Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

Questo protocollo di citometria di massa preserva l'integrità dell'intero midollo osseo, consentendo il salvataggio delle informazioni che sono state perse durante la preparazione convenzionale del campione per l'analisi di cellule sotto studio. Questo protocollo di isolamento rapido e senza sforzo del midollo osseo facilita l'acquisizione di popolazioni di cellule mieloidi di breve durata come rari sottoinsiemi di lignaggio neutrofilo. L'uso della citometria di massa per identificare le cellule immunitarie precedentemente apprezzate come le cellule di lignaggio neutrofilo può avere ampie implicazioni per un'ampia varietà di malattie.

Questo protocollo preserva l'integrità delle cellule mieloidi di breve durata presenti nel midollo osseo e può essere facilmente applicato ad altri tipi di tessuto come il tumore solido. Abbiamo semplificato il protocollo per renderlo il più facile possibile, ma poiché in tutti gli studi biologici potrebbe essere necessario un paio di corse pratiche da gestire. Quando lo fai la prima volta, puoi prima preparare tutti i reagenti e poi seguire rigorosamente il protocollo.

In caso di problemi, è possibile connettersi a CyTOForum e parlare con altri utenti CyTOF che possono aiutare a risolvere i problemi. Per la preparazione biologica del campione, semplici trucchi possono fare un'enorme differenza con il risultato finale. Una dimostrazione visiva è molto più facile per un nuovo utente afferrare il protocollo.

Se lo stai facendo per la prima volta, puoi prima preparare i reagenti e quindi seguire rigorosamente il protocollo. Per la raccolta del midollo osseo, mettere un topo C57 nero da sei a 10 settimane nella posizione supina su un cuscinetto chirurgico sterile e utilizzare il 70% di etanolo per sterilizzare l'addome e gli arti posteriori. Utilizzare un paio di forbici chirurgiche sezionanti per aprire la cavità addominale e rimuovere la pelle per esporre gli arti posteriori.

Usando un paio di forcep di medicazione con punta smussata, tenere la tibia del mouse proprio sotto la caviglia e utilizzare un paio di forcep di medicazione curva per stabilizzare la tibia sotto le forcep di medicazione con punta smussata. Utilizzare le forcep di medicazione con punta smussata per rompere la tibia e rimuovere il muscolo per esporre l'osso. Prima di posizionare la tibia in PBS freddo, spostare le forcep curve stabilizzanti sul femore e far scorrere le forcep di medicazione smussate sotto l'articolazione del ginocchio per tenere la rotula.

Tirare delicatamente verso l'alto per dislocare la rotula e rimuovere il muscolo dalla rotula per esporre il femore. Tenere il femore esposto dalle forcep curvo e utilizzare forbici chirurgiche per tagliare il femore dal fondo dell'osso. Quindi posizionare il femore in PBS.

Successivamente, utilizzare un ago calibro 18 per fare un buco in un tubo di micro centrifuga da 0,5 millilitri e posizionare entrambe le ossa nel tubo con le estremità aperte delle ossa rivolte verso il basso nel foro. Posizionare il tubo da 0,5 millilitri in un tubo di micro centrifuga da 1,7 millilitri e ruotare i tubi a doppio strato in una micro centrifuga. Al termine della centrifugazione, confermare che il midollo osseo è stato estratto sul fondo del tubo.

Per macchiare i globuli ossei per la citometria di massa, sospendere di nuovo il midollo osseo in un millilitro di tampone di lysis dei globuli rossi per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet in un millilitro di PBS freddo. Filtrare le celle attraverso un colino di 70 micrometri in un tubo conico da 15 millilitri e lavare le celle con nove millilitri di PBS fresco e freddo.

Sospendere di nuovo il pellet di cellule del midollo osseo in 10 millilitri di PBS fresco e freddo per il conteggio e trasferire un'aliquota di cinque volte 10 alla sesta cella in un nuovo tubo da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere nuovamente le cellule in un millilitro di tampone di colorazione citometrica di massa, integrato con 125 cisplatino nanomolare. Dopo cinque minuti a temperatura ambiente, lavare le cellule in quattro millilitri di tampone di citometria di massa fresca.

Sospendere di nuovo il pellet in 50 microlitri della soluzione di blocco del recettore FC. Dopo 10 minuti a quattro gradi Celsius, aggiungere 50 microlitri del cocktail anticorpale di interesse per le cellule e pipettare delicatamente per mescolare. La temperatura in diversi passaggi di incubazione è molto importante per preservare la vitalità delle cellule del midollo osseo.

Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule due volte in due millilitri di tampone di citometria di massa fresca per lavaggio prima di sospendere le cellule in un millilitro di formaldeide all'1,6% preparata al momento per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e sospendere nuovamente il pellet in un millilitro di tampone fisso perm integrato con soluzione di intercalazione nanomolare 125 per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Prima di analizzare le cellule per citometria di massa, vortice delicatamente e centrifugare la sospensione cellulare prima di lavare le cellule in due millilitri di tampone di colorazione citometrica di massa fresca.

Successivamente, lavare le cellule due volte in un millilitro di acqua distillata per lavaggio, aspirando accuratamente il supernatante dopo il secondo lavaggio prima di sospendere le cellule a una volta da 10 a sesta cellule per millilitro di concentrazione di buffer di citometria di massa per l'analisi della citometria di massa. In questo grafico di incorporamento del vicino stocastico distribuito T, le cellule su più tessuti di topo sono state raggruppate in sottoinsiemi in base alla somiglianza dei loro profili di espressione del marcatore di superficie misurati da un pannello di citometria di massa di 33 parametri. Le celle con proprietà più simili sono state raggruppate automaticamente in base all'espressione di questi marcatori su ogni cella.

Utilizzando questo metodo, l'integrità dell'intero midollo osseo è stata preservata, portando alla scoperta di una popolazione cellulare precedentemente sconosciuta che contemporaneamente coesimi neutrofilo ed ematopoietico staminali e cellule progenitrici firmano marcatori di superficie. Questa popolazione cellulare, che è stata precedentemente omessa negli studi sul progenitore mieloide, a causa dell'esaurimento positivo delle cellule Ly6G, mostra un modello distinto di espressione marcatore di superficie. Ancora più importante, questi dati hanno portato alla scoperta di un piccolo sottoinsieme dell'ammasso di cellule positive Ly6G che non esprime Ly6G, ma è stato raggruppato strettamente con le cellule positive Ly6G positive cd117, suggerendo la somiglianza di queste cellule con il lignaggio neutrofilo basato sull'espressione dei 33 marcatori di superficie utilizzati in questo esperimento di citometria di massa.

È stato quindi possibile costruire un pannello di smistamento delle celle attivato a 13 colori, consentendo l'isolamento dei progenitori neutrofili mediante citometria a flusso per saggi funzionali a valle. È importante eseguire la procedura di isolamento del midollo osseo il più rapidamente possibile e mantenere le cellule a quattro gradi Celsius durante la procedura di colorazione.