In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Pragyesh Dhungel; Fernando Cantu; Candy Hernandez; Zhilong Yang

doi:10.3791/59626

Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione ...

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Immunology and Infection

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In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Saggio reporter di luciferase basato su RNA trascritto in vitro per il regolamento di traduzione dello studio nelle cellule infettate da Poxvirus

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08:58 min

May 1, 2019

DOI: 10.3791/59626-v

Pragyesh Dhungel¹, Fernando Cantu¹, Candy Hernandez¹, Zhilong Yang¹

¹Division of Biology,Kansas State University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This protocol outlines a method for studying mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay allows for the examination of translation regulation by cis-elements of mRNA, including both the 5'-untranslated region (UTR) and 3'-UTR.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cell Biology
Virology

Background

Translation regulation is crucial for understanding viral infections.
Poxvirus can manipulate host cell translation mechanisms.
Luciferase assays are widely used for studying gene expression.
Cis-elements in mRNA play significant roles in translation initiation.

Purpose of Study

To develop a reliable assay for studying translation regulation in poxvirus-infected cells.
To investigate the effects of mRNA cis-elements on translation.
To explore different translation initiation modes.

Methods Used

Design of forward and reverse primers for PCR amplicon generation.
Incorporation of T7-promoter and Poly(A)liter in the assay.
Use of Firefly Luciferase as a reporter gene.
Modification of cap and other elements to study their effects on translation.

Main Results

The assay successfully measures translation regulation in infected cells.
Different lengths of Poly(A)liter affect translation outcomes.
5'UTR and 3'UTR elements significantly influence translation initiation.
Customization of the assay allows for tailored experimental conditions.

Conclusions

This protocol provides a valuable tool for studying viral translation mechanisms.
Understanding translation regulation can inform therapeutic strategies.
The assay can be adapted for various experimental needs.

Frequently Asked Questions

What is the main advantage of this luciferase assay?

The main advantage is its ability to study translation regulation by cis-elements in mRNA.

How can the assay be customized?

The assay can be tailored by modifying the cap and other elements to test their effects on translation.

What are cis-elements?

Cis-elements are sequences in mRNA that regulate translation, such as the 5'UTR and 3'UTR.

What is the role of the Poly(A)liter in the assay?

The Poly(A)liter can be customized to study its regulatory effects on translation.

What type of cells are used in this study?

The study focuses on poxvirus-infected cells.

What is the significance of translation initiation modes?

Different initiation modes can affect how efficiently proteins are produced from mRNA.

Presentiamo un protocollo per studiare la regolazione della traduzione di mRNA nelle cellule infettate da Poxvirus usando il saggio reporter di luciferasi basato sull'RNA trascritto in vitro. Il saggio può essere utilizzato per studiare la regolazione della traduzione da parte di CIS-elementi di un mRNA, tra cui 5'-non tradotto regione (UTR) e 3'-UTR. Diverse modalità di avvio della traduzione possono anche essere esaminate utilizzando questo metodo.

Il nostro protocollo per un saggio di luciferasi trascritto in vitro a base di RNA aiuta a studiare la regolazione della traduzione nelle cellule infettate dal virus del vaiolo. Inoltre, una lunghezza personalizzata del litro Poly(A) consente di studiarne gli effetti normativi sulla traduzione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente lo studio della regolazione della traduzione da parte di elementi Cis come 5'UTR e 3'UTR in mRNA e un ampio spettro di iniziazione alla traduzione.

Il saggio del reporter luciferasi trascritto in vitro a base di RNA può essere adattato per incorporare modifiche al tappo e altre modifiche e utilizzato per testare l'effetto sulla traduzione. Per iniziare, progettare primer avanti e indietro per generare l'amplicon PCR contenente i seguenti elementi in direzione da 5'a 3:T7-Promoter, Poly(A)litro, Firefly Luciferase ORF in una coda Poly(A)denominata T7_12A-Fluc, includono diversi nucleotidi extra nel primer in avanti seguiti da T7-Promoter Poly(A)litro o sequenza 5'UTR desiderata e circa 20 nucleotidi corrispondenti alla fine 5 dell'ORF del gene reporter. Regolare la lunghezza del primer in base alla temperatura di fusione corrispondente all'estremità 5 dell'ORF del gene reporter assicurando che la regione corrispondente nel primer sia identica al filamento di senso del gene.

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