Scratch Migration Ssay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro e In Vivo Analisi della Guarigione delle Ferite

Qui, presentiamo un protocollo per un saggio in vitro graffio utilizzando fibroblasti primari e per un saggio di guarigione della ferita della pelle in vivo nei topi. Entrambi i test sono metodi semplici per valutare la guarigione delle ferite in vitro e in vivo.

Il bisogno insurrezionale di trattamento delle ferite della pelle. Per identificare le molecole target per i trattamenti farmacologici, sono necessari sistemi di test in vitro e in vivo. I sistemi appropriati sono il test dei graffi in vitro e la camera di piegatura dorsale in vivo della pelle.

Entrambi sono procedure semplici per monitorare la migrazione cellulare e la guarigione delle ferite cutanee, in assenza e presenza di composti farmacologicamente attivi. Sebbene entrambe le tecniche siano dritte, gli investigatori dovrebbero praticare l'applicazione scratch. E l'impianto della camera della piega dorsale della pelle, e il mento per ottenere risultati affidabili e riproducibili.

La dimostrazione delle procedure sarà effettuata dal Dott. Matthias Laschke, chirurgo e professore dell'istituto di chirurgia clinica e sperimentale. Prima di iniziare la procedura, utilizzare un marcatore permanente ultra fine per contrassegnare una piastra a sei pozzi per tipo di cella, con una linea orizzontale nella parte inferiore di ogni pozzo per delineare la regione di graffio per ogni coltura. La fibra primaria della piastra successiva esplode isolata dal tipo selvatico e dai topi beta 3 carenti, in una piastra a sei pozzi a 5 volte 10 alla quinta esplosione di fibre per concentrazione di pozzi.

In 2mL di DMEM integrato con siero bovino fetale al 10%. Etichettare le lastre con il tipo di cella, il genotipo e la data. E posizionare le piastre nell'incubatore di coltura cellulare per 24 ore.

La mattina successiva aggiungere 9 micro litri di ogni reagente di trasfezione a base lipidica di interesse, ai singoli tubi di micro centrifuga contenenti 150 micro litri di mezzo siero ridotto per tubo. Aggiungere 1,5 micro litri di siRNA a un secondo tubo di micro centrifuga per reagente di trasfezione contenente 150 micro litri di mezzo siero ridotto per tubo. E mescolare ogni soluzione di siRNA con un unico tubo di soluzione di reagente di trasfezione.

Dopo aver brevemente vortice posizionare le miscele a 21 gradi Celsius per 5 minuti. Durante l'incubazione sostituire con cura il supernate in ogni pozzo. Con 2,25 mL di mezzo di coltura fresco lungo il lato dei pozzi.

Alla fine dell'incubazione aggiungere 250 micro litri della miscela di reagente di trasfezione del siRNA appropriata, cadere saggiamente in ogni pozzo corrispondente di cellule. E riportare le piastre all'incubatore di coltura cellulare per 72 ore. Quando le celle hanno raggiunto il 100% di confluenza, scartare il supernatante delle impostazioni cultura da ogni pozzo.

E usa una punta di pipetta da 200 micro litri per creare graffi nel monostrato a celle confluenti. Verticale alla linea orizzontale contrassegnata nella parte inferiore di ogni pozzo. Quindi sciacquare accuratamente ogni ferito ben 2 volte con 2mL di PPS per lavaggio.

Per rimuovere eventuali fattori rilasciati dalle cellule danneggiate, dalle cellule sciolte o dai detriti dall'area graffiata. Dopo il secondo lavaggio aggiungere 2mL di mezzo di coltura cellulare fresco integrato con 1 o 10 percento di siero ad ogni pozzo. E catturare le immagini delle ferite in ogni piatto sul palco di un microscopio luminoso.

Immediatamente dopo aver graffiato con un ingrandimento 10X. Quindi riportare il piatto all'incubatore di coltura cellulare. Continuare a catturare le immagini nei punti di tempo sperimentali appropriati per le prossime 30 ore.

Al termine dell'esperimento quantificare l'area libera iniziale delle cellule e l'area rimanente dopo 6, 10 e 30 ore di coltura. Per determinare la percentuale dell'area scratch ripopolata dalle celle di migrazione rispetto all'area iniziale del graffio. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del dito, nel tipo selvaggio o beta tre knockout C57 nero sei topo, radere accuratamente il dorsum.

E applicare unguento agli occhi dell'animale. Applicare la crema depilatoria per eliminare i capelli rimanenti. Rimozione della crema dopo 10 minuti.

Per preparare la camera in titanio, fissare una parte del telaio simmetrico della camera in titanio, con le viti di collegamento con dadi. Per mantenere da 400 a 500 micrometri tra le due parti simmetriche della camera. Per evitare la compressione delle vescicole di sangue nella pelle.

Disinfettare la pelle esposta con il 70% di etanolo. E afferrare una piega di pelle di fronte a una fonte di luce. Posizionare la linea centrale del doppio strato di pelle in cui verrà impiantata la camera in titanio.

E fissare cranialmente e caudally la piega della pelle con una sutura in polipropilene. Stringere l'altro lato della sutura su un rack metallico per sollevare la pelle piegata. E regolare l'altezza del rack per consentire al mouse di sedersi comodamente.

Sutura il primo telaio della camera in titanio da suture in polipropilene su di esso bordo superiore alla parte posteriore della piega dorsale della pelle. Dopo aver riconfermato la sedazione utilizzare forbici fini per fare piccole incisioni nella pelle. E passare le due viti di collegamento attaccate alla prima metà della camera in titanio attraverso la base della piega della pelle.

Rimuovere il mouse dal rack e posizionare l'animale in posizione laterale. Posizionare la seconda metà in omaggio della camera in titanio sopra le 3 viti di collegamento. E applicare manualmente una leggera pressione per passare queste viti attraverso la seconda metà del telaio in titanio.

Lo strato di pelle piegata è ora inserito tra le due metà simmetriche del telaio in titanio. Quindi fissare entrambe le parti simmetriche con dadi in acciaio inossidabile. Utilizzando un punzone di biopsia standardizzato di 2 mL di diametro, contrassegnare l'area della ferita al centro della pelle, all'interno della finestra di osservazione della camera di piegatura della pelle.

E usa forcep e forbici fini per rimuovere l'intera epidermide e derma all'interno del marchio. Per creare una ferita circolare. Pulire la ferita quadrata da 3 a mezzo a 4 metri e mezzo con 0,5 mL di steril salina.

E coprire la ferita con una coverlip di vetro. Utilizzare la pinzera dell'anello a scatto sulla camera in titanio per fissare il coperchio in posizione. E trasferire immediatamente il mouse nella fase di imaging di uno stereomicroscopio.

Quindi immagine della ferita con un ingrandimento 40X. Prima di posizionare il mouse in una gabbia con monitoraggio fino al completo recupero. Dopo aver creato un graffio utilizzando una punta di pipetta da 200 micro litri come dimostrato, in questo esperimento rappresentativo, le cellule di entrambi i genotipi migrarono nell'area dei graffi e coldere lo spazio.

La migrazione cellulare è stata quindi quantificata come percentuale di area scratch ripopolata migrando le cellule 6 ore dopo aver eseguito il graffio. Ad esempio in questo esperimento la migrazione di esplosioni di fibre carenti di Cav beta 3 ha chiuso l'area dei graffi significativamente prima delle esplosioni di fibre da topi di tipo selvatico. Per confermare l'effetto dipendente Cav beta 3 osservato nelle esplosioni di fibre carenti di Cav beta 3, le esplosioni di fibre di tipo selvatico sono state trasfette con siRNA per regolare verso il basso la proteina Cav beta 3.

Le esplosioni in fibra trattate con i siRNA specifici Cav beta 3 si sono comportate come esplosioni di fibre carenti di beta 3. Per confrontare la guarigione delle ferite cutanee tra entrambi i genotipi, l'area della ferita nella camera di piegatura della pelle è stata fotografata direttamente dopo il mento. E la ferita è stata con un'immagine nelle prossime due settimane.

Le dimensioni delle ferite sono state misurate sulle immagini e l'area della ferita, in un dato giorno è stata espressa come, la percentuale dell'area iniziale della ferita. Come previsto il tasso di chiusura delle ferite è stato aumentato nel Cav beta 3 topi carenti rispetto ai controlli di tipo selvaggio. Assicurarsi di applicare la stessa pressione alla punta della pipetta, per ogni graffio e di abbinare i graffi alle linee contrassegnate sul fondo della piastra il più vicino possibile.

La finestra di osservazione della camera di piegatura della pelle dorsale può essere aperta in qualsiasi momento durante il processo di guarigione. Consentendo l'applicazione topica di diversi composti farmacologicamente attivi. È anche possibile asportare l'area ferita in diverse fasi del processo di guarigione.

Per analisi biochimiche o istologiche delle proteine molecolari.