Name: Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri il saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da Poxvirus. Questo metodo permette di analizzare gli effetti degli elementi cis dell'mRNA.

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Il progetto è stato finanziato dagli istituti nazionali di sanità (AI128406 www.nih.gov) a ZY e in parte dal Johnson Cancer Research Center (http://cancer.k-state.edu) sotto forma di Graduate Student Summer stipend alla PD.

1. preparazione del DNA template per PCR per trascrizione in vitro
<ol><li>Per preparare il modello di DNA da PCR, primer di progettazione. Quando si progetta primer considerare caratteristiche cruciali come lunghezza del primer, temperatura di ricottura (Tm), contenuto di GC, 3' fine con G o C ecc. Nota: Discusso in dettaglio in questa letteratura25,26,27.</li>
	<li>I primer di progettazione per generare la PCR amplicon contenente i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7-promoter, poli (A) leader, lucciola luciferasi ORF e una coda Poly (A) di cui qui di seguito come T7_12A-Fluc. Primer di progettazione (avanti e indietro) per includere tutti gli elementi aggiuntivi non presenti nel DNA del modello (Figura 2a). Nota: La sequenza di tutti gli elementi è reperibile nella tabella 1.
</li>
	<li>Includere diversi nucleotidi in avanti primer (5'-3')28, seguita da T7-promoter, poli (A) leader o desiderato 5'-UTR sequenza e circa 20 nucleotidi, regolare sulla base di Tm, corrispondente alla 5' fine del gene reporter Orf. Assicurarsi che la regione corrispondente nel primer sia identica alla ciocca di senso (+ filamento) del gene. Nota: Per Long 5'-UTR, sintetizzare due frammenti di DNA: uno con il promotore T7 seguito da Long 5'-UTR e secondo con ORF del gene reporter. Unire questi due frammenti utilizzando l'estensione di sovrapposizione PCR29.</li>
	<li>Progettare Reverse Primer (5'-3') per includere poli (A) coda e circa 20 nucleotidi, regolare sulla base di Tm, corrispondente alla 3' fine dell'ORF del gene reporter. Assicurarsi che la regione corrispondente nel primer è identica al filo anti-senso (-Strand) del gene e un codone di arresto in-frame è presente prima della coda Poly (A). Nota: La lunghezza desiderata di a in un leader Poly (A) o Poly (A) coda può essere personalizzato nei primer. Ad esempio, per aggiungere 50 a nella coda Poly (A), il primer inverso dovrebbe comportare 50 T. Analogamente, per aggiungere 20 a nel leader Poly (A), il primer in avanti dovrebbe comportare 20 A.</li>
	<li>Per il controllo interno, progettare un altro set di primer contenenti i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7 promoter, una sequenza di codifica casuale 5'-UTR contenente la sequenza di Kozak, Renilla luciferasi ORF e Poly (a) coda di cui qui di seguito come T7_ Kozak-Rluc.</li>
	<li>In un tubo PCR, aggiungere i reagenti nel seguente ordine: acqua libera DNase, 2x polimerasi di DNA ad alta fedeltà, primer e DNA modello luciferasi confermata dalla sequenza (tabella 2). Nota: Le quantità di singoli componenti nella miscela devono essere regolate in base al volume di reazione.</li>
	<li>Utilizzare un ciclo di PCR standard a 3 fasi (denaturazione, ricottura, estensione) per generare un modello di DNA come mostrato nella tabella 3. Nota: La temperatura di ricottura X ° c dipende dal set di primer utilizzato e il tempo di estensione T min dipende dalla dimensione della PCR amplicon e dalla DNA polimerasi utilizzata.</li>
	<li>Rilevare il prodotto PCR eseguendo 5-10% di reazione PCR in 1% di elettroforesi di gel di agarosio tris-acetato-EDTA (TAE) (contenente 0,1 μg/ml di etidium bromuro) insieme allo standard di peso molecolare disponibile in commercio. Visualizzare il gel sotto un illuminatore UV per determinare le dimensioni del prodotto PCR.</li>
	<li>Dopo aver determinato la dimensione corretta del prodotto PCR, ~ 1,7 KB per T7_12A-Fluc e ~ 1,0 KB per T7_Kozak-Rluc, purificarlo utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio. Elute il DNA utilizzando 100 μL di acqua libera nucleasi (Figura 2B).</li>
	<li>Una volta purificata, controllare la concentrazione del DNA utilizzando uno spettrofotometro e determinare il A260/A280 rapporto (~ 1.8-2.0 è accettabile).</li>
	<li>Conservare il DNA purificato a-20 ° c o utilizzare immediatamente la trascrizione in vitro.</li>
</ol>2. generare mRNA mediante trascrizione in vitro
<ol><li>
Sintetizzare RNA dal prodotto PCR in vitro, utilizzando un kit di trascrizione in vitro (Figura 3A). Nota: i modelli di DNA T7_12A-Fluc e T7_Kozak-rluc sono utilizzati per sintetizzare mRNA 12A-Fluc e Kozak-rluc, rispettivamente.<ol>
<li>Per fare questo, prendere un tubo di microcentrifuga e aggiungere i reagenti nel seguente ordine: acqua libera DNase-RNasi, NTP buffer mix, tappo analogico, modello PCR prodotto, T7-RNA polimerasi mix (tabella 4). Nota: Altri sistemi di tappatura possono essere utilizzati anche per limitare l'RNA in sequenza dopo la trascrizione in vitro seguendo le istruzioni del fabbricante.</li>
		<li>Mescolare accuratamente e incubare a 37 ° c per 2 h.</li>
		<li>Procedere alla purificazione dell'RNA sintetizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire RNA purificato in 1,5% gel di agarosio Tris-Borato-EDTA (TBE) (contenente 0,5 μg/mL di etidium bromuro) per controllare l'RNA. Visualizzare il gel sotto un illuminatore UV (Figura 3B).</li>
	<li>Controllare la concentrazione dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro e determinare il rapporto A260/A280 (~ 1.8-2.0 è accettabile).</li>
	<li>Aliquota dell'RNA purificato e conservare a-80 ° c.</li>
</ol>3. transfect mRNA alle cellule
<ol><li>Le cellule di seme di HeLa in una piastra 24-Well (per essere circa ~ 80-90% Confluent giorno successivo) e incubare durante la notte in un incubatore a 37 ° c con 5% CO2.</li>
	<li>Infettare le cellule di HeLa con il virus vaccinia (VACV) a una molteplicità di infezione (MOI) di 5 o mantenere le cellule HeLa non infettate per il confronto. Nota: MOI è il numero di particelle virali infettive per cellula.</li>
	<li>MOI di X = {[(numero di celle * X)/virus Titer] * 1000} μl di virus per mezzo di 1 mL.</li>
	<li>
Dopo l'infezione h post desiderata (HPI) (in questo esperimento a 10-12 HPI), trasfezione mRNA (500 ng di mRNA totale per pozzo di piastre 24 pozzetti) utilizzando un reagente cationico di trasfezione del lipido come mostrato nella Figura 3C.
	<ol>
<li>Per un pozzo di una piastra 24-Well, mescolare 480 NG di 12A sequenza cuscinetto Firefly luciferasi (12A-Fluc) mRNA e 20 ng di Kozak sequenza cuscinetto Renilla luciferasi (Kozak-Rluc) mRNA in un tubo di microcentrifuga. In un'altra provetta per microcentrifuga aggiungere 1,1 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica.</li>
		<li>Aggiungere 55 μL di mezzo sierico ridotto in entrambi i tubi. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Dopo 5 minuti di incubazione, aggiungere 55 μL di reagente di trasfezione lipidica cationica contenente un mezzo sierico ridotto nel tubo contenente mRNA.</li>
		<li>Mescolare delicatamente ma accuratamente e incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Durante l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura cellulare e aggiungere 400 μL di mezzo sierico ridotto per pozzetto di piastre da 24 pozzetti.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 100 μL di miscela a goccia e uniformemente a un pozzo di piastre da 24 pozzetti.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. misura le attività di luciferase
<ol><li>Cinque ore dopo la co-trasfezione di 12a-Fluc e Kozak-rluc mRNA, misurare l'attività di luciferasi utilizzando un sistema di saggio di luciferasi in grado di eseguire due saggi reporter (ad esempio, dual luciferasi reporter Kit saggio).</li>
	<li>Rimuovere il mezzo sierico ridotto e lisare le cellule aggiungendo 150 μL di tampone di lisi 1x, un componente del kit di analisi luciferasi.</li>
	<li>Dopo 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente, raccogliere il lisato scartando le cellule e trasferirla in un tubo di microcentrifuga.</li>
	<li>Centrifugare il lisato a 12.000 x g per 10 min a 4 ° c fino ai detriti delle celle a pellet.</li>
	<li>Aggiungere 30 μL di supernatante in un piatto di saggio 96 ben bianco con pareti opache con fondo solido.</li>
	<li>Misurare la doppia luminescenza utilizzando il kit di analisi luciferasi e un luminometro per lettori di piastre multimodali.</li>
	<li>Eseguire la misurazione utilizzando la funzione cinetica (su base per-well) utilizzando le impostazioni descritte nella tabella 5. Nota: La lettura può essere presa anche con il luminometro manuale. Aggiungere un volume uguale di lisato e substrato per Fluc in una cuvetta. Attendere 2 s e misurare per 10 s con luminometro. Dopo la misurazione Fluc, estrarre rapidamente la cuvetta dal luminometro e aggiungere un volume uguale del substrato per Rluc manualmente. Ancora una volta, attendere 2 s e misurare per 10 s utilizzando luminometro.</li>
	<li>Esporta i dati di lettura luminescenza in un formato di file desiderabile.</li>
	<li>Determinare il tasso di traduzione relativa da 12A-Fluc mRNA nelle cellule HeLa infettate e VACV dividendo il valore Fluc per controllo interno Rluc valore. Nota: Figura 1 complementare Mostra l'analisi passo-passo dei dati grezzi per ottenere attività Fluc relativa.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori vorrebbero dichiarare nessun interesse finanziario concorrente.

Tutti i passaggi a quattro core sono fondamentali per il successo del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Particolare attenzione deve essere prestata alla progettazione del primer, in particolare per la sequenza di promoter T7. T7 RNA polimerasi inizia la trascrizione dal primo G sottolineato (ggg-5'-UTR-Aug-) in T7 promoter aggiunto prima della sequenza 5'-UTR. Sebbene il sito iniziale di trascrizione (TSS) inizi dal primo G all'estremità 5', diminuendo il numero di G inferiore a tre ...

Secondo il dogma centrale, le informazioni genetiche fluiscono dal DNA all'RNA e poi infine alla proteina1,2. Questo flusso di informazioni genetiche è altamente regolamentato a molti livelli, tra cui la traduzione di mRNA3,4. Lo sviluppo di saggi reporter per misurare la regolazione dell'espressione genica faciliterà la comprensione dei meccanismi normativi coinvolti in questo processo. Qui descriviamo un protocollo per studiare la traduzione di mRNA utilizzando un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro in cellule affette da Poxvirus.
I poxvirus comprendono molti patogeni umani e animali altamente pericolosi5. Come tutti gli altri virus, i poxvirus si basano esclusivamente su macchine a cellule ospitanti per la sintesi proteica6,7,8. Per sintetizzare efficacemente le proteine virali, i virus hanno sviluppato molte strategie per dirottare la macchina traslazionale cellulare per reindirizzare la traduzione di mRNAs virale7,8. Un meccanismo comunemente impiegato da virus è quello di utilizzare elementi di azione CISnelle loro trascrizioni. Esempi degni di nota includono il sito di ingresso ribosoma interno (IRES) e il potenziatore di traduzione indipendente da Cap (Cite)9,10,11. Questi elementi CISrendono le trascrizioni virali un vantaggio traslazionale attirando macchinari traslazionali attraverso diversi meccanismi12,13,14. Oltre 100 mRNA di poxvirus hanno un elemento di azione CISevolutivamente conservato nella regione 5'-non tradotta (5'-UTR): un 5'-poli (a) leader alle 5' estremità di questi mRNAs15,16. Le lunghezze di questi 5' poli (A) leader sono eterogenei e sono generati dallo slittamento della polimerasi RNA codificata da Poxvirus durante la trascrizione17,18. Noi, e altri, recentemente abbiamo scoperto che il 5' poli (a) leader conferisce un vantaggio di traduzione a un mRNA in cellule infettate con virus vaccinia (VACV), il prototipo membro di poxvirus19,20.
Il saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro è stato inizialmente sviluppato per comprendere il ruolo del leader 5' poli (a) nella traduzione di mRNA durante l'infezione da Poxvirus19,21. Anche se i saggi del reporter di luciferasi basati sul DNA plasmide sono stati ampiamente utilizzati, ci sono diversi inconvenienti che complicheranno l'interpretazione dei risultati nelle cellule infettate da Poxvirus. In primo luogo, i plasmidi sono in grado di replicare in cellule infettate da VACV22. In secondo luogo, la trascrizione criptica si verifica spesso da plasmide DNA18,23,24. In terzo luogo, la trascrizione basata sul promotore VACV genera poli (A)-leader di lunghezze eterogenee, rendendo quindi difficile controllare la lunghezza del leader Poly (A) in alcuni esperimenti18. Un saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritta in vitro aggira questi problemi e l'interpretazione dei dati è semplice.
Ci sono quattro passaggi chiave in questo metodo: (1) reazione a catena della polimerasi (PCR) per generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; 2) trascrizione in vitro per generare mRNA; 3) trasfezione per consegnare l'mRNA nelle cellule; e (4) rilevazione dell'attività di luciferasi come indicatore della traduzione (Figura 1). Il risultante amplicon PCR contiene i seguenti elementi in 5' a 3' direzione: T7-promoter, poli (A) leader o desiderato 5'-UTR sequenza, lucciola luciferasi aperta cornice di lettura (ORF) seguita da una Poly (A) coda. La PCR amplicon è utilizzata come modello per sintetizzare mRNA mediante trascrizione in vitro utilizzando la T7 polimerasi. Durante la trascrizione in vitro, m7G CAP o altro tappo analogico è incorporato in mRNA recentemente sintetizzato. Le trascrizioni limitate vengono trasfusate in cellule non infette o infette da VACV. Il lisato cellulare viene raccolto al momento desiderato dopo la trasfezione per misurare le attività di luciferasi che indicano la produzione di proteine da mRNA trasfected. Questo saggio reporter può essere utilizzato per studiare il regolamento di traduzione da CIS-element presente in 5'-UTR, 3'-UTR o altre regioni di un mRNA. Inoltre, il saggio in vitro trascritto a base di RNA può essere utilizzato per studiare diversi meccanismi di iniziazione alla traduzione, tra cui l'iniziazione dipendente dalla PAC, l'iniziazione indipendente dal tappo, la riiniziazione e l'iniziazione interna come IRES.

<table><tbody><tr><td>2X-Q5 Master mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492</td> DNA <td>polimerasi ad alta fedeltà utilizzata in PCR</td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411L</td><td>Anti reverse Cap analog o ARCA</td></tr><tr><td>Corning 96 pozzetti Micropiastra in polistirene a fondo piatto bianca a mezza area</td><td>Corning</td><td>3693</td><td>Piastra bianca a 96 pozzetti a parete opaca con fondo solido</td></tr><tr><td>Sistema di analisi reporter a doppia luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>Kit di analisi a doppia luciferasi (DLAK)</td></tr><tr><td>Kit puro per ciclo E.Z.N.A. Kit</td> di <td>purificazione PCR</td><td>OMEGA BIO-TEK</td><td>D6492</td></tr><tr><td>Luminometro per micropiastre GloMax Navigator</td><td>Promega</td><td>GM2010</td><td>Indicato come luminometro lettore di piastre multimodale</td></tr><tr><td>HiScribe T7 Kit di sintesi rapida dell'RNA ad alto rendimento</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td>In Kit di trascrizione in vitro</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td>Reagente cationico per la trasfezione dei lipidi</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Utilizzato per misurare la concentrazione di DNA e RNA</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Terreni di sieroplastica ridotti</td></tr><tr><td>Purelink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>Kit di purificazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Sistema di tappatura per vaccinia</td> Sistema <td>di tappatura</td> <td>New England Biolabs</td><td>M2080</td></tr></tbody></table>

saggio reporter di luciferase basato su rna trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da poxvirus

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Ogni poxvirus mRNA trascritta dopo la replicazione virale del DNA ha un leader di 5' poli (A) evolutivamente conservato, non-templato nel 5'-UTR. Per dissezionare il ruolo di 5'-poli (a) leader nella traduzione di mRNA durante l'infezione da Poxvirus abbiamo sviluppato un saggio reporter luciferasi basato su RNA trascritto in vitro. Questo saggio reporter comprende quattro fasi principali: (1) PCR per amplificare il modello di DNA per la trascrizione in vitro; (2) trascrizione in vitro per generare mRNA utilizzando T7 RNA polimerasi; (3) trasfezione per introdurre mRNA trascritto in vitro in cellule; (4) rilevazione dell'attività di luciferasi come indicatore della traduzione. Il saggio reporter a base di RNA luciferasi descritto qui aggira i problemi della replicazione plasmide nelle cellule infettate da poxvirus e nella trascrizione criptica dal plasmide. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elements in un mRNA comprendente 5'-UTR e 3'-UTR in sistemi diversi dalle cellule infettate da Poxvirus. Inoltre, è possibile studiare diverse modalità di iniziazione alla traduzione come il CAP-dipendente, il CAP-Independent, la riiniziazione e l'iniziazione interna utilizzando questo metodo.

I quattro passaggi del saggio reporter di luciferasi basato su RNA trascritto in vitro: PCR per generare il modello di DNA per la trascrizione in vitro, la trascrizione in vitro per generare mRNA, la trasfezione di mRNA e la misurazione della luciferasi, possono essere osservate nel diagramma schematico ( Figura 1). La progettazione di primer per entrambi i modelli di DNA (Fluc e Rluc) e lo schema generale di estensione di sbalzo PCR è illustrata nello schema...

Presentiamo un protocollo per studiare la regolazione della traduzione di mRNA nelle cellule infettate da Poxvirus usando il saggio reporter di luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro. Il saggio può essere utilizzato per studiare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elementi di un mRNA, tra cui 5'-non tradotto regione (UTR) e 3'-UTR. Diverse modalità di avvio della traduzione possono anche essere esaminate utilizzando questo metodo.

Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

Il nostro protocollo per un saggio di luciferasi trascritto in vitro a base di RNA aiuta a studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate dal virus del vaiolo. Inoltre, una lunghezza personalizzata del litro Poly(A) consente di studiarne gli effetti normativi sulla traduzione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio della regolazione della traduzione da parte di elementi Cis come 5'UTR e 3'UTR in mRNA e un ampio spettro di iniziazione alla traduzione.Il saggio del reporter luciferasi trascritto in vitro a base di RNA può essere adattato per incorporare modifiche al tappo e altre modifiche e utilizzato per testare l'effetto sulla traduzione. Per iniziare, progettare primer avanti e indietro per generare l'amplicon PCR contenente i seguenti elementi in direzione da 5'a 3:T7-Promoter, Poly(A)litro, Firefly Luciferase ORF in una coda Poly(A)denominata T7_12A-Fluc, includono diversi nucleotidi extra nel primer in avanti seguiti da T7-Promoter Poly(A)litro o sequenza 5'UTR desiderata e circa 20 nucleotidi corrispondenti alla fine 5 dell'ORF del gene reporter. Regolare la lunghezza del primer in base alla temperatura di fusione corrispondente all'estremità 5 dell'ORF del gene reporter assicurando che la regione corrispondente nel primer sia identica al filamento di senso del gene.Quindi progettare primer inverso per includere la coda Poly(A) e circa 20 nucleotidi. Regolare in base alla temperatura di fusione corrispondente al 3'end dell'ORF del gene reporter assicurando che la regione corrispondente del primer sia identica al filamento di antisense del gene e che un codone di arresto in-frame sia presente prima della coda Poly(A).. Per il controllo interno, progettare un altro insieme di primer contenenti i seguenti elementi in direzione da 5'a 3:T7-Promoter, una sequenza casuale di codifica 5'UTR contenente la sequenza Kozak, renilla luciferasi ORF e coda Poly(A),denominata T7_Kozak-Rluc.Per impostare la reazione, aggiungere reagenti nel seguente ordine a un tubo PCR:Acqua libera DNasi, DNA polimerasi ad alta fedeltà 2X, primer e DNA modello luciferasi confermato sequenza. Dopo un ciclo PCR standard in tre tempi per generare un modello di DNA, rilevare il prodotto PCR eseguendo il 5-10% della reazione PCR in un'elettroforesi del gel TAE 1%agarose insieme a uno standard di peso molecolare. Per determinare le dimensioni del prodotto PCR, visualizzare il gel sotto un illuminatore UV.Dopo aver determinato la corretta dimensione del prodotto PCR, purificarlo utilizzando un kit di purificazione PCR disponibile in commercio utilizzando 100 microlitri di acqua priva di nucleasi per elusare il DNA. Controllare la concentrazione del DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro e conservarlo a meno 20 gradi Celsius per utilizzarlo immediatamente per la trascrizione in vitro. Per sintetizzare l'RNA dal prodotto PCR, aggiungere i seguenti reagenti a un tubo di microcentrifugo:Acqua libera DNasi-RNasi, miscela tampone NTP, analogico del tappo, modello di prodotto PCR e mix di polimerasi T7-RNA dal kit di trascrizione in vitro.Mescolare accuratamente. Incubare a 37 gradi Celsius per due ore e quindi procedere alla purificazione dell'RNA sintetizzato utilizzando un kit di purificazione dell'RNA. Per controllare l'RNA purificato, riscaldare l'RNA a 70 gradi per cinque minuti per rimuovere la struttura secondaria ed eseguito su gel TBE di 1,5 agarosio.Quindi visualizzare il gel sotto un illuminatore UV. Controllare la concentrazione dell'RNA purificato utilizzando uno spettrofotometro. Aliquota e conservare a meno 80 gradi Celsius.Semina le cellule HeLa in una piastra di 24 potte per ottenere l'80-90% di confluenza il giorno seguente e incubare durante la notte in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica. Infettare le cellule HeLa con il virus Vaccinia a una molteplicità di infezione di cinque e mantenere le cellule HeLa non infette per il confronto. Quindi incubare la piastra a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica per 10-12 ore.Dopo le ore desiderate dopo l'infezione, mescolare 480 nanogrammi di sequenza 12A con mRNA Firefly Luciferase e 20 nanogrammi di sequenza Kozak con mRNA Renilla Luciferase in un tubo di microcentrifugo. In un altro tubo di microcentrifugo aggiungere 1,1 microlitri di reagente di trasfezione lipidica cationica. Aggiungere 55 microlitri di mezzi sieri ridotti a entrambi i tubi, mescolare e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.Quindi aggiungere 55 microlitri reagente di trasfezione lipidica cationica contenente mezzi sieri ridotti al tubo contenente mRNA. Mescolare delicatamente ma accuratamente con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Durante l'incubazione, rimuovere il mezzo di coltura cellulare dalle cellule e aggiungere 400 microlitri di mezzo siero ridotto per pozzo.Al termine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri della miscela cadere saggiamente e uniformemente per pozzo della piastra del pozzo 24. Cinque ore dopo la co-trasfezione con 12A Fluc e Kozak Rluc mRNA, rimuovere il mezzo siero ridotto dalle cellule e lesinare le cellule aggiungendo 150 microlitri 1X lysis buffer dal kit di dosaggio Luciferasi in grado di eseguire due test reporter. Dopo aver incubato per 10 minuti a temperatura ambiente, raschiare le cellule usando gomma e siringa sterile e trasferirli in un tubo di microcentrifugo.Per pellettare i detriti cellulari, centrifugare il lysate a 12.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 30 microlitri di supernatante per pozzo di una piastra di dosaggio bianca da 96 pareti opache con fondo solido. Utilizzare il kit di saggi Luciferasi e un luminometro a lettore di lastre multimo mode per misurare la doppia luminescenza usando la funzione cinetica come descritto nel manoscritto.Dopo aver esportato i dati di lettura della luminescenza in un formato di file desiderabile, determinare la velocità di traslazione relativa da 12A Fluc mRNA in celle HeLA non infette e infettate da VACV dividendo il valore Fluc per il valore Rluc di controllo interno. Questo saggio è stato utilizzato per testare l'efficienza di traslazione di un mRNA Fluc che contiene un litro 5'Poly(A)in cellule non infette e infettate da VACV. Sia le cellule non infette che le cellule infette da VACV sono state co-trasfette con successo con l'mRNA Fluc e Rluc.Dividendo Fluc per Rluc normalizzato l'efficienza di trasfezione nella stabilità dell'RNA nelle cellule. 5'Poly(A)litro contenente mRNA ha un vantaggio traslatore durante l'infezione da VACV rispetto alle cellule non infette. Ciò non era dovuto all'efficienza differenziale della trasfezione o alla stabilità dell'mRNA in quanto il livello di RNA era simile nelle cellule infette da VACV cinque ore dopo la trasfezione dell'mRNA.Prestare particolare attenzione quando si progettano primer in quanto ciò può influire non solo sull'efficienza di reazione pcr, ma anche su tutti i processi a valle che richiedono il DNA amplificato. Questo metodo è un saggio importante per testare rapidamente la regolazione della traduzione da parte degli elementi Cis. Se possibile, questo metodo dovrebbe essere confermato da altri esperimenti complementari.Durante l'uso del virus Vaccinia devono essere prese precauzioni ed evitare l'esposizione a sostanze chimiche come il bromuro di etidio e il fenolo.

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Immunologia e Infezioni

Questo metodo descrive la sintesi in vitro ad alto rendimento di RNA messaggero sia con cap che senza cap, a partire da un plasmide linearizzato contenente il gene della luciferasi da Gaussia (GLuc). L'RNA viene purificato e una frazione dell'RNA senza cap viene cappata enzimaticamente utilizzando l'enzima di cappatura del virus della Vaccinia. Nell'ultima fase, l'mRNA viene trasfettato in cellule HeLa e i supernatanti delle colture cellulari vengono sottoposti a saggio per l'attività della...

Trascrizione in vitro e tappatura mRNA Luciferase Gaussia Seguito da cellule HeLa Transfection

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

Questo video dimostra un metodo per tracciare le infezioni virali in modelli murini utilizzando una luciferasi ricombinante e un virus dell'influenza A che esprime la proteina ricombinante e la proteina fluorescente. Questo metodo consente studi sia in vivo che ex vivo, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulle dinamiche virali e sugli effetti degli interventi.

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Questo video mostra un test per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus. Le cellule non infette e infettate da virus sono state co-trasfettate con mRNA codificanti per la luciferasi della lucciola (Fluc) e la Renilla luciferasi (Rluc), con l'mRNA di Fluc contenente una sequenza leader 5' Poly(A). Dopo l'aggiunta di substrati bioluminescenti su cellule lisate, misurare il segnale di entrambe le luciferasi per identificare il vantaggio traduzionale dell'mRNA...

Un test reporter sulla luciferasi per studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate da poxvirus

Descriviamo l'utilizzo di un virus vaccinia reporter fluorescente che consente la misurazione in tempo reale di infettività virale e l'espressione genica attraverso l'espressione specifica fase di fluorofori giornalista spettralmente distinti. Abbiamo dettaglio un metodo basato piastra per identificare con precisione la fase in cui la replicazione del virus è influenzato in risposta ad inibizione piccola molecola.

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Abbiamo sviluppato un saggio reporter di biogenesi di microRNA intronico da utilizzare in cellule in vitro con quattro plasmidi: uno con miRNA intronico, uno con il bersaglio, uno per sovraesprimere una proteina regolatrice e uno per Renilla luciferasi. Il miRNA è stato elaborato e potrebbe controllare l'espressione della luciferasi legandosi alla sequenza bersaglio.

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Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus (Video) | JoVE Journal

Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus

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