Name: Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando limaging intravitale e lanalisi dei tessuti fissi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Scopri metodi per valutare la permeabilità vascolare dipendente da TMEM nel microambiente tumorale utilizzando imaging intravitale e analisi di tessuti fissi. Queste tecniche permettono di studiare la dissemiazione delle cellule tumorali in tempo reale.

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Ringraziamo l'Analytical Imaging Facility (AIF) dell'Albert Einstein College of Medicine per il supporto dell'imaging. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), il SIG 1S10OD019961-01, il Gruss-Lipper Biophotonics Center e il suo programma Integrated Imaging, e Ruth L. Kirschstein T32 per lo studio del microambiente tumorale (CA200561).

GSK ha co-scritto il manoscritto, ha eseguito l'imaging per le figure 1C e 3B, ha sviluppato un protocollo di analisi dei tessuti fissi e ha analizzato e interpretato tutti i dati; JMP ha co-scritto il manoscritto, ed eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 1B,2C e 3A; LB & AC ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la figura 2B; RJ ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 2A; JSC co-scrisse il manoscritto e analizzò e interpretò tutti i dati; MHO ha co-scritto il manoscritto e analizzato e interpretato tutti i dati; e DE ha eseguito l'intervento chirurgico e l'imaging intravitale per la Figura 2D, ha co-scritto il manoscritto, sviluppato l'analisi dei tessuti fissi e protocolli di imaging intravitale e analizzato e interpretato tutti i dati.

Gli autori non rivelano conflitti di interesse.

Qui, dedichiamo due protocolli che possono essere applicati per visualizzare e quantificare un tipo specifico di permeabilità vascolare che è presente alle porte TMEM ed è associato all'interruzione della stretta vascolare e aderisce giunzioni. Questo tipo di permeabilità vascolare è transitoria e controllata dal complesso cellulare TMEM tripartito, come spiegato sopra5. La capacità di identificare e quantificare la permeabilità vascolare associata al TMEM è fondamentale per la valutazione di un m...

I recenti progressi nella nostra comprensione della metastasi tumorale hanno scoperto che la transizione epiteliale-mesenchy (EMT) e l'induzione di una sottopopolazione di cellule tumorali migratorie/invasive non sono, di per sé, sufficienti per la diffusione ematogena 1. Infatti, in precedenza si pensava che metastasizzare le cellule tumorali intravasi attraverso l'intero endotelio associato al cancro, poiché la neovasculatura tumorale è spesso caratterizzata da una bassa copertura pericita, e come tale, è altamente permeabile e instabile2,3,4. Anche se altamente suggestivo di funzioni difettose all'interno del tumore, le modifiche vascolari durante la carcinogenesi non forniscono la prova di per sé che le cellule tumorali possono penetrare i vasi sanguigni facilmente e in modo incontrollato. Gli studi sull'imaging intravitale (IVI), in cui le cellule tumorali sono etichettate fluorescenti e la vascoliera è etichettata tramite l'iniezione endovenosa di sonde fluorescenti (come dextran o punti quantici), mostrano che, mentre i vasi tumorali sono uniformemente permeabile a basso peso molecolare dextrans (ad es. 70 kD), dextrans ad alto peso molecolare (155 kD) e le cellule tumorali possono attraversare l'endotelio solo in siti specializzati di intravasazione che sono preferibilmente situati al punto di diramazione vascolare5, 6 È possibile: , 7.Le analisi immunoistochimiche (IHC) utilizzando modelli animali e materiale di origine del paziente umano hanno dimostrato che questi siti sono "porte" specializzate nella regolazione della permeabilità vascolare, localmente e transitoriamente, fornendo una breve finestra di l'opportunità per le cellule tumorali migratorie/invasive di entrare nella circolazione. Queste porte sono chiamate "Microambiente tumorale di Metastasi" o "TMEM" e, molto a quanto pare, la loro densità è correlata a un aumento del rischio di sviluppare malattie metastatiche nei pazienti con cancro al seno8,9, 10.
Ogni porta TMEM è costituita da tre tipi distinti di cellule: un macrofago perivascolare, una cellula tumorale che sovraesprime il mammifero proteico actin-regulatory abilitato (Mena) e una cellula endoteliale, il tutto in contatto fisico diretto tra loro1, 5,9,10,11,12,13. L'evento chiave per la funzione del TMEM come porta d'intravasamento è il rilascio localizzato del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) sulla nave sottostante dal macrofaage perivascolare14. VEGF può interrompere le giunzioni omotipiche tra le cellule endoteliali15,16,17,18,19, un fenomeno che si traduce in perdite vascolari transitorie, anche noto come "bursting" permeabilità come descritto negli studi IVI 5. I macrofagi TMEM hanno dimostrato di esprimere il recettore della chinasi tirosina TIE2, che è necessario per la funzione TMEM mediata dal VEGF e l'homing di questi macrofagi alla nicchia perivascolare5,20,21 , 22.Oltre a regolare la diffusione e la metastasi delle cellule tumorali, è stato dimostrato che i macrofagi TIE2sono stati regolatori centrali dell'angiogenesi tumorale21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Come tale, i macrofagi TIE2 rappresentano un costituente critico del microambiente tumorale e il principale regolatore della cascata metastatica.
Per concettualizzare meglio la permeabilità vascolare mediata da TMEM (cioè "bursting"), è molto importante distinguerla da altre modalità di permeabilità vascolare che non sono associate alla dissoluzione delle giunzioni endoteliali cellula-cellula. In un endotelio intatto (uno le cui giunzioni strette e aderenti non sono interrotte), ci sono tre tipi principali di permeabilità vascolare: (a) pinocytosi, che può, o non può, essere accoppiato alla transcitosi del materiale ingerito; b) trasporto di materiale attraverso fenestrae endoteliali; e (c) trasporto di materiale attraverso il percorso paracellulare, che è regolato da giunzioni strette endote15,16,17,18,19,32 , 33 Mi lasa , 34.Sebbene deregolamentati in molti tumori, i suddetti modi di permeabilità vascolare sono stati descritti principalmente nel contesto della normale fisiologia tissutale e dell'omeostasi, i cui estremi sono tessuti con permeabilità limitata ( ad esempio, barriera emato-encefalica, barriera emato-prova), o abbondante permeabilità (ad esempio, capillari fenestrated dell'apparato glomerare renale)34,35,36,37.
Utilizzando l'imaging intravitale multifotone e la microscopia a immunofluorescenza multiplexata, siamo in grado di distinguere tra permeabilità vascolare mediata da TMEM ("bursting") e altre modalità di permeabilità vascolare nei tumori al seno. Per raggiungere questo obiettivo, eseguiamo una singola iniezione endovenosa di una sonda ad alto peso molecolare, con etichetta fluorescente nei topi. Gli eventi di scoppio spontaneo possono quindi essere catturati utilizzando l'imaging intravitale nei topi vivi; o, in alternativa, l'stravaganza della sonda può essere quantificata mediante studi di co-localizzazione convascolarizzazione del sangue (ad es. porte CD31 o Endomucin ) e TMEM utilizzando la microscopia a immunofluorescenza. I protocolli qui presentati descrivono entrambe queste tecniche, che potrebbero essere utilizzate in modo indipendente o in combinazione tra loro.

<table><tbody><tr><td>IgG anti-coniglio (Alexa 488)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-ratto (Alexa 647)</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Citrato</td><td>Eng Scientific Inc</td><td>9770</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass Slips Microscopia Elettronica</td><td>Scienze</td><td>72296-08</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo cianoacrilato</td><td>Adesivo Henkel</td><td>1647358</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1490</td><td></td></tr><tr><td>Destrano-Tetrametil-Rodamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Endomucina (anticorpo primario)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-65495</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacina</td><td>Bayer</td><td>84753076 V-06/2015</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina di pelle di pesce</td><td>Fisher Scientific</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da insulina</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB40234</td><td>Matrice extracellulare artificiale</td></tr><tr><td>Ago (30 G)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>PBS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>Pulsossimetro BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>Kent</td><td>Scientific</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet Unguento</td><td>Dechra</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Dots</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>Q21561MP</td><td></td></tr><tr><td>Rubber</td><td>McMaster Carr</td><td>1310N14</td><td></td></tr><tr><td>TMR (anticorpo primario)</td><td>Invitrogen</td><td>A6397</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biologicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>184835</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da metastasi doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

La causa più comune della mortalità correlata al cancro è la metastasi, un processo che richiede la diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario ai siti secondari. Recentemente, abbiamo stabilito che la diffusione delle cellule tumorali nel cancro mammario primario e nei siti metastatici nel polmone si verifica solo nelle porte chiamate Microambiente tumorale di Metastasi (TMEM). Il numero di porta TMEM è prognostico per una recidiva a distanza di malattia metastatica nei pazienti affetti da cancro al seno. Le porte del TMEM sono composte da una cellula tumorale che esprime eccessivamente la proteina regolatore di actina Mena a diretto contatto con un macrofago perivascolare e proangiogenico che esprime alti livelli di TIE2 e VEGF, dove entrambe le cellule sono strettamente legate a un sangue cellula endoteliale della nave. Le cellule tumorali possono invadere attraverso le porte TMEM a causa della permeabilità vascolare transitoria orchestrata dall'attività congiunta del macrofagio associato al TMEM e della cellula tumorale che esprime Mena associata al TMEM. In questo manoscritto vengono descritti due metodi per la valutazione della permeabilità vascolare transitoria mediata tramite TMEM: l'imaging intravitale e l'immunofluorescenza dei tessuti fissi. Anche se entrambi i metodi hanno i loro vantaggi e svantaggi, la combinazione dei due può fornire le analisi più complete della permeabilità vascolare mediata da TMEM e dei prerequisiti microambientali per la funzione TMEM. Poiché il processo metastatico nel cancro al seno, e possibilmente altri tipi di cancro, coinvolge la diffusione delle cellule tumorali attraverso porte TMEM, è essenziale impiegare metodi ben consolidati per l'analisi dell'attività delle porte TMEM. I due metodi qui descritti forniscono un approccio globale all'analisi dell'attività della porta TMEM, sia in animali ingenui che farmacologicamente trattati, il che è di fondamentale importanza per le sperimentazioni precliniche di agenti che prevengono le cellule tumorali diffusione tramite TMEM.

Le procedure sperimentali descritte in questo articolo di protocollo sono brevemente riassunte e illustrate nella Figura 1A-C.
Per misurare la permeabilità vascolare mediata da TMEM ("attività di scoppio") e ridurre il rumore sperimentale da altri modi di permeabilità vascolare (cioè transcellulare e paracellulare, come spiegato nell'introduzione), abbiamo eseguito permeno (i.v.) iniezione di sonde ad alto peso molecolare, come 155 kDa Dextran, co...

Descriviamo due metodi per valutare la permeabilità vascolare transitoria associata al microambiente tumorale della funzione di metastasi (TMEM) e all'intravasazione delle cellule tumorali utilizzando l'iniezione endovenosa di peso molecolare elevato (155 kDa) dextran nei topi. I metodi includono l'imaging intravitale in animali vivi e l'analisi dei tessuti fissi utilizzando l'immunofluorescenza.

Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Queste tecniche complementari valutano e misurano la permeabilità della vascucolatura tumorale utilizzando Dextran ad alto peso molecolare. Il protocollo a tessuto fisso offre una copertura tumorale più ampia, è ad alta produttività e non richiede apparecchiature di imaging multifotono. D'altra parte, il protocollo di imaging intravitale offre informazioni in tempo reale sulla cinetica, la funzione e l'interazione dinamica delle cellule nel microambiente tumorale della metastasi o TMEM.Quindi i protocolli qui presentati consentono la misurazione diretta della permeabilità vascolare dipendente dal TMEM che è fortemente correlata con la diffusione delle cellule tumorali, quindi questi protocolli possono essere utilizzati per valutare il potenziale metastatico dei tumori. Per generare pezzi di tessuto tumorale adatti al trapianto, iniziare con l'eutanasia dei topi portanti di tumore come descritto nel protocollo di testo. Posizionare una piastra di Petri con mezzo di coltura cellulare DMEM/F12 sul ghiaccio nella cappa dei fumi.Portare il mouse sul cappuccio dei fumi e sanificare l'addome del topo con il 70% di alcol etilico. Utilizzando guanti sterili e strumenti chirurgici, rimuovere i tumori e metterli nella piastra di Petri. Tagliare il tumore a piccoli pezzi, scartando eventuali porzioni necrotiche mentre sono nella piastra di Petri.Per trapiantare i pezzi tumorali negli ospiti riceventi, anestetizzare i topi che sono stati allevati con macrofagi geneticamente ingegnerizzati e etichettati fluorescentmente come descritto nel protocollo di testo. Ridurre l'anestesia a circa il 3% di isofluorano e applicare un unguento oftalmico agli occhi del topo per evitare l'essiccazione. Rimuovere i capelli dalla quarta ghiandola mammaria del topo.Dopo aver pulito la pelle con antisettico, utilizzare strumenti sterilizzati per fare una piccola incisione di circa due o tre millimetri appena inferiore al quarto capezzolo. Sezionare fino a quando il cuscinetto grasso mammario è esposto. Prendi un pezzo tumorale dalla piastra di Petri e ricopri una matrice extracellulare artificiale.Trapiantare tumori sotto il quarto cuscinetto di grasso mammario. Chiudere l'incisione utilizzando adesivo cianoacrilato. Infine, aggiungere un millilitro di antibiotico enrofloxacina all'acqua potabile degli animali.Anestetizza il mouse e inserisci un catetere a vena di coda come descritto nel protocollo di testo. Fai un'incisione longitudinale della linea mediana iniziando immediatamente superiore ai genitali e porta l'incisione fino al livello dell'aspetto superiore della quarta ghiandola mammaria. Portare l'incisione trasversale all'aspetto superiore della quarta ghiandola mammaria.È fondamentale evitare di compromettere l'apporto di sangue a questo punto. Stabilizzare il lembo della pelle apporre un piccolo pezzo di gomma rigida che misura due per due centimetri sul lato della pelle del lembo. I tumori dovrebbero essere al centro dell'area stabilizzata dalla gomma.Applicare una piccola pellicola di cianoacrilato sul bordo esterno del telaio della finestra di imaging su misura. Ora applicare una piccola goccia di PBS al centro del vetro di copertura. Evitare il contatto tra il cianoacrilato sul telaio della finestra e il PBS sul vetro per evitare la polimerizzazione prematura del cianoacrilato.Asciugare il tessuto del lembo circostante con una salvietta da laboratorio. Apporre la piccola finestra di imaging sul lembo tissutale con il tumore al centro dell'apertura chiara. Trasferire il topo anestetizzato e il catetere della vena della coda allo stadio del microscopio.Prestare estrema cautela per assicurarsi che il catetere della vena della coda non cada. A questo punto, eseguire l'imaging intravitale a lungo termine come descritto nel protocollo di testo e nella nostra precedente pubblicazione JoVE. Per un'analisi della produttività più elevata e una maggiore copertura tumorale, utilizzare l'immunofluorescenza nel tessuto fisso per valutare la permeabilità vascolare mediata da TMEM.Per eseguire la colorazione dell'immunofluorescenza, preparare prima i campioni come descritto nel protocollo di testo, quindi eseguire il recupero dell'antigene riscaldando le sezioni immerse nel citrato vicino al punto di ebollizione per 20 minuti. Dopo aver lasciato raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 15-20 minuti, lavare i campioni in PBS tre volte per due minuti ciascuno lavaggio. Bloccare per 60-90 minuti nel tampone di blocco, quindi incubare campioni con una miscela di ratto primario e anticorpi rapidi che prendono di mira rispettivamente l'endomucina e la tetrametillrhodamina.Dopo l'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBST per due minuti ciascuno. Incubare campioni con una miscela di anticorpi secondari dell'asino contro Rat IgG e IgG rapido, quindi lavare i campioni tre volte in PBST per due minuti ciascuno. Eseguire una colorazione DAPI di routine e montare le diapositive utilizzando un supporto di montaggio duro privo di glicerolo.Conservare i campioni in un luogo buio fino alla scansione. Per ottenere risultati ottimali, scansionare le diapositive su uno scanner digitale a scorrimento intero. Per eseguire l'analisi delle immagini, acquisire 10 campi ad alta potenza per caso utilizzando qualsiasi software adatto alla patologia digitale.Salvare i canali endomucina e TMR separatamente come TIFF. Utilizzando ImageJ, carica i file TIFF e convertili in immagini a 8 bit. Soglia le immagini a 8 bit al livello del controllo negativo e genera due immagini binarizzate che mostrano le maschere endomucina e TMR.Dagli strumenti Binari, selezionate Riempi fori sulla maschera di endomucina. Generare l'immagine Dextran con soglia e salvarla come ROI Dextran. Inoltre, genera l'immagine di endomucina soglia e salvala come ROI vascolare e genera l'immagine dell'endomucina invertita e salvala come ROI extravascolare.Successivamente genera il ROI extravascolare intersecato e l'immagine ROI di Dextran e salvala come ROI Dextran extravascolare. Infine salva l'intera immagine come ROI tumorale. Dividi l'area del ROI di Dextran extravascolare per l'area del ROI tumorale e moltiplica per 100 per generare l'area percentuale che il Dextran extravascolare copre nell'intero tumore.Ripeti il processo per 10-20 campi ad alta potenza per caso e genera un Dextran extravascolare medio per ogni caso. Mostrata qui è l'immagine di una ghiandola mammaria sana e in via di sviluppo all'interno di un animale transgenico. La vascucolatura è etichettata da TMR Dextran in rosso, l'epitelio duttile mammario è etichettato dalla proteina fluorescente dendra2 in verde, e i macrofagi sono etichettati da una proteina fluorescente ciano.Al contrario, un carcinoma duttile invasivo trapiantato con etichetta dendra2 è mostrato in un animale con macrofagi e vasi etichettati. Il tessuto polmonare sano è stato visualizzato attraverso una finestra di imaging polmonare all'interno di un topo con vascucolatura etichettata. Le metastasi polmonari sono evidenti dopo l'iniezione di cellule tumorali in un animale transgenico con macrofagi e vascuri etichettati.Qui sono mostrati gli alambidi di un film di imaging intravitale time-lapsed di vasi neo-angiogenici con etichetta Dextran ad alto peso molecolare all'interno di un carcinoma invasivo trapiantato etichettato dendra2 del seno. La linea gialla punteggiata denota il contorno dell'area di perdita vascolare transitoria prima, durante e dopo l'evento di perdita. Una porta TMEM viene catturata nell'imaging dal vivo.L'immunofluorescenza multicanale mostra endomucina, Dextran ad alto peso molecolare, la loro immagine unita insieme a DAPI, così come il corrispondente vaso sanguigno sogliato e maschere extravascolari di Dextran. Viene mostrata anche la corrispondente sezione sequenziale dell'immunoistochimica TMEM. Il profilo vascolare lontano da TMEM appare come un profilo vascolare non perdente, mentre il profilo vascolare associato al TMEM appare come un profilo vascolare che perde.È molto importante evitare di tagliare i vasi sanguigni che forniscono il tumore durante l'esposizione chirurgica del tumore. La metodologia qui descritta può essere combinata con il trattamento farmacologico, lo stesso che inibisce la funzione TMEM, prevenendo la permeabilità vascolare o persino normalizzando la vascuolatura tumorale per misurarne l'impatto e l'efficacia. Con questi protocolli abbiamo precedentemente dimostrato che la chemioterapia migliora la permeabilità vascolare e la diffusione delle cellule tumorali e in realtà questi cambiamenti pro-metastatici possono essere aggirati co-somministrazione di inibitori della funzione TMEM.

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Valutazione del microambiente tumorale della permeabilità vascolare mediata da Metastasi Doorway associata alla dissemimassione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging intravitale e l'analisi dei tessuti fissi

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