Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella
13 maggio 2019
Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella; tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.
Questa tecnica consente una quantificazione accurata e precisa dei microrganismi provenienti da una popolazione mista di ceppi altamente simili utilizzando tecniche molecolari rapide e ad alta produttività. In definitiva, nel consentire confronti di fitness tra ceppi. La capacità di valutare contemporaneamente molti ceppi in un unico pool riduce sostanzialmente la variabilità da pozzo a bene o da organismo a organismo perché tutti i ceppi sono esposti esattamente alle stesse condizioni.
L'adattabilità di questa tecnica consente di utilizzare quasi tutti gli organismi geneticamente malleabili e quasi tutti i progetti sperimentali che richiedono un'accurata quantificazione dei microbi. Inizia questa procedura con l'ingegneria di marcatori genetici sui cromosomi batterici, come descritto nel protocollo di testo. Crea un pool di DNA genomico che contenga ogni codice a barre tranne uno.
Utilizzare questo pool come diluente per eseguire una serie di diluizioni con DNA genomico contenente il singolo codice a barre rimanente. Preparare le reazioni per la PCR digitale in duplice copia secondo le raccomandazioni del produttore per l'utilizzo di un supermix PCR digitale progettato per la chimica basata su sonda. Usa il DNA genomico in comune come DNA modello.
Inoltre, aggiungere il master mix di sonda primer 20 X come descritto nel protocollo di testo. Preparare reazioni di controllo replicate per la PCR digitale in base alle raccomandazioni del produttore. Le reazioni di controllo per ogni combinazione di probe devono essere costituite da nessun controllo modello, controlli negativi e controlli positivi.
Ripetere questi passaggi per creare reazioni PCR digitali per ogni campione di DNA genomico codificato a barre. Genera goccioline per ogni condizione di reazione utilizzando un generatore di goccioline, secondo le istruzioni del produttore. Trasferire le goccioline appena create nell'appropriata piastra da 96 pozzi.
Utilizzare punte di pipetta da 200 microliter su una pipetta multicanale da 5 a 50 microliter. Dopo che tutte le goccioline sono state generate e trasferite, sigillare la piastra con un sigillare a piastre di lamina. Utilizzare il ciclore termico consigliato dal produttore per eseguire le condizioni di ciclo.
Durante l'esecuzione del termociclismo, programmare il software di analisi dei dati con le informazioni di configurazione della piastra, ad esempio il nome del campione, il tipo di esperimento e il Supermix utilizzato. Includere anche il nome target 1 e il tipo Target 1, nonché il nome target 2 e il tipo Target 2. Al termine della termociclina, trasferire le reazioni completate al lettore di goccioline e avviare il processo di lettura, secondo le istruzioni del produttore.
Una volta letti tutti i pozzi e completata l'esecuzione, aprire il file di dati QLP utilizzando il software di analisi dei dati. Selezionare tutti i pozzi che utilizzano la stessa sonda primer Mastermix. Nella scheda Goccioline esaminare il numero di goccioline analizzate in ogni pozzo, incluse le goccioline positive e negative.
Escludere dall'analisi qualsiasi pozzo inferiore a 10.000 goccioline totali. Passare alla scheda Ampiezza 1D ed esaminare le ampiezze delle goccioline positive e negative. Assicurarsi che comprendono 2 popolazioni distinte.
All'interno del software, utilizzare la funzione di soglia per effettuare un taglio tra goccioline positive e negative per ogni sonda utilizzata. Una volta applicate soglie appropriate a tutti i pozzi, il software calcolerà il numero di copie del DNA in ogni reazione. Esportare i dati in un foglio di calcolo per facilitare ulteriori analisi.
Utilizzando questi valori, calcolare il numero di copia iniziale di ogni codice a barre genomico univoco nel campione. Determinare il tasso medio di falsi positivi dalle reazioni di controllo negativo e sottrarre questo valore dai valori ottenuti nelle reazioni sperimentali. Moltiplicare i valori in base alle diluizioni eseguite durante l'impostazione di ogni esperimento.
Ora, determinare l'idoneità relativa di un organismo calcolando l'indice competitivo o annullando l'indice competitivo dalla quantificazione digitale basata su PCR del ceppo codificato a barre. Eseguire questo passaggio per ogni deformazione codificata a barre in tutti i punti temporali. Il DNA genomico contenente il codice a barre AA è stato diluito sullo sfondo di tutti gli altri DNA genomici codificati a barre.
Il canale 1 rappresenta la sonda FAM per il codice a barre AA, mentre channel 2 rappresenta la sonda HEX per il codice a barre AO. I risultati di ogni sonda sono presentati sia come ampiezza fluorescente a goccia individuale che come istogramma che rappresenta la frequenza di intensità fluorescente di tutte le goccioline nei pozzi selezionati. Per ogni condizione, le goccioline positive e negative dovrebbero formare 2 popolazioni distinte.
Le popolazioni devono essere separate utilizzando la funzione soglie per definire goccioline positive e negative. I valori soglia variano a seconda delle sonde utilizzate, ma tutti i pozzi che utilizzano la stessa miscela di sonde dovrebbero avere soglie identiche. Nel caso di AA che è stato diluito, l'istogramma sembra rappresentare solo la singola popolazione perché le goccioline positive sono sostanzialmente in inferiorità numerica da goccioline negative.
Tuttavia, 2 popolazioni distinte sono ancora visibili esaminando l'ampiezza fluorescente delle goccioline nei pannelli di sinistra. Poiché il DNA genomico codificato a barre AA è stato diluito, c'è stata una diminuzione delle goccioline positive, mentre il numero di goccioline AO positive rimane costante. Una volta applicate soglie appropriate a tutti i pozzi, il software calcolerà il numero di copie del DNA in ogni reazione.
Se esegui regolarmente PCR come parte della tua ricerca, puoi eseguire questa tecnica per valutare la forma fisica del tuo organismo modello. Questa procedura sarebbe normalmente utilizzata per determinare i risultati finali degli esperimenti a monte. La sua vera utilità è quella di promuovere facilità e versatilità per qualsiasi esperimento che si basi sulla quantificazione batterica.
Stiamo usando questa tecnica per valutare la forma fisica della salmonella in un modello murino di infezione. Inoltre, questa tecnica viene adattata per l'uso con altri microrganismi patogeni nel nostro laboratorio.
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Panoramica
Questo approccio basato sulle molecole consente una quantificazione accurata dei microrganismi provenienti da popolazioni miste di ceppi simili utilizzando codici a barre di DNA genomico. Il protocollo facilita i confronti di fitness tra ceppi ed è adattabile per vari organismi geneticamente malleabili.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Microbiologia
- Biologia Molecolare
- Ingegneria Genetica
Sfondo
- La quantificazione dei microrganismi è cruciale per comprendere la fitness competitiva.
- I metodi tradizionali possono introdurre variabilità tra ceppi.
- La PCR digitale offre una soluzione ad alto rendimento per una misurazione accurata.
- Il codice a barre del DNA genomico consente l'identificazione unica dei ceppi.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per la quantificazione precisa della fitness batterica.
- Ridurre la variabilità nelle condizioni sperimentali tra ceppi.
- Fornire un protocollo flessibile applicabile a vari design sperimentali.
Metodi utilizzati
- Ingegnerizzazione di marcatori genetici sui cromosomi batterici.
- Creazione di un pool di DNA genomico con codici a barre unici.
- Utilizzo della PCR digitale per la quantificazione dei microrganismi.
- Valutazione degli indici competitivi tra diversi ceppi di Salmonella.
Risultati principali
- È stata raggiunta una quantificazione accurata dei microrganismi.
- È stata osservata una riduzione della variabilità nei confronti di fitness.
- Il metodo si è dimostrato adattabile a vari organismi geneticamente malleabili.
- Sono state dimostrate capacità ad alto rendimento.
Conclusioni
- Questa tecnica migliora l'accuratezza della quantificazione microbica.
- Consente confronti significativi di fitness tra ceppi.
- Il protocollo è versatile per diverse esigenze sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This digital PCR-based competitive index method addresses a key bottleneck in bacterial fitness assessment by enabling high-throughput, simultaneous quantification of multiple strains in a single competitive assay. By reducing well-to-well variability and eliminating dependence on phenotypic markers, the approach enhances predictive confidence in target validation and lead identification workflows. Its adaptability across genetically malleable organisms supports translational continuity from discovery through preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fitness differences between wild-type and mutant strains under identical conditions.
- Operational Value: Reduces experimental variability by pooling strains, minimizing well-to-well and organism-to-organism differences.
- Predictive Value: Provides sensitive detection of both high- and low-fitness variants, supporting accurate strain prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, barcode-specific readouts that enable precise comparison of microbial abundance across conditions.
- Operational Value: Uses digital PCR to deliver absolute quantification with high sensitivity and precision across a wide dynamic range.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated barcoded strain pools for reproducible, high-throughput fitness screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports extrapolation from in vitro competition to in vivo models, as demonstrated in murine Salmonella infection studies.
- Mechanistic De-risking: Allows fitness assessment in complex biological contexts, reducing uncertainty in virulence and pathogenesis studies.
- Scalability: Easily adaptable to other pathogens and experimental designs requiring absolute microbial quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling fitness assessment after strain engineering and before lead optimization, particularly in antimicrobial and virulence target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring competitive fitness of isogenic strains in controlled environments.
- Screening: Enables multiplexed fitness profiling of strain libraries through barcode-based quantification.
- Analytics: Generates absolute DNA copy number outputs that feed into competitive index calculations for fitness ranking.
- Translational Research: Connects in vitro fitness data to in vivo pathogenesis models, as shown in murine infection applications.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genomic barcoding platform applicable across multiple bacterial targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in fitness measurements by reducing technical noise and marker limitations.
- Operational Value: Enhances reproducibility and throughput through standardized digital PCR workflows and pooled strain formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision efficiency by delivering reliable fitness data with fewer replicates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on quantitative fitness profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic engineering to chromosomally integrate unique DNA barcodes without affecting fitness.
- Dependent on access to digital PCR instrumentation and compatible supermix for probe-based detection.
- Necessitates standardized thresholding and droplet analysis protocols across wells and experiments.
- Requires careful dilution series design and false positive rate subtraction from control reactions.
- Adaptation to new organisms depends on chromosomal modification efficiency and barcode insertion site neutrality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Validate the Sensitivity and Specificity of Each Primer-probe Set for Each Genomic Barcode Using Digital PCR
3:09
Analyze Digital PCR Data and Calculate Absolute Copy Numbers
4:52
Results: Representative Digital PCR Results of Diluted AA-barcoded gDNA
6:28
Conclusion
