Un protocollo in vitro per la valutazione dei livelli, delle funzioni e dei geni target associati nelle cellule tumorali

Per accedere alle interazioni target di microRNA neurali con le funzioni microRNA è fondamentale capire come i MicroRNA regolano vari processi biologici sia in stati sani che masi. Questo protocollo descrive la riproduzione attraverso la strategia per identificare gli obiettivi di microRNA e i microRNA funzionali poiché la convalida dell'obiettivo diretto dei microRNA è impegnativa. Il nostro protocollo può fornire approfondimenti sulla funzione dei singoli microRNA e sull'implicazione di un microRNA nella terapia del cancro.

Il calcolo della concentrazione inibitoria semi-massima è un metodo importante, non solo per gli studi sui microRNA ma per la valutazione efficace di altri farmaci antitumorali. Il nostro protocollo sarà utile ai nuovi ricercatori poiché abbiamo descritto il metodo fondamentale per comprendere il livello di microRNA in una cellula. Per iniziare il protocollo, contare le celle con il contatore delle celle.

Placcare le celle in una piastra di 96 po '. Il giorno dopo, preparare una serie di miscele di trasfezione per trasfetto le cellule in diverse concentrazioni finali di mimica di controllo del microRNA e imitazione del microRNA-107. Da uno stock di 25 microrna di controllo micromolare imitare, o microRNA-107 imitare, diluire e aggiungere mimica di controllo o microRNA-107 imitare nei mezzi sieri ridotti insieme al reagente di trasfezione nei tubi a microcentrifugo.

Mescolare delicatamente le miscele contenenti oligo utilizzando una micropipetta. Dopo un'incubazione di 10 minuti nella cappa di coltura cellulare, mescolare delicatamente nuovamente le miscele contenenti oligo, quindi aggiungere 50 microlitri delle miscele in ogni pozzo. Mantenere le cellule trasfette in un incubatore di coltura cellulare.

Aspirare con cura il supporto di coltura cellulare in ogni pozzo della piastra e riempire prontamente 100 microlitri di acido tricloroacetico al 10%, o TCA, in ogni pozzo. Mantenere la piastra contenente 10%TCA a quattro gradi Celsius per un'ora. Quindi, lavare il piatto più volte immergendolo in una vasca con acqua del rubinetto.

Rimuovere l'acqua in eccesso dall'interno dei pozzi toccando la piastra fino a quando non rimane acqua e asciugare la piastra. Pipetta 50 microlitri di soluzione SRB 0,4% in ogni pozzo compresi i pozzi vuoti. Agitare delicatamente la piastra fino a quando la soluzione SRB dello 0,4% copre uniformemente il fondo dei pozzali.

Quindi, incubare il piatto per 40-60 minuti. Dopo l'incubazione, lavare la piastra con acido acetico all'1% fino a quando il colorante non legato non viene completamente lavato via. Pipetta 100 microlitri di soluzione di base Tris da 10 millimolare nei pozzi corrispondenti, compresi i pozzi vuoti.

Tenere il piatto su uno shaker per 10 minuti. Misurare l'assorbanza a 492 nanometri. Calcolare la percentuale di assorbanza media e la deviazione standard di ciascun gruppo utilizzando i valori di assorbanza del saggio SRB.

Importare i dati grezzi, incluse le concentrazioni di trattamento, l'assorbanza media e la deviazione standard nel software allineando verticalmente i dati. Fare clic sulla scheda Crea grafico e scegliere le barre di errore a dispersione semplice. Selezionare le colonne del foglio di lavoro come valori Symbol e fare clic su Avanti.

Nel pannello Formato dati, selezionate coppie X-Y e fate clic su Avanti. Selezionate le colonne di dati corrispondenti nel pannello Seleziona dati. Fate clic su Fine (Finish) per creare il plottaggio.

Fate doppio clic sull'asse X per modificare il tipo di scala nel ridimensionamento dell'asse. Modificare il tipo di scala da lineare a log. Modificare il numero dell'intervallo iniziale e finale rispettivamente in 0,01 e 200.

Fate clic con il pulsante destro del mouse su qualsiasi grafico a dispersione, scegliete Adatta curva (Curve Fit) e andate alla sottocategoria Definito dall'utente. Selezionare la curva di risposta alla dose. Fare clic sui pulsanti successivi e quindi su Fine.

Passare alla scheda report e quindi controllare i valori n, k e R. Eseguire la PCR come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi passare alla doppia digestione combinando le miscele di reazione, compresi gli enzimi di restrizione Exo1 e Not1 uno in un tubo.

Incubare le miscele per tre o quattro ore in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius. Eseguire i prodotti a doppia digestione con un gel di agarosio all'1%. Quindi tagliare le bande sotto la luce UV.

Purificare i prodotti PCR a doppia digestione e i vettori luciferasi dalle bande accisa. Continuare con la legatura dei prodotti PCR nei vettori luciferasi preparando 20 microlitri di miscele di reazione di legatura tra cui la ligasi del DNA. Centrifugare brevemente il tubo per 10-15 secondi.

Incubare la legatura a 16 gradi Celsius durante la notte utilizzando un ciclore termico. Il giorno successivo, eseguire la trasformazione aggiungendo le miscele di legatura nel tubo contenente cellule competenti. Toccare delicatamente il tubo e tenerlo sul ghiaccio per 20 minuti.

Trasferire rapidamente e delicatamente il tubo in un blocco di calore a 42 gradi Celsius per 30 secondi a un minuto. Dopo lo shock termico, posizionare il tubo sul ghiaccio per 20 minuti. Stendere le cellule competenti su una piastra di agar LB.

Far crescere cellule competenti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, scegli una singola colonia e resuspend E.coli in uno dei tubi a 8 strisce contenenti acqua ultrapura, e ripeti questo passaggio per rimescolare E.coli da quattro a otto colonie selezionate casualmente. Trasferire 25 microlitri di sospensione E.coli in un altro set di tubi a 8 strisce.

Eseguire la PCR colonia utilizzando la sospensione E.coli. Preparare il saggio luciferasi in una piastra da 24 pozza. Aggiungere da una a due per dieci alle quattro cellule in un supporto di coltura cellulare da 500 microliter per ogni pozzo.

Dopo l'incubazione durante la notte, trasfetto 50 nanogrammi di vettori luciferasi nelle cellule con mimica di controllo o uno specifico microRNA imita usando un reagente di trasfezione. Il giorno successivo, lavare due volte l'interno dei pozzi usando soluzione salina tamponata con fosfato. Applicare 200 microlitri di reagente dilisi nei pozzi ed eseguire sufficientemente la llisi cellulare prima di misurare l'attività della luciferasi.

Mantenere la piastra tremante per almeno 15 minuti. Trasferire da cinque a 10 microlitri di lysate cellulare nel nuovo tubo e aggiungere 100 microlitri di reagente e mescolare immediatamente la soluzione mediante pipettazione. Quindi leggere l'attività della luciferasi lucciola usando l'illuminometro per 10-15 secondi.

Aggiungere 100 microlitri di reagente due nello stesso tubo e quindi mescolare tubazione due volte. Infine, leggere l'attività della renilla luciferasi per 10-15 secondi usando l'illuminometro. RTPCR mostra una significativa riduzione delle cellule microRNA-107 e PANC-1 e CAPAN-1 rispetto alle cellule HPNE.

I livelli di microRNA-301 sono stati significativamente aumentati nelle cellule PANC-1 e CAPAN-1, rispetto alle cellule HPNE. Il saggio SRB in questo studio dimostra chiaramente che la proliferazione delle cellule PANC-1 è diminuita a seguito di una trasfezione mimetica microRNA-107. Lo screening di 11 potenziali bersagli previsti di microRNA-107 mostra chiaramente che solo la gamma di sinucline, o SNCG, un regolatore positivo della crescita delle cellule tumorali interagisce direttamente con le cellule microRNA-107 e PANC-1, indicando che il microRNA-107 può regolare negativamente la proliferazione delle cellule PANC-1 modulando l'espressione SNCG.

I test di proliferazione delle cellule adulte che utilizzano l'entità basata sul tetra idroleum e il CFSE sono applicabili per schermare l'effetto di come imitazioni di microRNA, a seconda dei tipi di cellule. Sulla base della funzione convalidata sperimentalmente dei microRNA, è necessaria una revisione sistematica del database e del programma di previsione del target per restringere l'elenco degli obiettivi candidati prima dei test luciferasi. Per la valutazione dell'efficienza combinata dei microRNA con farmaci antitumorali, è vantaggioso calcolare valori IC rettificati in base al nostro protocollo per la valutazione dell'indice combinato.