Name: Studio dellinfezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Scopri la purificazione degli sporozoi di Cryptosporidium parvum e le tecniche di microiniezione negli organoidi intestinali umani. Questo metodo consente di studiare le interazioni ospite-patogeno con precisione.

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Siamo grati a Deborah A. Schaefer della School of Animal and Comparative Biomedical Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Università dell'Arizona, Tucson, Az, USA per averci aiutato con la produzione e l'analisi degli oocisti. Ringraziamo anche Franceschi Microscopy and Imaging Center e D.L. Mullendore alla Washington State University per la preparazione e l'imaging di oocisti organoidi isolati.
D.D. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 016.Veni.171.015). I.H. è il destinatario di una sovvenzione VENI dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO-ALW, 863.14.002) ed è stata sostenuta dalle borse Marie Curie della Commissione europea (Proposta 330571 FP7-PEOPLE-2012-IIF). La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del ERC Advanced Grant Agreement n. 67013 e da NIH NIAIH sotto R21 AT009174 a RMO. Questo lavoro fa parte dell'Oncode Institute, che è in parte finanziato dalla Società Olandese per il Cancro ed è stato finanziato da una sovvenzione della Società Olandese per il Cancro.

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<li>DeCicco RePass, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Bioengineered+Three-Dimensional+Human+Intestinal+Model+for+Long-Term+Infection+of+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Novel Bioengineered Three-Dimensional Human Intestinal Model for Long-Term Infection of Cryptosporidium parvum.</a> Infection and Immunity. 85 (3), (2017).</li>
<li>Miller, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culture+platform+for+Cryptosporidium+that+enables+long-term+cultivation+and+new+tools+for+the+systematic+investigation+of+its+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">A cell culture platform for Cryptosporidium that enables long-term cultivation and new tools for the systematic investigation of its biology.</a> International Journal for Parasitology. 48 (3-4), 197-201 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expanding+human+airway+organoids+for+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Long-term expanding human airway organoids for disease modelling.</a> bioRxiv. , https://www.biorxiv.org/content/early/2018/05/09/318444 (2018).</li>
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<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+Cryptosporidium+infection+in+human+small+intestinal+and+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modelling Cryptosporidium infection in human small intestinal and lung organoids.</a> Nature Microbiology. 3 (7), 814-823 (2018).</li>
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<li>O'Connor, R. M., Kim, K., Khan, F., Ward, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cpgp40%2F15+in+Toxoplasma+gondii%3A+a+surrogate+system+for+the+study+of+Cryptosporidium+glycoprotein+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Expression of Cpgp40/15 in Toxoplasma gondii: a surrogate system for the study of Cryptosporidium glycoprotein antigens.</a> Infection and Immunity. 71, 6027-6034 (2003).</li>
<li>Wilke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+Antibodies+to+Intracellular+Stages+of+Cryptosporidium+parvum+Define+Life+Cycle+Progression+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Monoclonal Antibodies to Intracellular Stages of Cryptosporidium parvum Define Life Cycle Progression In Vitro.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li>
<li>Vinayak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+the+diarrhoeal+pathogen+Cryptosporidium+parvum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of the diarrhoeal pathogen Cryptosporidium parvum.</a> Nature. 523 (7561), 477-480 (2015).</li>
<li>Dijkstra, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Tumor-Reactive+T+Cells+by+Co-culture+of+Peripheral+Blood+Lymphocytes+and+Tumor+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids.</a> Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La coltura dei parassiti del Cryptosporidium negli organoidi intestinali e delle vie aeree fornisce un modello accurato per studiare le interazioni ospite-parassita10, ma ha anche molte altre applicazioni. Ad esempio, gli attuali metodi di selezione e propagazione dei parassiti del Cryptosporidium geneticamente modificati richiedono un passaggio nei topi19, il che non consente l'isolamento dei parassiti che hanno modifiche essenziali per l'infezione in viv...

Lo sviluppo di farmaci o vaccini per il trattamento e la prevenzione dell'infezione da Cryptosporidium è stato ostacolato dalla mancanza di sistemi in vitro che imitano precisamente la situazione in vivonell'uomo 1,2. Molti dei sistemi attualmente disponibili consentono solo l'infezione a breve termine (<5 giorni) o non supportano l'intero ciclo di vita del parassita3,4. Altri sistemi che consentono il completo sviluppo del parassita si basano su linee cellulari immortalate o linee cellulari tumorali che non ricapitolano fedelmente la situazione fisiologicanell'uomo 5,6,7 . Gli organoidi o "mini-organi" sono strutture derivate di tessuto 3D che vengono coltivate in una matrice extracellulare integrata con vari fattori di crescita specifici del tessuto. Gli organiidi sono stati sviluppati da vari organi e tessuti. Sono geneticamente stabili e riassumono la maggior parte delle funzioni degli organi della loro origine, e possono essere mantenuti in coltura per lunghi periodi di tempo. Abbiamo sviluppato un metodo per infettare gli organoidi intestinali e polmonari umani con il Cryptosporidium che fornisce un modello accurato in vitro per lo studio delle interazioni ospite-parassita rilevanti per la criptosporidiosi intestinale e respiratoria8 ,9,10,11,12,13. A differenza di altri modelli di coltura pubblicati, il sistema organoide è rappresentativo delle interazioni reali dell'ospite, consente il completamento del ciclo di vita in modo che tutte le fasi del ciclo di vita dei parassiti possano essere studiate e mantenga la propagazione dei parassiti per un massimo di 28 giornie 10.
Cryptosporidium parvum è un parassita apicomplexa che infetta l'epitelio dei tratti respiratori e intestinali, causando una malattia di diarrea prolungata. Lo stadio ambientale resistente è l'oocisti, che si trova negli alimenti e nell'acqua contaminati14. Una volta ingerito o inalato, l'oocisti si estingo e rilascia quattro sporozoiti che si attaccano alle cellule epiteliali. Gli sporozoiti scivolano sulle cellule ospiti e coinvolgono i recettori delle cellule ospiti, ma il parassita non invadere completamente la cellula e sembra indurre la cellula ospite a inghiottirla15. Il parassita, che viene interiorizzato all'interno di un compartimento intracellulare ma extracitoplasmatica, rimane sulla superficie apicale della cellula, replicandosi all'interno di un vacuolo parassofoso. Subisce due cicli di riproduzione asessuata, un processo chiamato merogonia. Durante la meroginia, si sviluppano meronts di tipo I che contengono otto merozoiti che vengono rilasciati per invadere nuove cellule. Questi merozoiti invadono nuove cellule per svilupparsi in meront di tipo II contenenti quattro merozoiti. Questi merozoiti, una volta rilasciati, infettano le cellule e si sviluppano in macrogamont e microgamont. I microgameti vengono rilasciati e fertilizzano i macrogameti che producono zigoti che maturano in oocisti. Le oocisti mature vengono successivamente rilasciate nel lume. Le oocisti sono o a parete sottile che immediatamente si estesciper reinfettare per reinfettare l'epitelio, o spesse mura che vengono rilasciate nell'ambiente per infettare il prossimo ospite14. Tutte le fasi del ciclo di vita di Cryptosporidium sono state identificate nel sistema di coltura organoide precedentemente sviluppato dal nostro gruppo10.
Dal momento che gli organoidi umani replicano fedelmente i tessuti umani9,11,13, e supportano tutte le fasi replicative del Cryptosporidium10, sono il sistema di coltura dei tessuti ideale per studiare Biologia del cryptosporidium e interazioni ospite-parassita. Qui descriviamo le procedure per infettare gli organoidi sia con le oocisti di Cryptosporidium che con gli sporozoiti eccitati e per isolare le nuove oocisti prodotte in questo sistema di coltura tissutale.

<table><tbody><tr><td>Estratto di membrana basale (matrice extracellulare)</td><td>amsbio</td><td>3533-010-02</td><td>&nbsp; Anticorpo </td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo (anticorpo specifico per oocisti)</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLR-1X</td><td>Concentrazione finale = Utilizzare 2-3 gocce/diapositiva</td></tr><tr><td>Crypto-Grab IgM rivestito Perline magnetiche</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Portapacchi Dynamag 15</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12301D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynamag 2 rastrelliera</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12321D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Filtri a membrana in policarbonato Isopore - 3&micro; m</td><td>EMD-Millipore</td><td>TSTP02500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colorante verde veloce</td><td>SIGMA</td><td>F7252-5G&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Microiniettore Femtojet 4i</td><td>Eppendorf</td><td>5252000013</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Capillari in vetro da 1 mm di diametro</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel (matrice extracellulare)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta per microfuga 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>T9661-1000EA</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Punte per microcaricatori</td><td>Eppendorf</td><td>612-7933</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette P-97</td><td>Strumento otturatore</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero d'asino normale</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio (utilizzare il 5%)</td><td>Clorox</td><td>50371478</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Super bastone scivoli</td><td>Waterborne, Inc</td><td>S100-3</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnex-25 47 mm Portafiltro in policarbonato</td><td>EMD-Millipore</td><td>SX0002500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido tautocolico sale sodico idrato</td><td>SIGMA</td><td>T4009-5G</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Merck</td><td>8221840500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Agente di montaggio Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific industries, Inc</td><td>SI0236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Adv+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)</td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </td><td>Quantità finale</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Penstrep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>5 mL di stock in 500 mL DMEM</td></tr><tr><td></td><td>Glutamax Gibco</td><td>35050038</td><td>5 mL di stock in 500 mL</td></tr><tr><td>DMEM Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td>5 mL di stock in 500 mL di DMEM</td></tr><tr><td> INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (Mezzi di espansione)</td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>Concentrazione finale</forte></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>0,5 &; M</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>preparare fino a 100 mL</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>1x</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006-1mg</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>NIC</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin CM</td><td>In casa*</td><td>&nbsp;</td><td>10%</td></tr><tr><td>Inibitore P38 (SB202190)</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>PGE2</td><td>Tocris</td><td>2296/10</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1 mL/500 mL media</td></tr><tr><td>RSpoI CM</td><td>Interno*</td><td>&nbsp;</td><td>20%</td></tr><tr><td>Wnt3a CM</td><td>In casa*</td><td>&nbsp;</td><td>50%</td></tr><tr><td>In house* - le linee cellulari saranno fornite su richiesta</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (Mezzi di differenziazione)</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>Per differenziare gli organoidi, gli organoidi dell'intestino tenue in espansione sono stati coltivati in un terreno ricco di Wnt per sei o sette giorni dopo la scissione, e poi cresciuti in un mezzo di differenziazione (ritiro di Wnt, nicotinamide, SB202190, in un mezzo di differenziazione (ritiro di Wnt, nicotinamide, SB202190, prostaglandina E2 da un mezzo ricco di Wnt o OME)</td></tr><tr><td><forte>MEZZO ORGANOIDE POLMONARE- LOM (Terreno di differenziazione)</forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </td><td>Concentrazione finale</td></tr><tr><td>Adv+++</td><td>&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td>preparare fino a 100 mL</td></tr><tr><td>ALK-I A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939-50mg</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td>0,0763888889</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma</td><td>A9125-25G</td><td>1,25 mM</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Contatta l'azienda direttamente</td><td>10%</td></tr><tr><td>p38 MAPK-I</td><td>Sigma</td><td>S7076-25 mg</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>1:500</td></tr><tr><td>RhoKI Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>M1817_100 mg</td><td>2,5 &micro; m</td></tr><tr><td>Rspo UPE</td><td>U-Protein Express</td><td>Contatta l'azienda direttamente</td><td>10%</td></tr><tr><td>Tampone riducente (per la risospensione di oocisti e sporozoiti per iniezione)</td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>Concentrazione finale</forte></td></tr><tr><td>L-Glutatione ridotto</td><td>Sigma</td><td>G4251-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L di OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Sigma</td><td>61962</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L di OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma</td><td>168149-2.5G</td><td>0.5 &mu; g/&mu; L di OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Acido linoleico</td><td>Sigma</td><td>L1376-10MG</td><td>6.8 &mu; g/mL di OME/OMD /LOM</td></tr><tr><td>Taurina</td><td>Sigma</td><td>T0625-10MG</td><td>0,5 &mu; g/&mu; L di OME/OMD/LOM</td></tr><tr><td>Tampone bloccante (per colorazione con immunofluorescenza)</td><td>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>Concentrazione finale</forte></td></tr><tr><td>Siero d'asino/capra</td><td>Bio-Rad</td><td>C06SB</td><td>2%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo-Fisher</td><td>70011044</td><td>Preparare fino a 100 ml</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Merck</td><td>P1379</td><td>0,1%</td></tr><tr><td><forte>Elenco degli anticorpi utilizzati </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </forte></td><td><forte>&nbsp; </td></tr><tr><td>Alexa 568 capra anti-coniglio</td><td>Invitrogen</td><td>A-11011</td><td>Diluizione-1:500; RRID: AB_143157</td></tr><tr><td>Crypt-a-Glo Comprehensive Kit- Anticorpo marcato con fluoresceina Crypto-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A400FLK</td><td>Diluizione- 1:200</td></tr><tr><td>Crypta-Grab IMS Beads- Perle magnetiche rivestite con anticorpo monoclonale reattivo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>IMS400-20</td><td>Diluizione-1:500</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Diluizione-1:1.000; RRID : AB_2629482</td></tr><tr><td>falloidina-Alexa 674</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>Diluizione-1:1.000; RRID: AB_2620155</td></tr><tr><td>anticorpo anti-gp15 di coniglio generato da R. M. O' Connor (co-autore).</td><td>Su richiesta</td><td>Su richiesta</td><td>Diluizione-1:500</td></tr><tr><td>Sporo-Glo</td><td>Waterborne, Inc</td><td>A600FLR-1X</td><td>Diluizione- 1:200</td></tr></tbody></table>

studio dell'infezione da cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3d mediante microinjection

Studying Cryptosporidium Infection in 3D Tissue-derived Human Organoid Culture Systems by Microinjection

Cryptosporidium parvum è una delle principali cause della malattia della diarrea umana. Per comprendere la patologia del parassita e sviluppare farmaci efficienti, è necessario un sistema di coltura in vitro che riassume le condizioni nell'ospite. Gli organiidi, che assomigliano molto ai tessuti della loro origine, sono ideali per studiare le interazioni ospite-parassita. Gli organiidi sono strutture derivate da tessuti tridimensionali (3D) che derivano da cellule staminali adulte e crescono in coltura per lunghi periodi di tempo senza subire alcuna aberrazione genetica o trasformazione. Hanno una polarità ben definita con superfici apicali e basolaterali. Gli organiidi hanno varie applicazioni nei test farmacologici, nel bio banking e nella modellazione della malattia e negli studi sull'interazione tra host e microbo. Qui presentiamo un protocollo passo-passo di come preparare le oocisti e sporozoiti di Cryptosporidium per infettare gli organoidi intestinali e delle vie aeree umane. Dimostriamo quindi come la microiniezione può essere utilizzata per iniettare i microbi nel lume organoide. Ci sono tre metodi principali con cui gli organoidi possono essere utilizzati per gli studi di interazione host-microbe: microiniezione, tosatura meccanica e placcatura, e facendo monostrati. La microiniezione consente il mantenimento della struttura 3D e consente un controllo preciso dei volumi di parassiti e il contatto laterale apicale diretto per i microbi. Forniamo dettagli per una crescita ottimale degli organoidi per la produzione di imaging o oocisti. Infine, dimostriamo anche come le oocisti appena generate possono essere isolate dall'organoid per un'ulteriore elaborazione e analisi a valle.

I protocolli qui presentati si traducono in un'efficiente purificazione di oocisti e sporozoiti (Figura 1A) pronti per la microiniezione. Il protocollo di esostation si traduce nel rilascio di sporozoiti da circa il 70-80% delle oocisti, quindi è essenziale filtrare le rimanenti oocisti e gusci attraverso un filtro da 3 m. Filtrazione risultati in quasi 100% sporozoite purificazione (Figura 1B). Inoltre, l'aggiunta di un coloranti verde aiuta a garantire l'iniez...

Descriviamo protocolli per preparare le oocisti e purificare gli sporozoiti per studiare l'infezione degli organoidi intestinali e delle vie aeree da Cryptosporidium parvum. Dimostriamo le procedure per la microiniezione di parassiti nel lume organoide intestinale e l'immunostaining degli organoidi. Infine, descriviamo l'isolamento delle oocisti generate dagli organoidi.

Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection

Cryptosporidium parvum is one of the major causes of human diarrheal disease. To understand the pathology of the parasite and develop efficient drugs, an ...

Utilizzando questa procedura di purificazione e microiniezione della sporozoite, essenzialmente qualsiasi microbo ospite può essere studiato in qualsiasi sistema di organi derivati dai tessuti. Usando questa tecnica, possiamo controllare la quantità di sporozoiti puri iniettati nel lume organoide o nel lato apicico dell'organoide. Per purificare le sporozoiti di C.parvum, trasferire l'oocista in un tubo da 15 millilitri e rimondere le cellule a una concentrazione media di estasi una volta 10 al settimo oocista per millilitro.Dopo 60-90 minuti a 37 gradi Celsius, mescolare 14 millilitri di una soluzione di lavaggio appropriata con le oocisti e sedimentare le cellule per centrifugazione. Aspirare attentamente il supernatante per evitare di perdere oocisti e rimescolare il pellet sporozoico a un tre volte 10 al settimo oocista per uno o due millilitri di concentrazione DMEM. Per rimuovere eventuali oocici e gusci rimanenti, posizionare una canna da 10 millilitri dotata di un apparecchio portafiltro da 47 millilitri dotato di un filtro in policarbonato di dimensioni di pori di tre micrometri in un tubo da 15 millilitri a quattro gradi Celsius.Aggiungere 7,5 millilitri della sospensione di sporozoite all'assieme del filtro. Quando l'intero volume è passato attraverso il colino per gravità, lavare tutte le cellule rimanenti attraverso il colino con altri 7,5 millilitri di DMEM. Quando tutto il lavaggio è passato attraverso il colino, raccogliere la sospensione di sporozoite filtrata per centrifugazione per 10 minuti ed etichettare il pellet in 50-100 microlitri di un apposito mezzo di coltura organoide, integrato con colorante verde veloce allo 0,05%, e L-glutatione, betaina, L-cisteina, acido linoleico e taurina contenente tampone riducente.Per microiniettare i parassiti nel lato apicale di un organoide 3D, utilizzare prima un estrattore di micropipette per preparare i capillari di iniezione di vetro. Utilizzare le forcep per tagliare la punta del capillare a un diametro da nove a 12 micrometri per consentire un facile flusso di sporozoiti o oocici, se si sceglie di iniettare direttamente oocista, e utilizzare punte di micro-caricatore per riempire ogni capillare con un veloce colorante verde etichettato o sospensione di sporozoite. Quindi, caricare il primo capillare riempito di sporozoite in un microiniettore e utilizzare un microscopio invertito con un ingrandimento 5x e una pressione costante per microiniettare da 100 a 200 nanolitri della sospensione in ogni organoide.Il protocollo di escystation provoca il rilascio di sporozoiti da circa il 70 all'80% delle oocici. Pertanto, è essenziale filtrare i gusci di oocista rimanenti attraverso una filtrazione di tre micrometri. Rimuovere quasi il 100% delle oocista non eccitate.Inoltre, l'aggiunta di un colorante verde aiuta a garantire l'iniezione di tutti gli organoidi e consente la visualizzazione degli organoidi iniettati per almeno 24 ore dopo l'iniezione. Sebbene questo sia un metodo ben praticato, la microscopia elettronica a scansione può essere utilizzata per garantire che il processo di escystation non abbia danneggiare le sporozoiti o le oocici. L'iniezione di quantità uguali di oocista nel lume organoide può essere confermata visivamente da una semplice imaging microscopica.I test di immunofluorescenza possono anche essere utilizzati per esplorare i tipi di cellule infettate dal Cryptosporidium. Dopo che gli organoidi differenziati sono stati infettati per cinque giorni, la presenza di sporozoiti all'interno delle oocista può essere confermata asciugando una porzione di oocista su uno scivolo adesivo, fissando gli oocici con metanolo e combinando la colorazione DAPI con un anticorpo adatto specifico per oocista. Per ottenere i massimi risultati, utilizzare oocista fresco, utilizzare lo stesso capillare per tutte le iniezioni e cambiare il supporto ogni giorno dopo l'iniezione.Utilizzando questa tecnica, vari laboratori stanno iniziando a utilizzare organoidi per studiare le interazioni ospite-microbo. Stiamo studiando commensals e altri agenti patogeni in contesti di microcoltura organoide simili. Poiché cryptosporidium è un parassita umano, è importante eseguire questi esperimenti secondo le normative di sicurezza di livello 2.

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Immunologia e Infezioni

In questo video, dimostriamo un metodo in vitro per purificare gli sporozoiti da oocisti a pareti spesse del parassita patogeno Cryptosporidium parvum. Gli sporozoiti isolati possono essere utilizzati per studi sulle infezioni.

Isolamento in vitro di sporozoiti da oocisti di Cryptosporidium parvum

Questo video dimostra una tecnica di microiniezione per sviluppare un modello di infezione da organoidi intestinali umani. Lo stadio infettivo di sporozoite del parassita Cryptosporidium parvum viene microiniettato nel lume dell'organoide. Dopo aver invaso le cellule epiteliali dell'organoide, subisce una riproduzione asessuata e sessuale per completare il suo ciclo vitale e diffonde l'infezione.

Una tecnica per sviluppare un'infezione parassitaria negli organoidi intestinali tramite microiniezione

Questo protocollo spiega cultura organoide Lgr5-positivo primaria e la successiva esecuzione di trasduzione retrovirale. Ciò consente sovraespressione Cre-inducibile o knockdown del transgene consegnato e permette studi funzionali da realizzare nel romanzo in vitro organotipica   sistema modello.

Un protocollo video di infezione retrovirale in Primaria intestinale organoide Cultura

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Le colture derivate da cellule staminali hanno un enorme potenziale per modellare le malattie infettive. Qui viene descritta la coltura di organoidi gastrici di topo e umani derivati da cellule staminali adulte. Gli organoidi vengono microiniettati con l'agente patogeno gastrico Helicobacter pylori.

Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell&#39;uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell&#39;Helicobacter Pylori

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Gli organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSC) offrono interessanti opportunità per modellare le malattie enteriche in vitro. Dimostreremo la differenziazione degli hiPSCs in organoidi intestinali (iHOs), la stimolazione di questi iHOs con citochinesi e la microiniezione di Salmonella typhimurium nel lume Iho, permettendo lo studio di un'invasione epiteliale da parte di questo agente m patogeno.

Utilizzando organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotta dall'uomo per studiare e modificare la protezione delle cellule epiteliali contro la Salmonella e altri patogeni

Qui presentiamo due protocolli che consentono la modellazione di interazioni intestinali apicali-specifiche. I monostrati intestinali di derivazione organoide e le colture Air-Liquid Interface (ALI) facilitano la generazione di epitelia ben differenziate accessibili sia dal lato luminare che basolaterale, mentre gli organoidi intestinali invertiti dalla polarità espongono il loro lato apicale e sono suscettibili a test ad alta produttività.

Metodi di coltura per studiare interazioni apicali-specifiche utilizzando modelli organoidi intestinali

Il presente protocollo descrive la creazione di un sistema di organoidi del colon murino per studiare l'attività e il funzionamento delle cellule staminali del colon in un modello knockout di claudina-7.

Coltura tridimensionale di cripte coloniche murine per studiare ex vivo la funzione delle cellule staminali intestinali

Descriviamo un protocollo per isolare le piccole cripte intestinali murine e la coltura di organoidi 3D intestinali dalle cripte. Inoltre, descriviamo un metodo per generare organoidi da una singola cellula staminale intestinale in assenza di una nicchia cellulare sub-epiteliale.

La coltura 3D di organoidi da cripte intestinali murine e una singola cellula staminale per la ricerca sugli organoidi

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

Scopri la purificazione degli sporozoi di Cryptosporidium parvum e le tecniche di microiniezione negli organoidi intestinali umani. Questo metodo consente di studiare le interazioni ospite-patogeno con precisione.

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Studio dell'infezione da Cryptosporidium nei sistemi di coltura degli organiidi umani derivati dai tessuti 3D mediante Microinjection

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