - diminuisce ulteriormente la NA efficace al piano focale e quindi riduce la risoluzione. Questo porterà a una risoluzione non omogenea tra i diversi volumi di tessuto immagine e può essere una preoccupazione per l'imaging quantitativo a risoluzione subcellulare, soprattutto quando si utilizzano tecniche di super-risoluzione come la microscopia 2P-STED42. Questi problemi sono meno importanti quando si esegue l'imaging a risoluzione cellulare.
Movimento dei tessuti.
Il movimento all'interno del tessuto - proveniente dalla respirazione e dal battito cardiaco negli animali anestesi - tende a diventare più grave con una maggiore distanza dalla cannula di imaging. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che la cannula di imaging applica una pressione meccanica al cervello contrastando così parte del movimento nelle vicinanze della cannula (simile alle preparazioni neocorticali). Così, anche se l'imaging delle spine dendritiche è possibile in SR e SLM, nelle nostre mani, è più robusto dorsale alla SO fino a 200 m dalla superficie della cannula. Per compensare il movimento, utilizziamo scanner risonanti e una media offline. Diverse immagini (da 4 a 6 ripetizioni) vengono acquisite per piano di immagine di una z-stack alla velocità massima disponibile (30 fotogrammi/s). Tutte le ripetizioni per ogni z-plane vengono quindi deconvolved (utilizzando il software commerciale, AutoQuant), registrato (utilizzando ImageJ) e mediato in una singola immagine26. Per l'imaging di somata, il movimento è spesso trascurabile su anestesia35 e due medie sono spesso sufficienti per compensare gli artefatti di movimento.
Applicazioni future o indicazioni del metodo . 
La preparazione può essere combinata con micro-endoscopi26,43. I microendoscopi sono sonde ottiche rigide che utilizzano microlenti indice di refrattivo a gradiente (GRIN) per guidare la luce da e verso il tessuto profondo18. L'uso di micro-endoscopi permette cannule di diametri più piccoli o addirittura nessuna cannula. Tuttavia, i micro-endoscopi commerciali sono meno ben corretti per le aberrazioni ottiche e hanno NA inferiore rispetto agli obiettivi commerciali. Le sonde di corrente raggiungono risoluzioni laterali e assiali di 0,6-1 m, 10-12 m, rispettivamente17,18,44. L'uso di micro-endoscopi consente anche la combinazione di questa preparazione con microscopi widefield integrati montati sulla testa45,46,47.
Il metodo si presta anche all'uso in topi non anestesizzati, ed è stato utilizzato per studiare l'attività cellulare utilizzando sensori Ca2 o nei topi svegli fissati alla testa21,37,48,49. In questi casi, a causa delle scale temporali veloci dei cambiamenti di fluorescenza, si consiglia di implementare la registrazione della linea50. È anche possibile adattare la preparazione per l'imaging di altre sottoregioni ippocampali come il giro dentato (DG)39,51,52. Combinando questa preparazione con eccitazione 3P53,54 con 1 MHz frequenza pulsato laser sintonizzato a 1400 nm, siamo stati in grado di immagine più in profondità nella formazione ippocampale raggiungendo lo strato molecolare, strato di cellule di granulo e il dell'DG (Figura 4) senza rimuovere la sovrapposizione CA1.
In conclusione, presentiamo un metodo che fornisce l'accesso ottico all'ippocampo dorsale e permette studi longitudinali e correlati delle dinamiche della struttura e dell'attività ippocampale. Questa tecnica estende le possibilità di analisi della funzione ippocampale in condizioni fisiologiche e patologiche.

Nei mammiferi, l'ippocampo è una regione chiave del cervello per la codifica e il richiamo di memorie episodiche e per la navigazione spaziale1,2,3,4. Per questo motivo, l'ippocampo è stato - ed è ancora - un modello molto importante per studiare i meccanismi di base che permettono al cervello di codificare e ricordare i ricordi5,6,7 o di navigare in un ambiente8 ,9 raccogliere ricompense ed evitare pericoli. Inoltre, la formazione dell'ippocampo è una delle regioni cerebrali in cui vengono generati nuovi neuroni per tutta la vita dei roditori10,11 e, eventualmente, degli esseri umani12,13. Infine, la degenerazione o la compromissione della formazione di ippocampali sono associati a disturbi neurologici e psichiatrici, tra cui il morbo di Alzheimer14.
Nei topi, l'ippocampo si trova a circa 1 mm sotto la superficie cerebrale15. La sua posizione ha impedito l'accesso ottico nel cervello intatto e, di conseguenza, gli studi longitudinali delle dinamiche ippocampali si sono affidati principalmente all'imaging a risonanza magnetica (MR), all'elettrofisiologia e alle analisi dell'imaging ex vivo. I metodi di imaging RM consentono di tracciare i processi biologici (ad esempio, l'espressione genica cambia16) nello stesso animale per più giorni, ma non hanno la risoluzione spaziale per discriminare i singoli neuroni. Le classiche tecniche elettrofisiologiche in vivo offrono una risoluzione temporale molto elevata e una squisita sensibilità ai cambiamenti nel potenziale della membrana. Tuttavia, hanno una risoluzione spaziale limitata e non hanno la capacità di tracciare in modo affidabile le stesse celle per periodi di tempo più lunghi. L'imaging ottico consente di studiare processi più diversificati in virtù delle sue elevate risoluzioni temporali e spaziali. Tuttavia, l'imaging ex vivo fornisce solo istantanee dei processi in corso, e quindi non è adatto per studi longitudinali durante i quali gli animali imparano e richiamano le informazioni.
L'imaging ottico in vivo combina alcuni vantaggi dell'imaging MR e dell'elettrofisiologia con quelli dell'imaging ottico. Pertanto, è molto adatto per analisi longitudinali e correlate delle dinamiche e del comportamento del cervello del topo. Questo è rilevante negli studi di processi biologici con scale temporali molto veloci (da millisecondi a secondi) o molto lente (da giorni a settimane). Esempi per tali processi che sono rilevanti per le neuroscienze sono la dinamica della tensione della membrana, i transitori Ca2,, la plasticità cellulare e i cambiamenti strutturali, che sono tutti ritenuti molto importanti per la formazione e il richiamo della memoria. Diversi metodi hanno esteso l'imaging in vivo all'ippocampo dorsale18,19,20,21,22. Preparazioni acute hanno permesso il monitoraggio dell'attività del neurone piramidale (PN) così come i loro dendriti e spine dendritiche per diverse ore20,22. Questo lasso di tempo temporale, tuttavia, non consente di studiare cambiamenti strutturali a lungo termine, che potrebbero essere alla base dell'apprendimento incrementale. I preparati cronici - in combinazione con micro-endoscopi23,24 o con obiettivi del microscopio standard a lunga distanza di lavoro (WD)21 - hanno permesso l'imaging ripetuto dell'ippocampo dorsale su diversi Settimane.
Qui, descriviamo una preparazione cronica che fornisce accesso ottico ricorrente al sottocampo CA1 dell'ippocampo dorsale dei topi viventi utilizzando una cannula di imaging permanentemente inserita. Questa preparazione consente l'accesso ripetuto al CA1 senza disturbi funzionali ed è adatta per l'imaging a due fotoni intravitali (2P) o ad epopeescenza ad ampio campo. Due esempi di imaging cronico del cervello profondo 2P nella CA1 dorsale dei topi vivi sono dettagliati: l'imaging longitudinale della struttura dendritica e la dinamica dendritica della colonna vertebrale e l'imaging longitudinale della plasticità articolata dall'attività. Vengono discussi i vantaggi e i limiti salienti della tecnica.

<table><tbody><tr><td>Trapano/smerigliatrice professionale IBS/E</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28481</td><td>Trapano a percussione</td></tr><tr><td>MICROMOT supporto per trapano MB 200</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28600</td><td>Tavolo portarighe mobile</td></tr><tr><td>MICRO tavolo composto KT 70</td><td>Proxxon GmbH</td><td>27100</td><td>Tavolo righello mobile</td></tr><tr><td>Morsa per macchine MS 4</td><td>Proxxon GmbH</td><td>28132</td><td>Tavolo</td></tr> <tr><td>righello mobileTubo in acciaio inox & Oslash; 3,0 x 0,25 mm (Interno &Oslash; 2,5 mm ) L = 500 mm</td><td>Sawade</td><td>R00303</td><td>Tubo in acciaio inox per l'anello metallico della cannula</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio (4 mm rotondo)</td><td>Vetrini in vetro Engelbrecht Medizin e Labortechnik</td><td></td><td>per il vetro della cannula</td></tr><tr><td>Schlusselfeilensatz 6-tgl. Im Blechetui</td><td>Hoffmann Group</td><td>713750 160</td><td>file manuali</td></tr><tr><td>Pr&auml; zisions-Nadelfeile Gesamtl&auml; nge 140 mm 4</td><td>Hoffmann Group</td><td>527230 4</td><td>lime manuali</td></tr><tr><td>Adesivi ottici a polimerizzazione UV</td><td>Thorlabs</td><td>NOA81</td><td>Adesivo a polimerizzazione</td></tr><tr><td>UV Sistema LED a polimerizzazione UV, 365 nm</td><td>Thorlabs</td><td>CS2010</td><td>Unità driver LED a polimerizzazione UV</td></tr><tr><td>Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Stereoscopio</td></tr><tr><td>Presto II</td><td>NSK-Nakanishi Germania</td><td>Z307015</td><td>Trapano</td></tr> <tr><td>dentaleDiamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 fein</td><td>MF Dental</td><td>F837.014.FG</td><td>Lime per trapano dentale</td></tr><tr><td>Diamantbohrer FG (5 St.), Zylinder flach, 837-014 grob</td><td>MF Dental</td><td>G837.014.FG</td><td>Lime per trapano dentale</td></tr><tr><td>Graefe Pinze - Dritte / seghettate</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Pinze per la chirurgia</td></tr><tr><td>Frese per Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-05</td><td>fresa da 0,5 mm di larghezza per microtrapano</td></tr><tr><td>Frese per microtrapano</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-09</td><td>fresa da 0,9 mm di larghezza per microtrapano</td></tr><tr><td>MicroMotor mit Handst&uuml; ck</td><td>DentaTec</td><td>MM11</td><td>Micro-trapano per la craniotomia</td></tr><tr><td>Dumont #3 Forcipe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Pinza Dumont per la chirurgia</td></tr><tr><td>Forbici fini - ToughCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Forbici per la chirurgia</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>MW Dental</td><td>229-020</td><td>Trephine drill - diametro 3,0 mm; per la micro-fresa</td></tr><tr><td>Osso autofilettante in acciaio inossidabile Viti</td><td>Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>Viti ossee da 0,86 mm di larghezza</td></tr><tr><td>Apparecchio stereotassico</td><td>Kopf</td><td></td><td>Apparecchio stereotassico</td></tr><tr><td>3-D-Gelenkarm</td><td>Hoffmann Group</td><td>442114</td><td>Braccio stereotassico e portapiastra</td></tr><tr><td>Aufnahme 2SM</td><td>Hoffmann Group</td><td>442100 2SM</td><td>Braccio stereotassico e supporto per piastre</td></tr><tr><td>Hot Bead Sterilizzatori</td><td>Strumenti</td> <td>per la scienza fine18000-45</td><td>Sterilizzatore a perle di vetro</td></tr><tr><td>Isofluran CP, Flasche 250 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798932</td><td>Isoflurano liquido per anestesia</td></tr><tr><td>Harvard Apparatus Vaporizzatore a imbuto Isoflurane</td><td>Harvard Apparatus GmbH</td><td>34-1040</td><td>Vaporizzatore a isoflurano</td></tr><tr><td>Lab Active Scavenger</td><td>Gropper Medizintechnik</td><td>UV17014</td><td>Sistema</td></tr> <tr><td>di scavenger all'isofluranoMetacam 0,5% Injektionslsg. (Hund / Katze), Flasche 20 ml</td><td>Henry Schein VET GmbH</td><td>798566</td><td>Meloxicam, antinfiammatorio</td></tr><tr><td>Vetalgin 500 mg/ml</td><td>MSD Tiergesundheit</td><td></td><td>Vetalgin, antidolorifico</td></tr><tr><td>CMA 450 Regolatore di temperatura</td><td>Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH</td><td>8003770</td><td>Coperta riscaldante</td></tr><tr><td>Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td><td>Bayer AG</td><td></td><td>Unguento oftalmico</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD</td><td>Schott</td><td></td><td>Sorgente luminosa a fibre ottiche</td></tr><tr><td>Xylocain Pumpspray</td><td>AstraZeneca GmbH</td><td></td><td>Lidocaina, anestetico locale</td></tr><tr><td>Triangoli di assorbimento - Non montato</td><td>Fine Science Tools</td><td>18105-03</td><td>Triangoli di assorbimento per la chirurgia</td></tr><tr><td>Parkell C & B Metabond polvere trasparente L</td><td>Hofmeester dental</td><td>013622</td><td>Cemento adesivo rapido</td></tr><tr><td>Parkell C& B Metabond Quick Base B</td><td>Hofmeester dental</td><td>013621</td><td>Cemento adesivo rapido</td></tr><tr><td>Parkell C& B Metabond Universal Catalyst C</td><td>Hofmeester dental</td><td>013620</td><td>Cemento adesivo rapido</td></tr><tr><td>Applicatore di precisione regolabile Pennelli</td><td>Parkell</td><td>S379</td><td>Applicatori di precisione per la chirurgia</td></tr><tr><td>Aghi smussati 0,9x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0441324</td><td>Aghi smussati Aghi</td></tr><tr><td>smussati 0,5x42 mm</td><td>Dentina</td><td>0452155</td><td>Aghi smussati</td></tr><tr><td>Aghi smussati 0,3x23 mm</td><td>Dentina</td><td>0553532</td><td>Aghi smussati</td></tr><tr><td>Kallocryl A/C</td><td>Speiko</td><td>1615</td><td>Componente acrilico liquido</td></tr><tr><td>Kallocryl</td><td>Speiko</td><td>1609</td><td>Polvere acrilica</td></tr><tr><td>Rotolo trasparente</td><td>Hydrofilm Hartmann</td><td></td><td>Pellicola adesiva</td></tr><tr><td>Piastre di testa</td><td>Su misura</td><td></td><td>30 mm x 10 mm di dimensioni; foro diametro 8 mm, titanio</td></tr><tr><td>Morsetto piastra di testa</td><td>Custom made</td> Portatarga per <td></td><td>la testa</td></tr><tr><td>Supporti per montanti per piedistallo</td><td>Thorlabs</td><td>PH20E/M</td><td>Portatarga per la testa</td></tr><tr><td>Palo in acciaio inox</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td><td>Portatarga per la testa</td></tr><tr><td>Palo in acciaio inox</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M</td><td>Portatarga per la testa</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto per connettore per palo</td><td>Portapiastra per la testa</td> <td>su</td><td></td> misura</tr><tr><td>Breadboard in alluminio, 300 mm x 450 mm x 12,7 mm, rubinetti M6</td><td>Thorlabs</td><td>MB3045/M</td><td>Tavolino per microscopio</td></tr><tr><td>7" x 4" Lab Jack</td><td>Thorlabs</td><td>L490/M</td><td>Tavolino per microscopio</td></tr><tr><td>Maschera facciale a basso profilo topi piccoli</td><td>Emka Technologies</td><td>VetFlo-0801</td><td>Supporto per maschera facciale per anestesia</td></tr><tr><td>RS4000 Tavolo ottico smorzato ad alte prestazioni sintonizzato</td><td>Tavolo galleggiante</td> <td>Newport</td><td></td></tr><tr><td>S-2000A Isolatori di vibrazioni pneumatici ad alte prestazioni con rilivellamento automatico</td> Misuratore di potenza del <td>tavolo flottante</td><td>Newport</td><td></td></tr><tr><td>Modello 1918-R</td><td>Misuratore di potenza</td><td>Newport</td><td></td></tr><tr><td>X-Cite 120Q</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>Lampada a fluorescenza</td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Bruker</td><td>Ultima IV</td><td>a due fotoni microscopi</td></tr><tr><td>Microscopio a due fotoni</td><td>Thorlabs</td><td>Bergamo</td><td>Microscopi a due fotoni</td></tr><tr><td>Plan N 4x/0.10 &infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiettivi</td></tr><tr><td>Plan N 10x/0.25 &infin;/-/FN22</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiettivi</td></tr><tr><td>LMPlan FLN 20x/0.40 &infin;/-/FN26.5</td><td>Olympus</td><td></td><td>Obiettivi</td></tr><tr><td>XLPlan N 25x/1.00 SVMP &infin;/ 0-0.23/FN18</td><td>Obiettivi Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laser sintonizzabile Ultafast per eccitazione 2P</td><td>Spectraphysics</td><td>Laser Ever Tai Deep See</td><td>Excitaiton Laser</td></tr><tr><td>sintonizzabile Ultafast per eccitazione 2P</td><td>Spectraphysics</td><td>InSight DS+ Laser</td><td>Excitaiton</td>a doppio raggio</tr><tr><td>Laser sintonizzabile Ultafast per eccitazione 3P</td> Laser <td></td><td>Excitaiton</td> <td>Monaco coerenti</td></tr></tbody></table>

imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale ca1 in topi vivi

Longitudinal Two-Photon Imaging of Dorsal Hippocampal CA1 in Live Mice

La microscopia a due fotoni è uno strumento fondamentale per le neuroscienze in quanto consente di soccorrere il cervello di animali vivi su scale spaziali che vanno dai livelli subcellulari aquelli di rete e su scale temporali da millisecondi a settimane. Inoltre, l'imaging a due fotoni può essere combinato con una varietà di compiti comportamentali per esplorare le relazioni causali tra la funzione cerebrale e il comportamento. Tuttavia, nei mammiferi, la penetrazione limitata e la dispersione della luce hanno un'imaging intravitale di due fotoni principalmente in regioni cerebrali superficiali, precludendo così lo studio longitudinale di aree del cervello profondo come l'ippocampo. L'ippocampo è coinvolto nella navigazione spaziale e nella memoria episodica ed è un modello di lunga data utilizzato per studiare i processi cellulari e cognitivi importanti per l'apprendimento e il richiamo, sia nella salute che nella malattia. Qui, una preparazione che consente l'accesso ottico cronico all'ippocampo dorsale nei topi viventi è dettagliata. Questa preparazione può essere combinata con l'imaging ottico a due fotoni a risoluzione cellulare e subcellulare in testa fissa, topi vivi anestesizzati per diverse settimane. Queste tecniche consentono l'imaging ripetuto della struttura neuronale o della plasticità evocata dall'attività in decine o centinaia di neuroni nell'ippocampale dorsale CA1. Inoltre, questa preparazione cronica può essere utilizzata in combinazione con altre tecniche come la micro-endoscopia, la microscopia a campo largo montata sulla testa o la microscopia a tre fotoni, espandendo così notevolmente la cassetta degli attrezzi per studiare i processi cellulari e di rete coinvolti nell'apprendimento e nella memoria.

Poiché la cannula è posta appena dorsale a CA1, l'aspetto dorsale del CA1 è più prossimale al microscopio rispetto a quello ventrale. L'alveo è la struttura più prossimale seguita in ordine da stratum oriens (SO), strato piramidale (SP), strato radiato (SR) e strato lacunosum molecolare (SLM), lo strato più distale (Figura1B , C). L'imaging longitudinale 2P della struttura neuronale con risoluzione subcellulare e della plasticità evocata dall'attività con risoluzione cellulare è presentata come risultati rappresentativi. Per eccitare la proteina fluorescente verde fluoreres fluoreres fluoreres (GFP), d2Venus e TurboFP635, viene utilizzato un laser Ti:Sapphire a impulsi femtosecondi sintonizzato a 920 nm e la potenza media del laser viene regolata a 5-25 mW nel campione. Le diverse lunghezze d'onda di emissione sono separate utilizzando filtri di emissione e diversi tubi fotomoltiplicatori.
Imaging longitudinale della struttura dendritica e della dinamica delle spine dendritiche.
Per etichettare raramente i PN ippocampali e visualizzarne la struttura, viene utilizzata una linea di topo transgenico Thy1-GFP (linea M). I topi Thy1-GFP esprimono la GFP potenziata citoplasmica sotto il controllo del promotore Thy1 in una popolazione scarsa e casuale di PN25. In genere, l'asse principale dei CA1 PN è approssimativamente perpendicolare al piano xY-imaging (Figura1B, Figura 2A e Film supplementare 1). I dendriti basali si estendono nel SO, dal soma verso la cannula, mentre i dendriti di ciuffo apico e apicale estendono distacreto alla cannula, nella direzione opposta (Supplementary Movie 1). Poiché la preparazione lascia intatte le fibre più profonde dell'alveo, alcune fibre fluorescenti che attraversano il campo visivo, appena sotto la cannula, dovrebbero essere visibili (Figura 2A e Film 1). La preparazione consente l'imaging di dendriti PN con risoluzione della colonna vertebrale (Figura 2 A-C). Per immagini dendriti e spine dendritiche, viene utilizzato un obiettivo commerciale 25X 1.0 NA, 4 mm WD, immersione in acqua.
Per il tracciamento longitudinale, diverse regioni cerebrali nel campo visivo della cannula sono definite durante la prima sessione di imaging. Ogni regione corrisponde a un'area di circa 240 x 240 m e contiene tra 1 e 7 segmenti dendritici (Figura 2B). Queste regioni vengono mappate manualmente a uno stack tridimensionale a basso ingrandimento che mostra il modello di espressione GFP nel volume al di sotto della cannula di imaging (Figura 2A). Quindi, 1 stack di immagini z-step di dendriti basali CA1 PN vengono acquisiti a intervalli di tempo diversi (da 24 h a 3 giorni) per un massimo di circa 14 giorni (Figura 2C). Sono possibili durate e intervalli di imaging più lunghi26. Ogni sessione di imaging dura circa 60-90 min. Anche se la maggior parte delle immagini sono di spine dendritiche nel SO, è anche possibile immagini di spine dendritiche nei dendriti obliqui di SR (Figure 2D-F). Oltre alla densità della colonna vertebrale, questo metodo consente lo studio delle dinamiche della colonna vertebrale quantificandone la sopravvivenza, i tassi di guadagno e perdita26,27,28,29,30, 31 Milia , 32. Per segnare e tenere traccia delle spine dendritiche nel tempo (Figura 2C), viene utilizzata un'interfaccia MATLAB personalizzata. Ciò consente l'allineamento delle pile di immagini acquisite in diversi punti temporali e supporta l'etichettatura manuale di dendriti e spine monitorando le lunghezze dendritiche e le posizioni della colonna vertebrale nel tempo26. È importante sottolineare che questo metodo può essere utilizzato per distinguere (per ogni punto temporale, escludendo il primo) tra spine dendritiche preesistenti e neonate. Questo è importante in quanto le diverse classi di spine dendritiche sono pensati per avere ruoli diversi nell'acquisizione della memoria e conservazione33.
Imaging longitudinale della plasticità evocata dall'attività.
Per immagini di plasticità evocata dall'attività nei CA1 PN, l'area dorsale ca1 ippocampale viene iniettata con un vettore virale che esprime d2Veneto fluorescente verde attraverso una forma potenziata dell'elemento sinaptico che risponde all'attività (E-SARE) all'interno dell'Arco esolvatore/promotore e fluorescente rosso TurboFP635 tramite il promotore ePGK 34. Ciò consente di imaging livelli di plasticità di centinaia di CA1 PN in ogni animale35. Data l'etichettatura molto densa dei PN, in genere non è possibile risolvere i dendriti dei CA1 PN (Supplementary Movie 2).
Per immaginare il somata dei CA1 PN, viene utilizzato un obiettivo 40X 0.8 NA, 3 mm WD, obiettivo di immersione dell'acqua. Per il tracciamento longitudinale, da 1 a 9 regioni cerebrali sono definite per mouse durante la prima sessione di imaging. Ogni regione corrisponde a un'area di circa 300 x 300 m e contiene tra 50 e 150 celle (Figura 3A). Queste regioni sono mappate manualmente ai punti di riferimento del tessuto locale visibili con un ingrandimento inferiore. Quindi, vengono acquisiti 3 stack di immagini z-step, che comprendono il SP di CA1 PN (Figura3A e Supplementary Movie 2) a intervalli di tempo diversi (da 24 h a 6 giorni) per un massimo di circa 30 giorni. Ogni sessione di imaging dura circa 60-90 min. Così, generalmente immagine 6 a 8 h dopo l'esperienza e consentono per 5 giorni tra le sessioni di imaging35.
Per quantificare i valori di fluorescenza d2Venus e TurboFP635, viene disegnata una regione circolare di 4,64 m di diametro, che è più piccola di un corpo cellulare neurale, centrata sul soma cellulare. Quindi avanziamo al momento successivo, descriviamo il soma della stessa cella nello stesso modo e iterare questa procedura per tutti i punti temporali e tutte le celle visibili nel set di dati longitudinale. Il valore medio dell'emissione di d2Venus di ciascun neurone (dipendente dall'attività) è normalizzato dalla sua emissione media (indipendente dall'attività) di TurboFP635. Questo metodo consente di sforare le dinamiche a lungo termine della plasticità dell'insieme di CA1 PN35 (Figura 3C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig1.jpg"> Figura 1: Preparazione per l'imaging ottico profondo del cervello in vivo. (A). Viste in alto (a sinistra) e laterali (destra) di esempio di imaging cannuals. Le cannule di imaging hanno un fondo in vetro trasparente per consentire l'accesso ottico all'ippocampo. (B). Descrizione schematica della preparazione evidenziando la posizione relativa della cannula di imaging, un CA1 PN e i tre strati di fibre da dorsale a ventrale. (C, D). Descrizione schematica della configurazione di imaging (C) e della fissazione animale (D) durante una sessione di imaging. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig2.jpg"> Figura 2: Imaging longitudinale della struttura dendritica e della dinamica delle spine dendritiche. (A). 2P stack di immagini (Maximum Intensity Projection (MIP) di 59 piani di immagine, 2 z-spacing) di neuroni e dendriti etichettati da GFP in un mouse vivo Thy1-GFP. (B). Ingrandimento superiore (MIP di 53 piani di immagine, 1 z-spacing) che dettagliano i dendriti basali situati in SO. (C). Sequenza di immagini time-lapse di un segmento dendritico immagine su 14 giorni. Le punte delle frecce indicano spine dendritiche tracciate nell'arco di 14 giorni. (D, E). pila di immagini 2P di neuroni e dendriti etichettati da GFP in un topo vivo Thy1-GFP; (D) Proiezione y (31 piani d'immagine, 3 xm z-spacing) e (E) proiezioni XY (17 piani dell'immagine, 3 z-spacing). (F). L'ingrandimento più alto (piano a immagine singola) che descrive i dendriti apici e le spine dendritiche situate in SR. Arrowheads indicano spine dendritiche. Eccitazione: 920 nm; picco di emissione: 510 nm. Barre della scala: A, 50 m; B, 10 m; C, 2 m; D ed E, 15 m; F, 4 m. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig2large.jpg" target="_blank">fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig3.jpg"> Figura 3: Imaging longitudinale della plasticità evocata dall'attività. (A). 2P immagini (piani immagine singola) da un mouse dal vivo, mostrando le stesse celle il giorno di base 0 e dopo EE il giorno 1. (B). 2P pile di immagini (MIP di 4-6 piani di immagine, 3 z-spacing) che mostrano i modelli di attivazione E-SARE specifici per l'ambiente A (giorni 1, 19 e 25) e l'ambiente B (giorni 7 e 13). Verde: fluorescenza di d2Venus. Rosso: fluorescenza TurboFP635. Eccitazione: 920 nm; d2Venus picco di emissione: 530 nm; Picco di emissione TurboFP635: 635nm. Barre della scala: A, 20 m; B, 10 m. Questa cifra è stata modificata da Attardo et al., 201835. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59598/59598fig4.jpg"> Figura 4: Imaging della struttura neuronale nella DG ippocampale utilizzando la microscopia a tre fotoni (3P). (A-H). Immagini 3P (piani a immagine singola) di neuroni e dendriti etichettati da GFP in un mouse dal vivo Thy1-GFP che dettaglia (A-E) PN nelle cellule di granulosa CA1 e (F-H) nella DG. Eccitazione: 1400 nm; picco di emissione: 510 nm. Barra della scala: 40 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/59598fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Supplementare Film 1: Campo visivo in un mouse dal vivo Thy1-GFP. Pila di immagini 2P (83 piani di immagine, 7 z-spacing) di neuroni e dendriti etichettati da GFP (bianco) in un mouse vivo Thy1-GFP che si estende dal fondo della cannula a SLM. Per tenere conto del decadimento del segnale di fluorescenza con un aumento della profondità, abbiamo usato un gradiente non lineare del guadagno dei tubi fotomoltiplicatori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_1_FINAL.avi">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
Filmo supplementare 2: Imaging della plasticità evocata dall'attività. Stack di immagini 2P (28 piani di immagine, 3 z-spacing) di neuroni che esprimono il reporter E-SARE dell'espressione IEG in un topo vivo che comprende la fluorescenza SP. Green: d2Venus. Rosso: fluorescenza TurboFP635. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59598/Movie_2_FINAL.avi">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

Two-photon microscopy is a fundamental tool for neuroscience as it permits investigation of the brain of live animals at spatial scales ranging from ...

Questa procedura fornisce un accesso ottico ripetuto all'ippocampo dorsale dei topi vivi per studiare i meccanismi di formazione e richiamo della memoria mentre svolgono compiti di apprendimento. Questa tecnica consente l'uso della microscopia leggera per studiare l'ippocampo dorsale dei topi vivi a livello di micrometro risoluzione spaziale longitudinalmente per diverse settimane. La perdita di memoria è un segno distintivo generale di alcune malattie cerebrali come il morbo di Alzheimer.Comprendere il meccanismo di formazione e richiamo della memoria potrebbe in ultima analisi aiutare i pazienti affetti da queste malattie. Questo metodo potrebbe essere applicato ad altri sistemi animali con un cranio come piccoli mammiferi. Monitorare i segni vitali durante un intervento chirurgico di sopravvivenza può essere sia distraente che stressante.Potrebbe essere utile eseguire prima la procedura su un animale morto per concentrarsi sugli aspetti più cruciali della procedura. Per preparare la cannula di imaging, tagliare prima un tubo di acciaio inossidabile di tre millimetri di diametro in un anello metallico lungo 1,6 millimetri. Se i bordi dell'anello non sono smussati dopo il taglio, presentare le irregolarità.Successivamente, utilizzare un paio di forcep per immergere un lato dell'anello metallico in un adesivo ottico di polimerizzazione UV. Quindi posizionare l'anello metallico al centro di una coverlip di vetro con il lato dell'anello coperto da adesivo che tocca il copripavimento. Accendere l'unità driver LED polimerizzazione UV e far brillare la luce della lunghezza d'onda di 365 nanometri sull'adesivo per un minuto per curare l'adesivo.Assicurarsi che tutti i lati dell'anello siano ugualmente illuminati cambiando la direzione della sorgente luminosa. Dopo che l'adesivo si è indurito per almeno due ore, tenere saldamente la cannula dall'estremità aperta dell'anello metallico per mezzo di un emostato. Utilizzando un trapano dentale dotato di un file rotante, filettare il coperchio in eccesso del vetro fino a quando non viene lavato con i lati dell'anello.Preparare gli strumenti richiesti e anestetizzare il mouse come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Quindi rimuovere i capelli e disinfettare la pelle sopra la testa del mouse. Successivamente, utilizzare forbici e forcep per fare un piccolo taglio nel cuoio capelluto nella posizione vicino a lambda.Muoversi lateralmente nella direzione delle orecchie quindi rostralmente nella direzione delle orbite oculari per formare un triangolo sull'asse sagittale di circa quattro millimetri rostrale a bregma. Applicare una singola goccia di lidocaina sul cranio. Dopo due minuti, sgombrato il periostio e asciugare il cranio usando un batuffolo di cotone.Quindi posizionare le barre dell'orecchio per fissare la testa del mouse. Utilizzando un micro trapano con una bava di 0,5 millimetri, fare un piccolo foro nell'osso frontale di fronte all'ippocampo immaginato a circa 1,5 millimetri dalla sutura sagittale e due millimetri distale dalla sutura coronale. Quindi avvitare una vite ossea in acciaio inossidabile di 0,86 millimetri nel foro del cranio.Fissarlo in posizione utilizzando cemento adesivo. Lasciare asciugare il cemento per 30 secondi a un minuto. Successivamente, utilizzare un trapano a tre endorfine di tre millimetri di diametro per fare un piccolo foro nell'osso parietale.Posizionare il foro a circa 1,5 millimetri distale dalla sutura sagittale e due millimetri distale dalla sutura lambdoide. Rimuovere con cura il lembo osseo. Quindi rimuovere le meningi usando le forcep Dumont.Ablate la materia corticale per raggiungere la capsula esterna. Utilizzare un ago smussato calibro 19 collegato a una pompa per vuoto e irrigare con soluzione salina per evitare la disidratazione del tessuto esposto e lavare via il sangue residuo dopo che il sanguinamento è stato risolto. Succhiare lentamente il tessuto corticale da 50 a 100 micron alla volta fino a quando la corteccia si stacca dalla capsula esponendo le fibre del cingulum o del corpo calloso.Quindi sbucciare con cura le fibre dorsali fino a quando le fibre più profonde, l'alveo dell'ippocampo sono esposti. Al termine, sciacquare il tessuto con soluzione salina. Quindi, utilizzare forcep sottili per immergere la cannula inferiore in soluzione salina e posizionarla sopra il foro del cranio.Quindi spingere la cannula nel cranio fino a quando il coverslip di vetro è a contatto con le fibre. Asciugare il cranio e applicare un rapido cemento adesivo sul cranio per tenere la cannula in posizione. Assicurati di applicare anche l'adesivo sul bordo della cannula, ma fai attenzione a non lasciare che l'adesivo si imbatta nella cannula.Una volta asciutto, utilizzare un braccio stereotassico per posizionare una piastra portacapo sopra la cannula a contatto con il cranio. Preparare una miscela di acrilico dentale e quindi applicarla su tutto il cranio. Coprire l'intero cranio esposto, la vite e la pelle aperta con acrilico dentale per stabilizzare la preparazione.Dopo 15 minuti, applicare una pellicola adesiva rimovibile sulla piastra portacapo per evitare che i detriti entrino nella cannula. Quando sei pronto per l'immagine del cervello, segui di nuovo nel protocollo di testo di accompagnamento per i dettagli sull'anestesia. Una volta sedati a sufficienza, utilizzare le forcep per rimuovere con cura la pellicola adesiva dalla piastra portacapo.Rimuovere delicatamente il film per evitare di danneggiare la preparazione. Quindi, posizionare il mouse al microscopio sul tappeto riscaldante e fissare la piastra della testa al supporto. Applicare unguento per gli occhi sugli occhi dell'animale.Quindi pulire la cannula di imaging usando una siringa e un ago sottile per far cadere acqua deionizzata nella cannula seguita dalla rimozione con una pompa per vuoto. Utilizzare obiettivi a lunga distanza di lavoro a basso ingrandimento per controllare visivamente la cannula per l'acqua residua, lo sporco, l'integrità e la presenza di fluorescenza. Quindi allineare la cannula all'asse ottico regolando gli angoli dei bracci del supporto della testa.Passa a un obiettivo 25X con un'apertura numerica di 1,0 e una distanza di lavoro di quattro millimetri. Quindi aggiungere abbastanza acqua deionizzata alla cannula per riempirla e mantenere l'acqua in eccesso sopra la cannula. Infine, utilizzare due eccitazioni fotone e immagini i segnali di fluorescenza.Mostrato qui è una pila di immagini 2P da un cervello transgenico di topo thy1-GFP. I topi Thy1-GFP esprimono GFP potenziato citoplasmatico sotto il controllo del promotore Thy1 in una scarsa popolazione casuale di neuroni piramidali. Generalmente, l'asse principale dei neuroni piramidali nell'ippocampale dorsale CA1 è approssimativamente perpendicolare al piano di imaging XY.Queste regioni vengono mappate manualmente a una pila tridimensionale a basso ingrandimento che mostra il modello di espressione GFP nel volume sotto la cannula di imaging. Per il tracciamento longitudinale, vengono definite diverse regioni cerebrali all'interno del campo visivo della cannula. Ogni regione corrisponde ad un'area di circa 240 per 240 micrometri e contiene da uno a sette segmenti dendritici.La serie di immagini qui mostra un micrometro z-step stack di neuroni piramidali CA1 e dendriti basali acquisiti a diversi intervalli di tempo per 14 giorni. Tuttavia, sono possibili durate e intervalli di imaging più lunghi. Sebbene la maggior parte delle immagini siano di spine dendritiche nello strato oriens, è anche possibile immagine delle spine dendritiche nei dendriti obliqui dello strato radiatum.Un'altra estensione di questa tecnica è l'immagine della plasticità evocata dall'attività nei neuroni piramidali CA1 iniettando l'area ippocampale dorsale CA1 con un vettore virale. Ciò consente di misurare la plasticità di centinaia di neuroni piramidali CA1 in ogni animale come pila di immagini 2P. È fondamentale prevenire danni all'ippocampo quando si rimuove il tessuto sovrascrivimento.Inoltre, si dovrebbe posizionare correttamente la cannula per garantire una preparazione stabile. La preparazione descritta consente l'uso di diversi tipi di imaging ottico come microscopi miniaturici che possono essere impiantati sulla testa dell'animale. Ciò consente al ricercatore di seguire l'attività neuronale negli animali che si muovono liberamente.Originariamente, la tecnica è stata utilizzata per studiare la plasticità strutturale nei neuroni ippocampali. Oggi, è implementato nello studio dell'attività neuronale anche in altre aree cerebrali.

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Per capire le dinamiche della rete di microcircuiti nella neocorteccia, è essenziale per registrare contemporaneamente l'attività di un gran numero di neuroni. In vivo a due fotoni di imaging del calcio è l'unico metodo che permette di registrare l'attività di una densa popolazione neuronale con cella singola risoluzione.

In Vivo 2-Photon Imaging di calcio a livello 2 / 3 dei topi

Fonte: Maruoka, H., et. al. Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. J. Vis. Exp. (2022) Questo video mostra una procedura di microscopia a due fotoni per l'imaging dell'attività neuronale e della dinamica microgliale in un topo sveglio durante la stimolazione visiva, evidenziando i transitori del calcio e le interazioni cellulari.

Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Fonte: Ulivi, A. F., et. al. Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019) Questo video mostra l'imaging longitudinale a due fotoni di neuroni piramidali marcati in fluorescenza in un topo vivo,  mostrando la preparazione, l'allineamento della cannula e l'imaging di dendriti e spine dendritiche per studiare la struttura neuronale nella regione CA1 dell'ippocampo.

Imaging longitudinale a due fotoni di neuroni marcati in fluorescenza in un ippocampo di topo vivo 

Fonte: Kamei, R., et. al., Imaging cronico a due fotoni in vivo della microglia nell'ippocampo del topo. J. Vis. Exp. (2022)Il video mostra il processo di configurazione e imaging per la microscopia a due fotoni in vivo della dinamica microgliale nel CA1 dell'ippocampo (Cornu ammonis 1) e nel giro dentato, garantendo un allineamento ottico ottimale e una valutazione dell'integrità strutturale.

Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali.

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Questo articolo descrive un metodo per l'osservazione cronica in vivo della microglia a riposo nell'ippocampo CA1 del topo utilizzando la chirurgia controllata con precisione e la microscopia a due fotoni.

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