Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri
12 giugno 2019
In questo metodo, quantifichiamo l'affinità legante delle proteine leganti l'RNA (RBP) per cognare e siti di legame non-cognati utilizzando un semplice, dal vivo, saggio reporter nelle cellule batteriche. Il saggio si basa sulla repressione di un gene reporter.
La caratterizzazione del legame proteico con l'RNA in vivo rimane una sfida importante a causa della natura complessa dell'RNA e dei molti fattori che influenzano la sua interazione con le proteine. La proteina legante l'RNA o affinità RBP-RNA viene misurata all'interno di cellule batteriche vive. Poiché l'ambiente cellulare influisce sia sulla struttura dell'RNA che sul risultante legame RBP-RNA, misurare l'affinità in vivo è fondamentale per comprendere tali interazioni nei sistemi naturali.
Il segreto del successo è nella progettazione dei plasmidi. Il progetto dovrebbe utilizzare diverse ondate di delta ed evitare l'inserimento di codoni stop e mutazioni frameshift. Iniziare questo protocollo progettando la cassetta del sito di associazione.
Ogni mini gene contiene un sito di restrizione EagI, 40 basi dalle cinque estremità prime del gene di resistenza alla kanamicina, il promotore pLac/Ara, il sito di legame ribosoma, AUG del gene mCherry, un distanziale, un sito di legame RBP, 80 basi dalle cinque estremità principali del gene mCherry e un sito di restrizione ApaLI. Per aumentare il tasso di successo del saggio, progettare tre cassette del sito di rilegatura per ogni sito di rilegatura con distanziale composto da almeno una, due e tre basi. Digerisci due volte sia i mini geni che il vettore bersaglio con EagI HF e ApaLI prima di eseguire la purificazione delle colonne dei digest.
Legare i mini geni digeriti alla spina dorsale del sito di legame contenente il resto del gene reporter mCherry, terminatore e un gene di resistenza alla kanamicina. Quindi trasformare la soluzione di lissgation in Escherichia coli top 10 cellule. Dopo aver identificato i trasformatori positivi tramite sequenziamento Sanger, conservare i plasmidi purificati nel formato del pozzo 96 a meno 20 gradi Celsius.
Conservare anche i ceppi batterici come scorte di glicerolo nel formato 96 bene a meno 80 gradi Celsius. Ordina in modo personalizzato la sequenza RBP richiesta priva di un codone di arresto come mini gene del DNA a doppio filamento con siti di restrizione alle estremità. Trasformare i plasmidi preparati in cellule batteriche chimicamente competenti contenenti già un plasmide RBP mCerulean.
Per risparmiare tempo, placcare le cellule utilizzando una pipetter a otto canali su lastre a otto corsie contenenti agar Luria-Bertani con antibiotici pertinenti. Le colonie dovrebbero apparire in 16 ore a 37 gradi Celsius. Selezionare una singola colonia per ogni doppio trasformatore e trasferirli in 48 piastre di pozzo contenenti 1,5 millilitri di LB con antibiotici appropriati.
Far crescere le cellule per un periodo di 18 ore a 37 gradi Celsius tremando a 250 giri/min. Conservare le pernottamenti come scorte di glicerolo a meno 80 gradi Celsius in 96 piastre di pozzo. Al mattino, programmare il robot per riscaldare 180 microlitri di mezzo semi-poro o SPM in 96 piastre di pozzo.
Programmare il robot per preparare la piastra dell'induttore. In una piastra pulita da 96 pozza, preparare pozzali con SPM composto da 95%BA e 5%LB. Il numero di pozzi corrisponde al numero desiderato di concentrazioni di induttori.
Aggiungere C4-HSL ai pozzi nella piastra dell'induttore che conterrà la più alta concentrazione di induttori. Successivamente, programmare il robot per diluire serialmente il mezzo da ciascuno dei pozzi di concentrazione più alti in 23 concentrazioni inferiori che vanno da zero a 218 nanomolari. Il volume di ogni diluizione dell'induttore dovrebbe essere sufficiente per tutti i ceppi.
Per diluire i ceppi notturni, programmare il robot per diluire di un fattore 10 mescolando 20 microlitri di batteri con 180 microlitri di SPM in 48 piastre di pozzo. Quindi diluire di nuovo di un fattore 10 prendendo 20 microlitri dalla soluzione diluita nella piastra di deformazione pre-preparata adatta per la misurazione fluorescente. Ora programma il robot per aggiungere l'induttore diluito dalla piastra dell'induttore alle piastre del pozzo 96 con i ceppi diluiti in base alle concentrazioni finali.
Agitare i 96 piatti bene a 37 gradi Celsius per sei ore. Durante questo periodo, prendere le misurazioni della densità ottica o dell'OD a 595 nanometri, nonché della fluorescenza mCherry e mCerulean tramite un lettore di piastre ogni 30 minuti. Ai fini della normalizzazione, misurare la crescita di SPM senza l'aggiunta di celle.
Qui sono mostrati grafici tridimensionali per un ceppo positivo. Le trame raffigurano livelli di OD grezzi, fluorescenza mCerulea e fluorescenza mCherry in funzione della concentrazione di tempo e induttori. I livelli di espressione dello stato stazionario mCeruleano sono stati calcolati per ogni concentrazione di induttori sia per i ceppi positivi che per i ceppi negativi.
Il tasso di produzione di mCherry è stato calcolato anche per ogni concentrazione di induttori sia per i ceppi positivi che per i ceppi negativi. Il tasso di produzione di mCherry è stato tracciato in funzione della fluorescenza mCerulea media su due duplicati biologici per due ceppi. Il KRBP di adattamento utilizzando la formula di raccordo viene mostrato per lo sforzo positivo che presenta una risposta di attacco specifica.
Per il ceppo negativo, non è stato estratto alcun valore KRBP. Le curve di risposta alla dose normalizzate sono state determinate per 30 ceppi diversi basati su due RMP come 10 siti di legame in luoghi diversi. Vengono osservati tre tipi di risposte, alta affinità, bassa affinità e nessuna affinità.
Di seguito sono riportati i risultati quantitativi del KRBP per due RRP, la proteina del mantello MS2 e la proteina del mantello PP7 con 10 diverse cassette del sito di rilegatura. Le curve di risposta alla dose per la proteina del mantello MS2 con un sito di legame mutante in quattro luoghi diversi sono mostrate qui per dimostrare l'effetto della spaziatura mutante sulla produzione di mCherry. Viene visualizzata la sequenza del sito di associazione mutato testato.
È importante utilizzare una tecnica strutturale come la forma cercare di sondare chimicamente la struttura del complesso proteina-RNA e visualizzare quali regioni di mRNA sono influenzate dal legame dell'RNA. Di recente, questa tecnica è stata utilizzata in modo ad alta velocità effettiva per misurare contemporaneamente l'affinità degli RMP in 10.000 siti di associazione.
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Panoramica
Questo metodo quantifica l'affinità di legame delle proteine leganti l'RNA (RBPs) per siti di legame cognati e non cognati, utilizzando un saggio con reporter vivente in cellule batteriche. Il saggio si basa sulla repressione di un gene reporter, fornendo informazioni sulle interazioni RBP-RNA in vivo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Proteine leganti l'RNA
- Interazioni proteina-RNA
- Saggi in cellule vive
Sfondo
- La caratterizzazione del legame proteina-RNA in vivo è complessa a causa della complessità dell'RNA.
- L'ambiente cellulare influenza la struttura dell'RNA e il legame tra RBP e RNA.
- La misurazione dell'affinità in vivo è essenziale per comprendere le interazioni naturali.
- La progettazione del plasmide è fondamentale per il successo dei saggi.
Scopo dello studio
- Misurare l'affinità RBP-RNA in cellule batteriche vive.
- Comprendere gli effetti dell'ambiente cellulare sulle interazioni RNA-proteina.
- Migliorare la progettazione di plasmidi per cassette di siti di legame.
Metodi Utilizzati
- Progettazione di cassette di siti di legame per plasmidi.
- Utilizzo di cellule batteriche vive per misurazioni di affinità.
- Evitare codoni di stop e mutazioni di slittamento del frame nel progetto del plasmide.
- Impiego di un saggio di repressione di un gene reporter.
Risultati principali
- Quantificazione riuscita delle affinità di legame delle proteine leganti l'RNA.
- Informazioni sull'impatto delle condizioni cellulari sulle interazioni tra proteine leganti l'RNA e RNA.
- Progettazioni efficaci di plasmidi migliorano l'affidabilità del saggio.
- Dimostrata l'utilità dei saggi su cellule vive per lo studio del legame all'RNA.
Conclusioni
- Le misurazioni in vivo forniscono informazioni fondamentali sulla dinamica delle interazioni RBP-RNA.
- La progettazione del plasmide è fondamentale per il successo dei saggi di legame dell'RNA.
- Questo metodo può approfondire la nostra comprensione delle interazioni RNA-proteina.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione delle affinità di legame proteina-RNA in cellule batteriche vive affronta una sfida critica nella fase iniziale della scoperta, consentendo la misurazione diretta delle interazioni molecolari in condizioni fisiologicamente rilevanti. Questo saggio fornisce un grado predittivo di affidabilità nella validazione del bersaglio e contribuisce alla riduzione dei rischi meccanicistici nei portafogli di scoperta di farmaci mirati alle proteine leganti l'RNA (RBP). Il suo contesto in vivo e le uscite quantitative lo collocano come strumento prezioso per la selezione dei bersagli e l'ottimizzazione della scelta dei composti promettenti nei programmi terapeutici centrati sull'RNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi diretta della specificità e affinità del legame RBP-RNA in cellule vive.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio distinguendo interazioni ad alta, bassa e nulla affinità.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico rivelando effetti sul legame dipendenti dal contesto.
- Fornisce dati quantitativi per guidare decisioni di selezione o scarto nel triage del bersaglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un saggio reporter standardizzato e scalabile per valutare il legame delle RBP in più siti.
- Genera curve quantitative dose-risposta riproducibili per il confronto dell'affinità.
- Consente lo screening ad alto rendimento di varianti di RBP e mutanti dei siti di legame.
- Supporta la prontezza del saggio per la valutazione di composti successivi mirati alle interazioni RNA-proteina.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di legame in vivo con sistemi batterici rilevanti per la malattia, quando applicabile.
- Garantisce continuità dalla valutazione del legame nella fase di scoperta alla selezione dei modelli preclinici.
- Fornisce indicazioni per un avanzamento ponderato sui rischi quantificando l'interazione funzionale in contesto cellulare.
- Supporta lo sviluppo di biomarcatori traslazionali per terapie mirate a RBP.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio si inserisce nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto attivo, sostenendo sia studi meccanicistici sia flussi di lavoro di screening per le interazioni RNA-proteina.
- Biologia della Scoperta: Misure quantitative dell'interazione chiariscono la specificità e la rilevanza funzionale tra RBP e RNA.
- Screening: Output standardizzati del reporter consentono confronti riproducibili tra siti di legame e varianti di RBP.
- Analisi: I valori di risposta dose-dipendente e KRBP forniscono metriche utili per il confronto tra condizioni e la selezione di portafogli.
- Ricerca Translazionale: Dati ottenuti in vivo supportano l'allineamento con modelli batterici rilevanti per la malattia, quando appropriato.
- Riutilizzo Aziendale: Il formato del saggio è adattabile a diverse combinazioni di RBP e siti di legame, favorendo la scalabilità della piattaforma.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi dei RBP.
- Valore operativo: Offre una quantificazione dell'affinità standardizzata, scalabile e riproducibile in vivo.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati robusti sull'interazione fin dalle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione e un avanzamento dei programmi mirati all'RNA adeguati al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella progettazione di plasmidi e nella manipolazione genetica batterica.
- Necessita dell'accesso a lettori di piastre a fluorescenza e a infrastrutture di base per la biologia molecolare.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro per le condizioni del saggio e le procedure di analisi dei dati.
- Potrebbe richiedere adattamenti per siti di legame con elevata complessità strutturale, a causa di possibili repressioni di fondo.
- Limitato ai sistemi batterici; l'estensione ad altri organismi potrebbe richiedere modifiche al protocollo.
