Name: Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Scopri come quantificare l'affinità di legame tra proteine RBP e RNA in cellule batteriche vive. Questo saggio basato sulla repressione di un gene reporter fornisce informazioni critiche sulle interazioni proteina-RNA in vivo.

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma I-CORE del Comitato di pianificazione e budgeting e dalla Israel Science Foundation (Grant no. 152/11), Marie Curie Reintegration Grant No. PCIG11-GA- 2012-321675 e dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 664918 - MRG-Grammar.

1. Preparazione del sistema
<ol><li>Progettazione di plasmidi di sito di rilegatura
	<ol>
<li>Progettare la cassetta del sito di rilegatura come illustrato nella Figura 1. Ogni minigene contiene le seguenti parti (da 5 a 3'): sito di restrizione Eagl, 40 basi dell'estremità 5' del gene di resistenza kanamycin (Kan), promotore di pLac-Ara, sito di rilegatura ribosomi (RBS), AUG del gene mCherry, un distanziale (che si allarga un sito di legame RBP, 80 basi dell'estremità 5'), AUG del gene mCherry, un distanziale (che si allarga un sito di legame RBP, 80 basi dell'estremità 5'), un aUG del gene mCherry, un distanziatore (che si snoda in un sito di legame RBP" del gene mCherry, e un sito di restrizione ApaLI. NOT: Per aumentare il tasso di successo del saggio, progettare tre cassette di rilegatura per ogni sito di rilegatura, con distanziali costituiti da almeno una, due e tre basi. Vedere la sezione Risultati rappresentativi per ulteriori linee guida.</li>
	</ol></li>
	<li>Clonazione di plotoni di rilegatura del sito
	<ol>
<li>Ordinare le cassette del sito di rilegatura come minigeni di DNA a doppio filamento (dsDNA). Ogni minigene è lungo 500 bp e contiene un sito di restrizione Eagl e un sito di restrizione ApaLI alle estremità 5' e 3' rispettivamente (vedere il passaggio 1.1.1). NOT: In questo esperimento, ai minigeni con metà del gene della kanamicicina è stato ordinato di facilitare lo screening delle colonie positive. Tuttavia, l'assemblaggio Gibson17 è adatto anche qui, nel qual caso il sito di rilegatura può essere ordinato come due oligodi DNA a filamento singolo complementari più brevi.</li>
		<li>Raddoppiare sia i minigeni che il vettore bersaglio con Eagl-HF e ApaLI conil protocollo di restrizione18e la colonna purifica 19 .</li>
		<li>Ligate i minigeni digeriti alla backbone legante-sito contenente il resto del gene reporter mCherry, terminatore, e un gene di resistenza alla kanamicina20.</li>
		<li>Trasformare la soluzione di legatura in Escherichia coli TOP10 cellule21.</li>
		<li>Identificare i trasformativi positivi tramite il sequenziamento di Sanger.<ol>
<li>Progettare un primer 100 basi a monte della regione di interesse (vedere la tabella 1 per le sequenze di primer).</li>
			<li>Miniprep un paio di colonie batteriche22.</li>
			<li>Preparare 5 l di una soluzione di 5 mM dell'primer e 10 l del DNA a una concentrazione di 80 ng/L.</li>
			<li>Inviare le due soluzioni a una comoda struttura per Sanger sequenziamento23.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conservare plasmidi purificati a -20 gradi centigradi, e ceppi batterici come scorte glicerolo24, entrambi nel formato 96-well. Il DNA sarà quindi utilizzato per la trasformazione in cellule E. coli TOP10 contenenti uno dei quattro plasmidi fusione RBP (vedi fase 1.3.5).</li>
	</ol></li>
	<li>Progettazione e costruzione del plasmide RBP NOT: Le sequenze di amminoacidi e nucleotidi delle proteine del mantello utilizzate in questo studio sono elencate nella tabella 2.<ol>
<li>Ordinare la sequenza RBP richiesta priva di un codon di arresto come minigene dsDNA personalizzato privo di un codon di arresto con siti di restrizione alle estremità (Figura 1).</li>
		<li>Clonare l'RBP testato privo di un codone di arresto immediatamente a valle di un promotore inducibile e a monte di una proteina fluorescente priva di un codon di inizio (Figura 1), simile ai passi 1.2.2-1.2.4. Assicurarsi che il plasmide RBP contenga un gene di resistenza agli antibiotici diverso rispetto al plasmide del sito di legame.</li>
		<li>Identificare i trasformazioni positivi tramite il sequenziamento di Sanger, in modo simile al passaggio 1.2.5 (vedere la tabella 1 per le sequenze di primer).</li>
		<li>Scegli un trasformatire positivo e rendilo chimicamente-competente25. Conservare come plasmidi purificati di glicerolo a -20 gradi centigradi e scorte di glicerolo di ceppi batterici24 a -80 gradi centigradi in piastre di 96 pozze.</li>
		<li>Trasformare i plasmidi del sito di rilegatura (dal punto 1.2.6) conservati in lastre di 96 pozzi in cellule batteriche chimicamente competenti che contengono già un plasmide RBP-mCerulean21. Per risparmiare tempo, invece di placcare le cellule sui piatti Petri, placcarle usando un pipettor a 8 canali su piatti a 8 corsie contenenti Luria-Bertani (LB)26 agar con antibiotici pertinenti (Kan e Amp). Le colonie dovrebbero comparire in 16 h.</li>
		<li>Selezionare una singola colonia per ogni doppio trasformazione e crescere durante la notte in supporto LB con gli antibiotici pertinenti (Kan e Amp) e memorizzare come scorte di glicerolo24 a -80 gradi centigradi in piatti 96-bene.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Configurazione dell'esperimento
 NOT: Il protocollo qui presentato è stato eseguito utilizzando un sistema robotico a gestione dei liquidi in combinazione con un incubatore e un lettore di lastre. Ogni misurazione è stata effettuata per 24 concentrazioni di induttori, con due duplicati per ogni ceppo: combinazione di induttore. Utilizzando questo sistema robotico, sono stati raccolti dati per 16 ceppi al giorno con 24 concentrazioni di induttori. Tuttavia, se un tale dispositivo non è disponibile, o se sono necessari meno esperimenti, questi possono essere facilmente fatti a mano utilizzando una multi-pipetta a 8 canali e adattando il protocollo di conseguenza. Ad esempio, i risultati preliminari per quattro ceppi al giorno con 12 concentrazioni di induttori e quattro punti temporali sono stati acquisiti in questo modo.
<ol><li>Preparare, in anticipo, 1 L di buffer di bioassenza (BA) mescolando 0,5 g di tryptone, 0,3 mL di glicerolo, 5,8 g di NaCl, 50 mL di 1 M MgSO4, 1 mL di 10x tampina di svafatto (PBS) tampone da tampone 7.4 e 950 mL di acqua doppia distillata (DDW). Filtro automatico o sterile del buffer BA.</li>
	<li>Far crescere i ceppi a doppia trasformazione a 37 e 250 giri/m l in 1,5 mL di LB con antibiotici appropriati (kanamycin ad una concentrazione finale di 25 g/mL e ampicillina ad una concentrazione finale di 100 g/mL), in piastre di 48 pozzetti, per un periodo di 18 h (pernotte).</li>
	<li>
Al mattino, fare i seguenti preparativi.
	<ol>
<li>Piastra di induttrice. In una piastra pulita di 96 pozzetti, preparare i pozzi con mezzi semi-poveri (SPM) composti da 95% BA e 5% LB26 nell'incubatrice a 37 gradi centigradi. Il numero di pozzi corrisponde al numero desiderato di concentrazioni di induttori. Aggiungere C4-HSL ai pozzi nella piastra dell'induttore che conterranno la più alta concentrazione di induttori (218 nM).</li>
		<li>Programmare il robot per diluire in serie il mezzo da ciascuno dei pozzi ad alta concentrazione in 23 concentrazioni più basse che vanno da 0 a 218 nM. Il volume di ogni diluizione dell'induttore dovrebbe essere sufficiente per tutti i ceppi (compresi i duplicati).</li>
		<li>Mentre le diluizioni dell'induttore sono in fase di preparazione, calde 180 gradi di SPM nell'incubatrice a 37 gradi centigradi, in piastre di 96 pozze.</li>
		<li>Diluire le sollecitazioni notturne da passo 2.2 con un fattore di 100 per diluizioni seriali: prima diluire con un fattore 10 mescolando 100 L di batteri con 900 SPM in lastre di 48 pozze, e poi diluire di nuovo di un fattore di 10 prendendo 20 180 l di SPM preriscaldato, in 96 pozze adatte per misurazioni fluorescenti.</li>
		<li>Aggiungere l'induttore diluito dalla piastra dell'induttore alle piastre del pozzo 96 con le varietà diluite in base alle concentrazioni finali.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agitare le lastre di 96 pozze a 37 gradi centigradi per 6 h, misurando la densità ottica a 595 nm (OD595),mCherry (560 nm/612 nm) e mCerulean (460 nm/510 nm) fluorescenza tramite un lettore di lastre ogni 30 min. Ai fini della normalizzazione, misurare la crescita di SMP senza celle aggiunte.</li>
</ol>3. Analisi preliminare dei risultati
<ol><li>Per ogni giorno dell'esperimento, scegliere un intervallo di tempo di crescita logaritmica in base alle curve di crescita misurate, tra la fase di crescita lineare e la stagente (T0, Tfinale). Prendere circa 6-8 punti di tempo, mentre scartare la prima e l'ultima misurazione per evitare errori derivati dall'imprecisione del rilevamento della crescita esponenziale (vedere Figura 2A, pannello superiore). NOT: Eliminare i ceppi che mostrano curve o ceppi di crescita anomali in cui non è stato possibile rilevare la fase di crescita logaritmica e ripetere l'esperimento.</li>
	<li>
Calcolare la fluorescenza media normalizzata di mCerulean e il tasso di produzione di mCherry, dai dati grezzi della fluorescenza mCerulea e mCherry per ogni concentrazione di induttore (Figura 2A).
	<ol>
<li>Calcolare mCeruleano normalizzato come segue: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq1.jpg"> dove blank(mCerulean) è il livello mCeruleano [a.u.] solo per medie, blank(OD) è la densità ottica solo per il medio, e mCerulean e OD sono rispettivamente i valori di fluorescenza mCerulean e densità ottica.</li>
		<li>Media mCerulean sui diversi punti temporali (Figura 2B, primi due pannelli) come segue: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq2.jpg"> dove #Time punti è il numero di punti di tempo dei dati presi in considerazione, T0 è il momento in cui inizia la fase di crescita esponenziale e Tfinale è il momento in cui termina la fase di crescita esponenziale.</li>
		<li>Calcolare il tasso di produzione di mCherry (Figura 2B, due pannelli inferiori) come segue: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq3.jpg"> dove mCherry(t) è il livello mCherry [a.u.] al momento t, OD è il valore di densità ottica, T0 è il momento in cui inizia la fase di crescita esponenziale e Tfinale è il momento in cui termina la fase di crescita esponenziale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infine, tracciare il tasso di produzione mCherry in funzione di mCerulean, creando curve di risposta alla dose in funzione della fluorescenza di fusione RBP-mCeruleana (Figura 2C). Tali trame rappresentano la produzione del gene reporter in funzione della presenza RBP nella cellula.</li>
</ol>4. Dose Response Funzione di adattamento Routine e KRBP Estrazione
<ol><li>Partendo dal presupposto che il tasso di traslazione ribososo con il limite RBP è costante, modellare il tasso di produzione di mCherry come segue (vedere la figura 2D,linea verde): <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq4.jpg"> dove [x] è la fluorescenza mCerulea media normalizzata calcolata in base a Eq. 2, il tasso di produzione di mCherry è il valore calcolato in base a Eq. 3, KRBP è l'affinità di legame relativa [a.u.], Knon vincolata è il tasso di ribosoma di traduzione con il RBP non associato, n è il fattore coty, e C è la fluorescenza di base [a.u.]. C, n,K , e KRBP si trovano adattando i dati del tasso di produzione di mCherry al modello (Eq. 4).</li>
	<li>Utilizzando il software di analisi dei dati, condurre una procedura di adattamento su grafici che raffigurano il tasso di produzione di mCherry in funzione della media mCerulean (passaggio 3.3), ed estrarre i parametri di adattamento in base alla formula in Eq. 4. NOT: Vengono presi in considerazione solo i risultati di montaggio con R2 &gt; 0.6. Per quelle si adatta, KRBP errore è per lo più nell'intervallo di 0.5% A 20% dei valoriRBP K, per un intervallo di confidenza 0.67, mentre quelli con più alto errore KRBP possono anche essere verificati ad occhio.</li>
	<li>Normalizzare i valori KRBP in base al rispettivo valore massimo di mCerulean mediato per ogni funzione dose-risposta. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59611/59611eq5.jpg"> dove KRBP in [a.u.] è il valore estratto dalla procedura di adattamento in Eq. 4 e max (media mCerulean) è il segnale mCerulean medio massimo [a.u] osservato per la deformazione corrente. NOT: La normalizzazione facilita il corretto confronto dell'effetto normativo tra i ceppi eliminando la dipendenza dai livelli massimi di espressione RBP.</li>
</ol>

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<li>Espah Borujeni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+quantification+of+translation+inhibition+by+mRNA+structures+that+overlap+with+the+ribosomal+footprint+in+N-terminal+coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Precise quantification of translation inhibition by mRNA structures that overlap with the ribosomal footprint in N-terminal coding sequences.</a> Nucleic Acids Research. 45 (9), 5437-5448 (2017).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+genome-wide+profiling+of+RNA+secondary+structure+reveals+novel+regulatory+features%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features.</a> Nature. 505, (2013).</li>
<li>Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+probing+of+RNA+structure+reveals+active+unfolding+of+mRNA+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo.</a> Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).</li>
<li>Lucks, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+RNA+structure+characterization+with+selective+2%E2%80%99-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+sequencing+%28SHAPE-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiplexed RNA structure characterization with selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension sequencing (SHAPE-Seq).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11063-11068 (2011).</li>
<li>Spitale, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+imprints+in+vivo+decode+RNA+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms.</a> Nature. 519 (7544), 486(2015).</li>
<li>Watters, K. E., Abbott, T. R., Lucks, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+characterization+of+cellular+RNA+structure+and+function+with+in-cell+SHAPE-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous characterization of cellular RNA structure and function with in-cell SHAPE-Seq.</a> Nucleic Acids Research. 44 (2), e12(2016).</li>
<li>Flynn, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+interrogation+of+RNA+secondary+structure+in+living+cells+with+icSHAPE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE.</a> Nature Protocols. 11 (2), 273-290 (2016).</li>
<li>Bernardi, A., Spahr, P. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+Sequence+at+the+Binding+Site+for+Coat+Protein+on+RNA+of+Bacteriophage+R17%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nucleotide Sequence at the Binding Site for Coat Protein on RNA of Bacteriophage R17.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (10), 3033-3037 (1972).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo descritto in questo articolo facilita la misurazione quantitativa in vivo dell'affinità di legame RBP-RNA nelle cellule di E. coli. Il protocollo è relativamente semplice e può essere condotto senza l'uso di macchinari sofisticati e l'analisi dei dati è semplice. Inoltre, i risultati vengono prodotti immediatamente, senza il tempo di attesa relativamente lungo associato ai risultati di sequenziamento (NGS) di prossima generazione.
Una limitazione a questo metodo è che funzio...

Negli ultimi decenni la regolazione post-trascrizione basata sulla proteina legante dell'RNA (RBP), in particolare la caratterizzazione dell'interazione tra RBP e RNA, è stata ampiamente studiata negli ultimi decenni. Ci sono diversi esempi di down-regolazione traslazionale nei batteri originari di RBP che inibiscono, o direttamente in competizione con, ribosoma legame1,2,3. Nel campo della biologia sintetica, le interazioni RBP-RNA stanno emergendo come uno strumento significativo per la progettazione di circuiti genetici basati sulla trascrizione4,5. Pertanto, c'è un aumento della domanda di caratterizzazione di tali interazioni RBP-RNA in un contesto cellulare.
I metodi più comuni per studiare le interazioni proteina-RNA sono l'analisi elettroforica del cambio di mobilità (EMSA)6, che è limitato alle impostazioni in vitro, e vari saggi pull-down7, tra cui il metodo CLIP8,9 . Mentre tali metodi consentono la scoperta di siti di legame de novo RNA, soffrono di inconvenienti come protocolli ad alta intensità di lavoro e costose reazioni di sequenziamento profondo e possono richiedere un anticorpo specifico per il pull-down RBP. A causa della natura suscettibile dell'RNA al suo ambiente, molti fattori possono influenzare le interazioni RBP-RNA, sottolineando l'importanza di interrogare il legame RBP-RNA nel contesto cellulare. Ad esempio, noi e altri abbiamo dimostrato differenze significative tra le strutture di RNA in vivo e in vitro10,11.
Sulla base dell'approccio di uno studio precedente 12, abbiamo recentemente dimostrato10 che quando si posizionano siti di legame pre-progettati per gli RBP capsidi dei batteriofages GA13, MS214, PP715e Q regione di avvio della traduzione di un reporter mRNA, espressione reporter è fortemente repressa. Vi presentiamo un metodo relativamente semplice e quantitativo, basato su questo fenomeno di repressione, per misurare l'affinità tra gli RBP e il loro corrispondente sito di legame dell'RNAin vivo.

<table><tbody><tr><td>Sale sodico di ampicillina</td><td>SIGMA</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio (MgSO4)</td><td>ALFA AESAR</td><td>33337</td><td></td></tr><tr><td>48 piastre</td><td>Axygen</td><td>P-5ML-48-C-S</td> Piastre a 8 corsie <td></td></tr><tr><td></td><td>Axygen</td><td>RESMW8I</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 96 pozzetti</td><td>Axygen</td><td>P-DW-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 96 pozzetti per lettore di piastre</td><td>Perkin Elmer</td><td>6005029</td><td></td></tr><tr><td>ApaLI</td><td>NEB</td><td>R0507</td><td></td></tr><tr><td>Sequenze del sito di legame</td><td>Gen9 Inc. e Twist Bioscience</td><td></td><td>vedere Tabella 1</td></tr><tr><td>E. coli Cellule TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>Eagl-HF</td><td>NEB</td><td>R3505</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BIO LAB</td><td>071205</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Incubatore</td><td></td>liconico <td>TECAN</td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>SIGMA</td><td>K4000</td><td></td></tr><tr><td>KpnI- HF</td><td>NEB</td><td>R0142</td><td></td></tr><tr><td>Ligasi</td><td>NEB</td><td>B0202S</td> Sistema robotizzato per la manipolazione di <td></td></tr><tr><td>liquidi</td><td>TECAN</td><td>EVO 100, MCA Software di analisi Matlab a 96 canali</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-pipetta 8 corsie</td><td>Axygen</td><td>BR703710</td><td></td></tr><tr><td>N-butanoyl-L-omoserina lattone (C4-HSL)</td><td>cayman</td><td>K40982552 019</td><td></td></tr><tr><td>tampone PBS</td><td>Biological Industries</td><td>020235A</td><td></td></tr><tr><td>Platereader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>Q5 HotStart Polimerasi</td><td>NEB</td><td>M0493</td><td></td></tr><tr><td>RBP seqeunces</td><td>Addgene</td><td>27121 & 40650</td><td>vedere la Tabella 2</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCL)</td><td>BIO LAB</td><td>190305</td><td></td></tr><tr><td>SV Gel e PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr></tbody></table>

un saggio per quantificare il legame proteino-rna nei batteri

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

Nella fase di avvio della traduzione delle proteine, il ribosoma si lega alla regione di avvio dell'mRNA. L'avvio della traduzione può essere bloccato legando una proteina legante RNA (RBP) alla regione di avvio dell'mRNA, che interferisce con il legame ribosomico. Nel metodo presentato, utilizziamo questo fenomeno di blocco per quantificare l'affinità vincolante degli RBP ai loro siti di legame cognati e non cognati. Per fare questo, inseriamo un sito di rilegatura di test nell'area di avvio di un mRNA reporter e induciamo l'espressione del test RBP. Nel caso dell'associazione RBP-RNA, abbiamo osservato una repressione sigmoidale dell'espressione dei reporter in funzione della concentrazione di RBP. Nel caso di nessuna affinità o di affinità molto bassa tra sito vincolante e RBP, non è stata osservata alcuna repressione significativa. Il metodo viene eseguito in cellule batteriche vive e non richiede macchinari costosi o sofisticati. È utile per quantificare e confrontare tra le affinità di legame di diversi RBP che sono funzionali nei batteri con una serie di siti di legame progettati. Questo metodo può essere inappropriato per i siti di rilegatura con elevata complessità strutturale. Ciò è dovuto alla possibilità di repressione dell'avvio ribosomico da parte di una complessa struttura di mRNA in assenza di RBP, che si tradurrà in una minore espressione genica del reporter basale, e quindi meno conlacuabile repressione dei reporter sul legame RBP.

Il metodo presentato utilizza la competizione tra un RBP e il ribosoma per il legame con la molecola mRNA (Figura 1). Questa concorrenza si riflette nella diminuzione dei livelli di mCherry in funzione dell'aumento della produzione di RBP-mCerulean, a causa delle crescenti concentrazioni di induttore. Nel caso di aumento della fluorescenza mCerulea, senza cambiamenti significativi in mCherry, viene dedotta una mancanza di legame RBP. I risultati rappresentati...

In questo metodo, quantifichiamo l'affinità legante delle proteine leganti l'RNA (RBP) per cognare e siti di legame non-cognati utilizzando un semplice, dal vivo, saggio reporter nelle cellule batteriche. Il saggio si basa sulla repressione di un gene reporter.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

La caratterizzazione del legame proteico con l'RNA in vivo rimane una sfida importante a causa della natura complessa dell'RNA e dei molti fattori che influenzano la sua interazione con le proteine. La proteina legante l'RNA o affinità RBP-RNA viene misurata all'interno di cellule batteriche vive. Poiché l'ambiente cellulare influisce sia sulla struttura dell'RNA che sul risultante legame RBP-RNA, misurare l'affinità in vivo è fondamentale per comprendere tali interazioni nei sistemi naturali.Il segreto del successo è nella progettazione dei plasmidi. Il progetto dovrebbe utilizzare diverse ondate di delta ed evitare l'inserimento di codoni stop e mutazioni frameshift. Iniziare questo protocollo progettando la cassetta del sito di associazione.Ogni mini gene contiene un sito di restrizione EagI, 40 basi dalle cinque estremità prime del gene di resistenza alla kanamicina, il promotore pLac/Ara, il sito di legame ribosoma, AUG del gene mCherry, un distanziale, un sito di legame RBP, 80 basi dalle cinque estremità principali del gene mCherry e un sito di restrizione ApaLI. Per aumentare il tasso di successo del saggio, progettare tre cassette del sito di rilegatura per ogni sito di rilegatura con distanziale composto da almeno una, due e tre basi. Digerisci due volte sia i mini geni che il vettore bersaglio con EagI HF e ApaLI prima di eseguire la purificazione delle colonne dei digest.Legare i mini geni digeriti alla spina dorsale del sito di legame contenente il resto del gene reporter mCherry, terminatore e un gene di resistenza alla kanamicina. Quindi trasformare la soluzione di lissgation in Escherichia coli top 10 cellule. Dopo aver identificato i trasformatori positivi tramite sequenziamento Sanger, conservare i plasmidi purificati nel formato del pozzo 96 a meno 20 gradi Celsius.Conservare anche i ceppi batterici come scorte di glicerolo nel formato 96 bene a meno 80 gradi Celsius. Ordina in modo personalizzato la sequenza RBP richiesta priva di un codone di arresto come mini gene del DNA a doppio filamento con siti di restrizione alle estremità. Trasformare i plasmidi preparati in cellule batteriche chimicamente competenti contenenti già un plasmide RBP mCerulean.Per risparmiare tempo, placcare le cellule utilizzando una pipetter a otto canali su lastre a otto corsie contenenti agar Luria-Bertani con antibiotici pertinenti. Le colonie dovrebbero apparire in 16 ore a 37 gradi Celsius. Selezionare una singola colonia per ogni doppio trasformatore e trasferirli in 48 piastre di pozzo contenenti 1,5 millilitri di LB con antibiotici appropriati.Far crescere le cellule per un periodo di 18 ore a 37 gradi Celsius tremando a 250 giri/min. Conservare le pernottamenti come scorte di glicerolo a meno 80 gradi Celsius in 96 piastre di pozzo. Al mattino, programmare il robot per riscaldare 180 microlitri di mezzo semi-poro o SPM in 96 piastre di pozzo.Programmare il robot per preparare la piastra dell'induttore. In una piastra pulita da 96 pozza, preparare pozzali con SPM composto da 95%BA e 5%LB. Il numero di pozzi corrisponde al numero desiderato di concentrazioni di induttori.Aggiungere C4-HSL ai pozzi nella piastra dell'induttore che conterrà la più alta concentrazione di induttori. Successivamente, programmare il robot per diluire serialmente il mezzo da ciascuno dei pozzi di concentrazione più alti in 23 concentrazioni inferiori che vanno da zero a 218 nanomolari. Il volume di ogni diluizione dell'induttore dovrebbe essere sufficiente per tutti i ceppi.Per diluire i ceppi notturni, programmare il robot per diluire di un fattore 10 mescolando 20 microlitri di batteri con 180 microlitri di SPM in 48 piastre di pozzo. Quindi diluire di nuovo di un fattore 10 prendendo 20 microlitri dalla soluzione diluita nella piastra di deformazione pre-preparata adatta per la misurazione fluorescente. Ora programma il robot per aggiungere l'induttore diluito dalla piastra dell'induttore alle piastre del pozzo 96 con i ceppi diluiti in base alle concentrazioni finali.Agitare i 96 piatti bene a 37 gradi Celsius per sei ore. Durante questo periodo, prendere le misurazioni della densità ottica o dell'OD a 595 nanometri, nonché della fluorescenza mCherry e mCerulean tramite un lettore di piastre ogni 30 minuti. Ai fini della normalizzazione, misurare la crescita di SPM senza l'aggiunta di celle.Qui sono mostrati grafici tridimensionali per un ceppo positivo. Le trame raffigurano livelli di OD grezzi, fluorescenza mCerulea e fluorescenza mCherry in funzione della concentrazione di tempo e induttori. I livelli di espressione dello stato stazionario mCeruleano sono stati calcolati per ogni concentrazione di induttori sia per i ceppi positivi che per i ceppi negativi.Il tasso di produzione di mCherry è stato calcolato anche per ogni concentrazione di induttori sia per i ceppi positivi che per i ceppi negativi. Il tasso di produzione di mCherry è stato tracciato in funzione della fluorescenza mCerulea media su due duplicati biologici per due ceppi. Il KRBP di adattamento utilizzando la formula di raccordo viene mostrato per lo sforzo positivo che presenta una risposta di attacco specifica.Per il ceppo negativo, non è stato estratto alcun valore KRBP. Le curve di risposta alla dose normalizzate sono state determinate per 30 ceppi diversi basati su due RMP come 10 siti di legame in luoghi diversi. Vengono osservati tre tipi di risposte, alta affinità, bassa affinità e nessuna affinità.Di seguito sono riportati i risultati quantitativi del KRBP per due RRP, la proteina del mantello MS2 e la proteina del mantello PP7 con 10 diverse cassette del sito di rilegatura. Le curve di risposta alla dose per la proteina del mantello MS2 con un sito di legame mutante in quattro luoghi diversi sono mostrate qui per dimostrare l'effetto della spaziatura mutante sulla produzione di mCherry. Viene visualizzata la sequenza del sito di associazione mutato testato.È importante utilizzare una tecnica strutturale come la forma cercare di sondare chimicamente la struttura del complesso proteina-RNA e visualizzare quali regioni di mRNA sono influenzate dal legame dell'RNA. Di recente, questa tecnica è stata utilizzata in modo ad alta velocità effettiva per misurare contemporaneamente l'affinità degli RMP in 10.000 siti di associazione.

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Ricerca

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Genetics

Genetica

Questo video dimostra l'azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando, una tecnica per lo screening sistematico ad alto rendimento delle proteine leganti il secondo messaggero nucleotidico intracellulare. Questa tecnica consente il legame diretto dei messaggeri con la proteina bersaglio sovraespressa nel lisato cellulare, bypassando la necessità di purificazione delle proteine.

Azione capillare radiale differenziale del saggio del ligando: una tecnica ad alto rendimento per identificare le proteine intracellulari leganti il secondo messaggero nucleotidico batterico

Questo video mostra un test in vivo nei batteri per studiare l'interazione delle proteine leganti l'RNA (RBP) con l'RNA. Le cellule batteriche vengono trasformate con due costrutti plasmidici: un plasmide del sito di legame che codifica per un mRNA contenente un gene reporter fluorescente a valle di un sito di legame RBP, mentre un plasmide RBP esprime le proteine RBP sotto il controllo di un induttore. Dopo l'aumento della produzione di RBP mediato dall'induttore, le RBP si legano all'mRNA,...

Saggio di repressione genica reporter per studiare la regolazione traduzionale di un gene bersaglio

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con...

Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

In questo video, descriviamo l'evoluzione sistematica dei ligandi con il metodo dell'arricchimento esponenziale (SELEX) per identificare specifiche sequenze leganti l'RNA per una proteina bersaglio di interesse. La proteina viene incubata con un ampio pool di sequenze di RNA randomizzate e le sequenze di RNA leganti la proteina vengono isolate, amplificate con PCR e sequenziate per identificare i loro siti di legame proteico.

Saggio di legame in vitro basato su SELEX per identificare le interazioni RNA-proteina

Una suite di test colorimetrici è descritto per le proteine ​​rapidamente distinguere, RNA, DNA, e la possibilità di ridurre gli zuccheri in campioni biomolecolari potenzialmente eterogenei.

Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.

Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell&#39;espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

Qui, presentiamo protocolli per selezionare e caratterizzare rapidamente gli enzimi per l'attività antimicrobica. Il saggio di diffusione su microvetrini e il saggio di rilascio del colorante utilizzano substrati batterici target per la valutazione qualitativa e quantitativa dell'attività enzimatica.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Proteine che legano specifiche sequenze di RNA giocano un ruolo critico nell'espressione genica. Caratterizzazione dettagliata di questi siti di legame è cruciale per la nostra comprensione della regolazione genica. Qui, è descritto un approccio passo-passo per mutagenesi di saturazione dei siti di legame delle proteine nel RNA. Questo approccio è rilevante per tutti i siti di legame delle proteine nel RNA.

Un approccio di mutagenesi romanzo saturazione: Unico passaggio caratterizzazione della proteina regolatrice siti in RNA usando fosforotioati di legame

Il Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA) può essere utilizzato per identificare piccole proteine leganti il ligando di un organismo utilizzando una libreria ORFeome.

Identificazione delle proteine leganti di piccoli ligandi con l'azione capillare radiale differenziale del ligando Assay (DRaCALA)

Qui, descriviamo un metodo per la co-espressione batterica di proteine marcate differenzialmente utilizzando un insieme di vettori compatibili, seguito dalle tecniche convenzionali di pulldown per studiare complessi proteici che non possono assemblarsi in vitro.

Saggio di pulldown accoppiato con co-espressione in cellule batteriche come strumento efficiente in termini di tempo per testare interazioni proteina-proteina impegnative

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Scopri come quantificare l'affinità di legame tra proteine RBP e RNA in cellule batteriche vive. Questo saggio basato sulla repressione di un gene reporter fornisce informazioni critiche sulle interazioni proteina-RNA in vivo.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

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