Name: Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e limmunità ai trapianti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri il trapianto di milza vascolarizzata nel topo per studiare la biologia delle cellule spleniche e l'immunità ai trapianti. Questo metodo consente di tracciare il destino e la funzione delle cellule nel tempo.

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Gli autori ringraziano il centro di trapianto completo di Northwestern University e il programma Feinberg School of Medicine Research core per il supporto di risorse e finanziamenti. In particolare, la citometria a flusso e i servizi di istologia sono stati forniti dalla Northwestern University Flow citometria Core Facility e mouse istologia e fenotipizzazione laboratorio, rispettivamente, entrambi i quali sono supportati da NCI P30-CA060553 assegnato al Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center. Ringraziamo il signor nate Esparza per la correzione di questo manoscritto.

Tutte le procedure e l'uso animale in questo studio sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato interno per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University (IACUC). In questo studio, 8 a 10 settimana vecchio CD 45.2 e CD 45.1 topi (entrambi su sfondo BALB/c, dal laboratorio di Jackson) sono stati utilizzati come donatori di milza e riceventi, rispettivamente, per creare modelli di trapianto di milza singenici. Tutti gli animali sono stati ospitati nell'ambiente sterile nelle strutture animali della Northwestern University. Il lubrificante per gli occhi è stato applicato a tutti i topi post-anestetizzazione per prevenire la secchezza.
1. preparazione chirurgica, anestetizzazione, e regime di analgesia
<ol><li>Posizionare un telo monouso sterile (45,7 cm x 66 cm) sulla piattaforma chirurgica. Afferrare delicatamente il mouse, iniettare ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneale (i. p) per l'anestesia, e iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia.</li>
	<li>Assicurarsi che la profondità di anestesia di toe-pizzico, radersi i capelli in tutta l'area dell'addome con un rasoio e posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica sterile sotto il microscopio operativo a 6-10x ingrandimento.</li>
</ol>2. raccolta della milza del donatore
<ol><li>Sterilizzare l'addome con un tampone di preparazione di alcol, fissare gli arti con nastro chirurgico, e fare un 3-4 cm linea mediana verticale incisione cutanea dal pube al processo xifoideo con le forbici.</li>
	<li>Ritrarre la parete addominale con retrattili sterili realizzati con graffette. Spostare l'intestino sul fianco destro dell'addome (sinistra del chirurgo) con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza. Cauterizzare la breve vena gastrica attaccata alla milza con una cautela sterile a bassa temperatura (Figura 1a). Collocare un pezzo di garza sterile impregnati di 37 ° c di soluzione salina sulla milza per mantenerlo umido (Figura 1B).</li>
	<li>Separare e mobilitare la vena portale dal tessuto pancreatico (Figura 1C) legando i rami della vena portale (vena pancreaticoduodenale superiore e vena gastrica destra); Posizionare una sutura intorno alla vena del portale distale dalla vena splenica (Figura 1D).</li>
	<li>Capovolgere la milza sul lato destro per esporre l'aorta e il tronco celiaca con l'arteria splenica (Figura 1e). Dissect e mobilizza l'arteria aortica-celiaca-splenica legando l'arteria epatica e l'arteria gastrica; Posizionare una sutura intorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca (Figura 1F-G).</li>
	<li>Iniettare 100 unità internazionali (UI) di eparina nella vena cava inferiore (IVC) per eparinizzare l'intero corpo e attendere 3 minuti per assicurare che l'eparina prenda effetti. Legare l'aorta prossimale all'arteria celiaca, traslegare la vena portale, quindi perfutilizzare tutto il corpo utilizzando 10 mL di soluzione salina fredda (4 ° c) eparinizzata (10 mL/20 s) dall'aorta addominale distale al tronco celiaca (Figura 1h).</li>
	<li>Raccogliere l'innesto della milza in blocco con il segmento aortico-celiaco-splenico associato e la vena portale insieme a un segmento di vena splenica e una piccola porzione di tessuto pancreatico. Conservare l'innesto in 5 mL di 4 ° c di soluzione salina prima del trapianto. Euthanize il topo per dislocazione cervicale.</li>
</ol>3. la splenectomia del ricevente e l'impianto di innesto della milza
<ol><li>Posizionare un tampone riscaldante sulla piattaforma chirurgica e regolare la temperatura a 37 ° c. Posizionare un drappo sterile (45,7 cm x 66 cm) sulla parte superiore del tappetino riscaldante per creare una piattaforma chirurgica sterile. Ripetere i passaggi 2,1 e 2,2 per la preparazione chirurgica e l'anestetizzazione. Fare un 3-4 cm linea mediana incisione e ritrarre la parete addominale come descritto nel passo 2,1 e passo 2,2.</li>
	<li>Spostare con cautela l'intestino sul lato destro del mouse con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza del ricevente. Ligare la vena splenica e l'arteria e rimuovere la milza.</li>
	<li>Spostare con cautela l'intestino sul lato sinistro del mouse e coprire l'intestino con garza umida (impregnata con soluzione salina sterile a 37 ° c). Dissect e legare i rami lombari dell'aorta infrarenare e IVC; a croce l'aorta infrarenale e l'IVC utilizzando due morsetti microvascolari da 4 mm.</li>
	<li>Posizionare una sutura di nylon 11-0 attraverso l'aorta infrarenale (a pieno spessore) e ritrarre per creare un'aortotomia ellittica da un singolo taglio con microforbici (la lunghezza dovrebbe corrispondere al diametro dell'aorta del donatore, Figura 2a). Perforare l'IVC utilizzando un ago da 30 G per creare una venotomia ellittica ed estendere l'apertura al portale donatore con una lunghezza corrispondente con microforbici (Figura 2a).</li>
	<li>Eliminare il sangue intraluminale o il coagulo di sangue (nell'aorta e nell'IVC) con 500 μL di soluzione salina eparinizzata (10 unità/mL).</li>
	<li>Posizionare l'innesto della milza nel fianco destro dell'addome del mouse ricevente; identificare con attenzione il bracciale aortico del donatore e la vena portale del donatore. Dopo essersi assicurati che i vasi non siano attorcigliati, coprire l'innesto della milza con una garza impregnata di soluzione salina fredda (4 ° c).</li>
	<li>Collegare la cuffia aortica del donatore all'apice prossimale e distale dell'aortaotomia del ricevente con due suture di soggiorno (11-0 nylon sutura, come sotto) (Figura 2B, C). Fare un'anastomosi con 2-3 morsi di suture continue in nylon 11-0 tra il polsino aortico del donatore e l'aortaotomia del ricevente (parete anteriore) (Figura 2D). Capovolgere il innesto della milza sul lato sinistro del ricevente; fare l'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e l'aortotomia del ricevente (parete posteriore) (Figura 2e).</li>
	<li>Eseguire un'anastomosi per collegare la vena portale del donatore alla parete posteriore dell'IVC del ricevente, utilizzando da 4 a 5 morsi di sutura continue all'interno dell'IVC e quindi chiudere la sutura all'esterno dell'IVC (Figura 2F, G).</li>
	<li>Rilasciare i morsetti del recipiente e utilizzare il tampone di cotone sterile per tamponare il sanguinamento fino a quando il colore della milza viene recuperato (Figura 2h).</li>
	<li>Chiudere l'addome con una sutura di Vicryl riassorbibibile sintetica 5-0 in un modello continuo. Chiudere lo strato di pelle con una sutura di nylon 5-0 in un motivo interrotto. Nota: Per i passaggi 4.7-4.8, in alternativa, fare un'anastomosi tra la vena portale del donatore e il IVC del ricevente prima (passo 4,8); quindi fare un'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia del ricevente, utilizzando da 2 a 3 sutura continue all'interno dell'aorta e chiudere la sutura all'esterno dell'aorta.</li>
</ol>4. recupero degli animali
<ol><li>Iniettare 1 mL di soluzione salina calda per via sottocutanea tramite 4 sedi separate (0,25 mL/posizione) dopo aver chiuso l'addome.</li>
	<li>Tenere il mouse in un incubatore a temperatura controllata (30 ° c) per le prime ore successive alla post-operazione, monitorare il mouse fino a quando non ha recuperato una coscienza sufficiente, quindi trasferire il mouse in una nuova gabbia pulita con cibo e acqua regolari, con un tampone riscaldante (30 ° c ) sotto la gabbia. Mantenere il mouse post-chirurgia in una gabbia separata.</li>
</ol>5. gestione del dolore post-chirurgico
<ol><li>Iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea 24 h e 48 h post-intervento chirurgico per mantenere il regime di analgesia.</li>
</ol>

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<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
<li>Kim, E., Yang, J., Beltran, C. D., Cho, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+spleen-derived+monocytes%2Fmacrophages+in+acute+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Role of spleen-derived monocytes/macrophages in acute ischemic brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 34 (8), 1411-1419 (2014).</li>
<li>Bronte, V., Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spleen+in+local+and+systemic+regulation+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The spleen in local and systemic regulation of immunity.</a> Immunity. 39 (5), 806-818 (2013).</li>
<li>Wang, N. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+macrophages+from+the+spleen+contributes+to+myocardial+fibrosis+and+hypertension+induced+by+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Renin-Angiotensin-Aldosterone+System%22%5BJournal%5D)">Recruitment of macrophages from the spleen contributes to myocardial fibrosis and hypertension induced by angiotensin II.</a> Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 18 (2), 1470320317706653(2017).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spleen+contributes+importantly+to+myocardial+infarct+exacerbation+during+post-ischemic+reperfusion+in+mice+via+signaling+between+cardiac+HMGB1+and+splenic+RAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The spleen contributes importantly to myocardial infarct exacerbation during post-ischemic reperfusion in mice via signaling between cardiac HMGB1 and splenic RAGE.</a> Basic Research in Cardiology. 111 (6), 62(2016).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+Check+Your+Mice-A+Point+Mutation+in+the+Ncr1+Locus+Identified+in+CD45.1+Congenic+Mice+with+Consequences+in+Mouse+Susceptibility+to+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: Check Your Mice-A Point Mutation in the Ncr1 Locus Identified in CD45.1 Congenic Mice with Consequences in Mouse Susceptibility to Infection.</a> Journal of Immunology. 200 (6), 1982-1987 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Prove convincenti suggeriscono che i monociti derivati dalla milza giocano un ruolo importante nei processi infiammatori sterili come l'aterosclerosi19, il cervello ischemico acuto20 o il trauma polmonare18, così come I/R del miocardio lesioni e rimodellamento21,22,23. Questi rapporti evidenziano il ruolo di sotto-riconoscimento della milza in molte malattie...

La milza è il più grande organo linfoide secondario nel corpo ed è critica nei sistemi immunitari e ematopoietici. Le sue funzioni sono principalmente svolte da due compartimenti morfologicamente distinti, la polpa rossa e la polpa bianca1. La polpa rossa è un reticolo tridimensionale di seni venosi e corde spleniche costituite da fibre reticolari, cellule reticolari e macrofagi associati. Questa struttura unica permette alla polpa rossa di agire come un filtro del sangue efficace che rimuove i materiali estranei e gli eritrociti vecchi o danneggiati. La polpa bianca comprende i follicoli, la zona marginale e le guaine linfoidi periarteriolari (PALS) ed è un sito importante per l'intrappolamento e l'elaborazione di antigene, la produzione di linfociti, la trasformazione, la proliferazione e la maturazione2. Tuttavia, la milza è stata comunemente considerata come un organo dispensabile perché altri organi linfatici, come i linfonodi, possono anche svolgere alcune delle sue funzioni e la perdita della milza non porta di solito alla morte. La splenectomia è stata quindi ampiamente eseguita come metodo terapeutico per i pazienti con lesione splenica o malattie ematologiche benigne3. Tuttavia, i pazienti con splenectomia affrontano una serie di complicazioni a lungo termine. Le infezioni batteriche sono le complicanze più riconosciute della splenectomia4,5. Recentemente, la schiacciante sepsi post-splenectomia è stata riconosciuta come una complicazione intensiva di splenectomia associata ad un'alta mortalità6. Inoltre, recenti studi epidemiologici indicano che la splenectomia può essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che ulteriori funzioni fisiologiche della milza restano da esplorare7,8.
Nella clinica sono stati utilizzati sia l'autotrandisplazione della milza che l'allotrapianto della milza. Attualmente, la milza autotrandisplazione impiantando sezioni di tessuto splenico in sacchetti creati nel maggiore omento è considerata l'unica possibilità per preservare la funzione splenica dopo la splenectomia traumatica9,10. Tuttavia, l'efficacia di questo intervento chirurgico è discutibile come complicazioni post-chirurgia come necrosi asettica del tessuto splenico e piccola ostruzione intestinale a causa di aderenze postoperatorie potrebbe verificarsi11. L'allotrapianto della milza è coinvolto nel trapianto multiviscerale12. Le evidenze cliniche del trapianto multiviscerale suggeriscono che l'allotrapianto della milza può svolgere un ruolo protettivo nel rigetto dell'alloinnesto dell'intestino tenue senza causare la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD)12. Eppure la letteratura riguardante l'effetto benefico dell'allotrapianto della milza come componente del trapianto multiviscerale è ancora limitata e i meccanismi sottostanti restano da definire. Nel 2006, Yair Reisner et al. ha riferito che trapiantare il tessuto della milza embrionale suina che non ha cellule T ai topi potrebbe curare l'emofilia A, una malattia genetica senza causare GVHD13, sostenendo che il trapianto di milza detiene una promessa terapeutica in alcune malattie. Pertanto, vi è la necessità di ulteriori indagini sul potenziale terapeutico del trapianto di milza.
I modelli animali di trapianto di milza sono preziosi per esplorare la funzione non apprezzata delle cellule immunitarie derivate dalla milza nella progressione della malattia e per testare il potenziale effetto terapeutico del trapianto di milza. I modelli sperimentali di trapianto di milza interi sono stati documentati fin dai primi anni del 1900, come Recensito da Cohen14. Nel 1969, Coburn Richard J. e Lee et al. dettagliato la tecnica del trapianto di milza in ratti15,16. Più di recente, Swirski FK et al. ha descritto un modello murino di trapianto di milza17. Rispetto ai modelli di ratto, i modelli murini di trapianto di milza sono più attraenti a causa dei suoi numerosi vantaggi intrinseci. Ad esempio, utilizzando un modello di mouse, possiamo accedere a un'ampia varietà di reagenti non disponibili a quello dei modelli di ratto. Inoltre, utilizzando topi Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), un trapianto di milza singenici permette di tracciare il destino, la longevità e la funzione delle splenociti18. Sulla base del lavoro di Swirski FK et al.17, abbiamo ulteriormente istituito questo protocollo semplificato e migliorato del trapianto di milza nei topi. Il protocollo descritto di seguito combina l'affidabilità e la fattibilità in modo standardizzato e può essere utilizzato come strumento per studiare la biologia della milza e l'immunità ai trapianti.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Wyeth</td><td>206205-01</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di eparina</td><td>Abraxis Pharmaceutical Products</td><td>504031</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina normale per iniezione</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Pharmco Products Inc.</td><td></td><td></td>111000140</tr><tr><td>Sistema di terapia intensiva per piccoli animali ThermoCare</td><td>Thermocare, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adson Forcipe</td><td>Strumenti chirurgici Roboz</td><td>RS-5230</td><td></td></tr><tr><td>Derf Porta aghi</td><td>Strumenti chirurgici Roboz</td><td>Strumenti chirurgici RS-7822</td><td></td></tr><tr><td>Forbici da microdissezione extra fini</td> Strumenti <td>chirurgici Roboz Strumenti chirurgici</td><td>Roboz RS-5881</td><td></td></tr><tr><td>Micro-clip</td><td>Strumenti chirurgici Roboz</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>7-0 seta</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 103</td><td></td></tr><tr><td>11-0 nylon su ago da 4 mm (3/8)</td><td>Sharpoint DR4</td><td>AK-2119</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD45.2 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>553772</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD45.1 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>553776</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD11b anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Ms B220 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>553089</td><td></td></tr><tr><td>Ms Ly6C anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>48-5932-80</td><td></td></tr><tr><td>Ms Ly6G anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>561236</td><td></td></tr><tr><td>Ms F4/80 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>565614</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD11c anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>558079</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD3 anticorpo</td><td>eBioscience</td><td>48-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD4 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>552051</td><td></td></tr><tr><td>Ms CD8 anticorpo</td><td>BD Bioscience</td><td>563786</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD&trade; Kit Macchia Cellula Morta Viola Fissabile</td><td>Thermo Fisher</td><td>L34955</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

A Mouse Model of Vascularized Heterotopic Spleen Transplantation for Studying Spleen Cell Biology and Transplant Immunity

La milza è un organo linfoide unico che svolge un ruolo critico nell'omeostasi dei sistemi immunitari e ematopoietici. I pazienti che sono stati sottoposti a splenectomia indipendentemente dalle cause precipitose sono inclini a sviluppare un'infezione post-splenectomia travolgente e sperimentano un aumento dei rischi di trombosi venosa profonda e neoplasie maligne. Recentemente, studi epidemiologici hanno indicato che la splenectomia potrebbe essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che le funzioni fisiologiche della milza non sono ancora state pienamente riconosciute. Qui, introduciamo un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, che non solo può essere utilizzato per studiare la funzione e l'attività comportamentale dei sottogruppi di cellule immunitarie spleniche in diversi processi biologici, ma può anche essere un potente strumento per testare il potenziale terapeutico del trapianto di milza in certe malattie. Le principali fasi chirurgiche di questo modello includono la raccolta della milza del donatore, la rimozione della milza nativa ricevente e la rivascolarizzazione del trapianto di milza. Usando ceppi di topo Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), abbiamo osservato che dopo il trapianto syngeneico, entrambi i linfociti splenici e le cellule mieloidi derivate dal donatore migrarono fuori dal trapianto già nel giorno 1 post-operatorio, in concomitanza con l'afflusso di molteplici tipi di cellule riceventi, generando così una chimera unica.  Nonostante le tecniche relativamente impegnative, questa procedura può essere eseguita con > 90% tasso di successo. Questo modello consente di tracciare il destino, la longevità e la funzione dei splenociti durante lo steady state e in un setting di malattia a seguito di un trapianto di milza, offrendo così una grande opportunità per scoprire il ruolo distinto delle cellule immunitarie derivate dalla milza in diversi processi di malattia.

L'intera procedura del trapianto di milza del topo può essere completata entro 90 minuti da microchirurghi esperti. Il nostro laboratorio ha eseguito oltre 100 trapianti di milza nei topi. Il tasso di successo è superiore al 90%, come definito dalla sopravvivenza sia del topo ricevente che dell'innesto della milza al giorno post-operatorio (POD) 1 o POD 7 (il nostro endpoint di studio). La sopravvivenza dell'innesto della milza è stata confermata dall'aspetto macroscopico e dall'analisi d...

Questo protocollo descrive le fasi chirurgiche di un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, un modello tecnicamente impegnativo che può fungere da potente strumento per studiare il destino e la longevità delle cellule della milza, i meccanismi della milza distinta popolazioni di cellule nella progressione della malattia e immunità ai trapianti.

Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

The spleen is a unique lymphoid organ that plays a critical role in the homeostasis of the immune and hematopoietic systems. Patients that have undergone ...

Il modello di topo del trapianto di milza offre una grande opportunità per scoprire il ruolo delle cellule di milza nella regolazione delle risposte immunitarie locali e sistemiche nelle malattie infiammatorie. Il principale vantaggio di questo protocollo è che utilizzando topi congenici, il trapianto di milza consente di controllare il destino, la longevità e la funzione delle cellule di milza. Prima di iniziare la procedura, posizionare un drappo monouso sterile sulla piattaforma chirurgica e confermare la mancanza di risposta al dito del piedi nel topo donatore anestetizzato.Radere i capelli da tutta l'area addominale e posizionare il mouse su una piattaforma chirurgica sterile sotto un microscopio operativo con un ingrandimento da 6 a 10X. Sterilizzare la pelle esposta con un tampone di preparazione alcolica e fissare gli arti con nastro chirurgico. Entra nell'addome tramite un'incisione verticale della pelle della linea mediana da tre a quattro centimetri dal pube al processo xifoide.Cauterizzare i vasi cutanei ed estendere l'incisione all'addome laterale su entrambi i lati per ottenere una migliore esposizione. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, spostare l'intestino sul fianco destro dell'addome per esporre la milza e utilizzare un cautery sterile a bassa temperatura per cauterizzare la vena gastrica corta attaccata alla milza. Posizionare un pezzo di garza sterile imbevuto di 37 gradi Celsius salina sopra la milza per mantenerlo umido e separato e mobilitare la vena porta dal tessuto pancreatico.Ligate i rami della vena portale come dimostrato. Posizionare una sutura intorno alla vena porta distale dalla vena splenica e capovolgere la milza sul lato destro per esporre l'aorta e l'arteria splenica sul tronco celiaco. Sezionare e mobilitare le arterie spleniche celiache aortiche e posizionare una sutura intorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca.Iniettare 100 unità internazionali di eparina nella vena cava inferiore o nell'IVC per eparinare tutto il corpo. Dopo tre minuti, legare le arterie epatiche e gastriche nell'aorta prossimale all'arteria celiaca. Trasezionare la vena porta e perfondire tutto il corpo con 10 millilitri di quattro gradi Celsius eparinato salina dall'aorta addominale distale al tronco celiaco.Raccogliere l'innesto di milza e bloccare con il segmento splenico celiaco aortico associato nella vena porta insieme al segmento della vena splenica e una piccola porzione di tessuto pancreatico. Quindi conservare l'innesto in cinque millilitri di quattro gradi Celsius salina. Entra nell'addome ricevente tramite incisione della linea mediana dopo che l'area chirurgica è preparata come lo è per il donatore e rimuovi la milza nativa ricevente legando la vena e l'arteria splenica.Coprire i tessuti dell'intestino con una garza imbevuta di 37 gradi Celsius e spostare attentamente l'intestino sul lato sinistro. Sezionare e ligare i rami lombari dell'aorta infrarenale nell'IVC e bloccare l'aorta infrarenale nell'IVC con due morsetti microvascolari a quattro millilitri. Posizionare una sutura di nylon 11-0 attraverso l'aorta infrarenale e ritrarre il vaso per consentire la creazione di un'aortotomia ellittica con microscissori.Utilizzare un ago calibro 30 per perforare l'IVC per creare una velenotomia ellittica ed estendere l'apertura alla lunghezza della vena portale del donatore. Sciacquare l'aorta e l'IVC con 500 microlitri di soluzione salina eparinizzata per cancellare il sangue intraluminale o i coaguli di sangue dai vasi e posizionare l'innesto di milza del donatore nel fianco destro dell'addome ricevente. Identificare attentamente il polsino aortico del donatore e la vena porta.Dopo aver confermato che i vasi non sono attorcigliati, coprire l'innesto di milza con garza salina a quattro gradi Celsius imbevuta. Utilizzando due suture di permanenza 11-0, collegare il polsino aortico donatore all'apice prossimale e distale dell'aortotomia ricevente e fare un'anastomosi con due o tre morsi di suture di nylon continue 11-0 tra il polsino aortico del donatore e la parete anteriore dell'aortotomia ricevente. Ruotare l'innesto di milza sul lato sinistro del ricevente e fare l'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia ricevente.Eseguire l'anastomosi venosa tra la vena portale del donatore e l'IVC ricevente con da quattro a cinque morsi di suture continue su ciascun lato. Suturare prima la parete posteriore all'interno del lume del vaso e poi chiudere la parete anteriore usando la stessa sutura. Completare l'anastomosi con un nodo posto nell'angolo inferiore all'esterno dell'IVC.Ora rilasciare i morsetti del recipiente e utilizzare un batuffolo di cotone sterile per tamponare il sanguinamento fino a quando il colore della milza non viene recuperato. Chiudere l'addome con una sutura Vicryl sintetica assorbibile 5-0 in un motivo continuo e chiudere lo strato cutaneo con una sutura di nylon 5-0 in un motivo interrotto. Quindi iniettare 250 microlitri di soluzione salina calda sottocutaneamente in quattro posizioni separate e riscaldare il mouse in un incubatore a temperatura controllata di 30 gradi Celsius per le prime ore dopo l'operazione con monitoraggio fino a quando l'animale non ha ripreso sufficiente coscienza per il trasferimento nella gabbia domestica.L'ematossilina e l'eosina degli isografti di milza giorni uno e sette dopo il trapianto rivelano che l'architettura degli isografti di milza rimane intatta durante la prima settimana post operatoria. L'analisi citometrica del flusso per indagare la migrazione delle cellule di milza del donatore dopo il trapianto dimostra che circa il 50% delle cellule di milza sono derivate da donatori un giorno dopo il trapianto e circa il 46% è derivato dal ricevente. Sette giorni dopo il trapianto, i leucociti derivati dal donatore rappresentano circa il 32% delle cellule di milza totale, mentre le cellule derivate dal ricevente sono aumentate fino a circa il 53% I leucociti splenici donatori migrati anche nei linfonodi, nel sangue e nel midollo osseo già dal primo giorno e vengono mantenuti ad almeno il settimo giorno generando una Chimera unica preziosa per la ricerca sul traffico di splenociti.L'uso di topi knock-in geneticamente modificati come donatori di milza consentirà di investigare il ruolo dei mediatori derivati dalle cellule di milza o delle principali vie di segnalazione nei processi di malattia. Questo modello potrebbe essere un potente strumento per esplorare i meccanismi delle popolazioni di cellule di milza in risposta a agenti patogeni, lesioni, infiammazioni o rigetto del trapianto.

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Il modello di topo eterotopica trapianto di cuore è stato provato da molti ricercatori ad essere un metodo importante per lo studio dei meccanismi di rifiuto e di risposta immunitaria. Tuttavia, i metodi impiegati sono ancora difficili. Modificando le tecniche standard che abbiamo avuto successo con più di 1000 trapianti.

Il trapianto cardiaco eterotopico nel Mice

Il video dimostra un metodo chirurgico per generare un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata. La cavità addominale di un topo donatore anestetizzato viene aperta chirurgicamente per rimuovere la milza. Vengono identificate la vena cava inferiore e l'aorta infrarenale, i loro rami lombari vengono legati e vengono praticate aperture per il trapianto eterotopico di una milza da un topo donatore congenico. Dopo aver completato l'anastomosi vascolare e ripristinato il...

Un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata

Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino umanizzato duale con un sistema immunitario umano e cellule epatiche. Comporta il trapianto di cellule epatiche umane e cellule staminali e progenitrici ematopoietiche in un topo immunodeficiente transgenico tramite iniezione intrasplenica, portando all'attecchimento delle cellule epatiche e allo sviluppo di cellule immunitarie umane.

Sviluppo di un modello murino umanizzato con cellule epatiche umane e cellule immunitarie

Un preclinico, modello murino di metastasi epatiche effettuato tramite una tecnica di iniezione hemispleen.

Un preclinici Modello murino di metastasi epatiche

Descriviamo un protocollo per l'innesto di interposizione aortica nei topi. L'obiettivo del protocollo è quello di fornire un modello con cui studiare i processi patologici e le strategie terapeutiche rilevanti per le reazioni alloimmuni nelle arterie e le conseguenti modificazioni arteriose che contribuiscono al fallimento del trapianto d'organo.

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

Per studiare l'allotrapianto combinato di organi solidi e composito vascolarizzato, descriviamo un nuovo modello eterotopico di trapianto di parete toracica, timo e cuore nei topi utilizzando una tecnica di cuffia cervicale senza sutura.

A Novel microchirurgica modello per eterotopica, in blocco parete toracica, Timo, e trapianto cardiaco nei topi

Questo nuovo modello per il trapianto degli arti posteriori ortotopico nel topo, applicando una tecnica bracciale non sutura per anastomosi super-microvascolare, fornisce un potente strumento per la ricerca in vivo meccanicistica immunologica relative al allotrapianto composito vascolarizzato (VCA).

Ortotopico degli arti posteriori del trapianto di mouse

I modelli di trapianto cardiaco murino rappresentano preziosi strumenti di ricerca per lo studio dell'immunologia dei trapianti. Il presente protocollo descrive il trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo che prevede il posizionamento di polsini sull'arteria carotide comune del ricevente e sul tronco dell'arteria polmonare del donatore per consentire il flusso sanguigno laminare.

Trapianto cardiaco cervicale eterotopico di topo utilizzando bracciali vascolari

Questo articolo descrive un protocollo per l'aggregazione e l'incapsulamento delle cellule della milza all'interno di una matrice di membrana basale semisolida. I costrutti di matrice di membrana basale possono essere utilizzati in coltura tridimensionale per lo studio dello sviluppo di organoidi o per studi di trapianto e rigenerazione tissutale in vivo .

Aggregazione cellulare incapsulata della matrice della membrana basale per lo studio della formazione del tessuto milza murino

Presentiamo un modello murino riproducibile di allotrapianto composito vascolarizzato eterotopo da arto posteriore a collo. Questo protocollo supermicrochirurgico, che prevede anastomosi vasali da 0,3-0,5 mm, integra la guida del filamento di nylon e la cuffia venosa. Fornisce una piattaforma affidabile per studi traslazionali su tolleranza, lesioni ischemiche-reperfusione e meccanismi immunologici nell'allotrapiante composito vascolarizato.

Trapianto eterotopico da arto posteriore a collo nel topo: un modello supermicrochirurgico di allotrapianto composito vascolarizzato

Questo protocollo presenta una tecnica semplificata di anastomosi per suture end-to-side per il trapianto di cuore cervicale murino, fornendo un modello robusto e riproducibile per lo studio dell'immunologia dei trapianti.

Trapianto cardiaco eterotopico cervicale usando la tecnica dell'anastomosi end-to-side per studiare l'immunologia del trapianto

Scopri il trapianto di milza vascolarizzata nel topo per studiare la biologia delle cellule spleniche e l'immunità ai trapianti. Questo metodo consente di tracciare il destino e la funzione delle cellule nel tempo.

Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e limmunità ai trapianti (Video) | JoVE Journal

Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

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