Un saggio di assenza di stasse reattiva (DARTS) di affinità dei farmaci semi-quantitativa per studiare l'interazione tra Rapamicina e mTOR
August 27th, 2019
In questo studio, abbiamo migliorato le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l'affinità delle interazioni proteina-ligando. Le interazioni possono essere tracciate in due curve: una curva proteolitica e una curva di dipendenza da dose. Abbiamo usato l'interazione mTOR-rapamycin come caso esemplare.
La stabilità del bersaglio reattiva all'affinità del farmaco, DARTS, è un metodo robusto per il rilevamento di nuovi bersagli proteici di piccole molecole. Può essere utilizzato per verificare le interazioni proteiche note con piccole molecole e per trovare potenziali obiettivi proteici per i prodotti naturali. In questo studio, miglioriamo ulteriormente le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti nella stabilità delle proteine e stimando l'affinità delle interazioni proteina-ligando.
Le interazioni proteina-ligando possono essere tracciate su due curve, una curva proteolitica e una curva di dipendenza dalla dose. Abbiamo usato l'interazione mTOR-rapamicina come un caso esemplare per la definizione del nostro protocollo. Coltivare cellule 293T utilizzando DMEM con siero bovino fetale al 10%, glutammina bimolare e 1% antibiotici.
Incubare le colture a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Quando la coltura raggiunge l'80-90% di confluenza, lavare le celle due volte con PBS freddo. Utilizzare un raschietto per cellule per raccogliere le cellule in una quantità appropriata di tampone di lisi a celle fredde e trasferire le cellule lisci in un tubo da 1,5 millimetri.
Invertire per mescolare bene il tampone di lisi e le cellule lisci e incubare il tubo sul ghiaccio per 10 minuti. Centrifugare il tubo a 18.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e tenersi refrigerato sul ghiaccio.
Eseguire il saggio BCA per approssimare la concentrazione proteica dei lysati e calcolare la diluizione della pronasi in base alla concentrazione proteica. In primo luogo, trasferire il litolato in due tubi da 1,5 millilitri, 99 microlitri ciascuno. Aggiungere un microlitro di soluzione stock di piccole molecole a ciascuna aliquota di lisato e incubare i due tubi per 30-60 minuti a temperatura ambiente con scuotimento.
Sul ghiaccio, stabilire diluizioni seriali della soluzione di pronasi appena scongelata in 1x TNC. Dopo l'incubazione con la piccola molecola, dividere ogni aliquota in 20 microlitri di campioni in cinque tubi. Per garantire lo stesso tempo di digestione, ad intervalli specifici ogni 30 secondi, aggiungere due microlitri delle soluzioni di pronasi preparate ai campioni di conseguenza.
Per un gruppo di controllo, aggiungere due microlitri di buffer TNC. Dopo cinque o 20 minuti, interrompere la digestione dei sei tubi attraverso l'aggiunta di due microlitri di cocktail inibitore della proteasi fredda 20x a intervalli di 30 secondi. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 10 minuti.
Diluire ogni campione con sei microlitri di tampone di carico 5x SDS-PAGE e far bollire i campioni in un bagno d'acqua a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Ora, per eseguire western blot, caricare quantità uguali di proteine nei pozzi di un gel 8%SDS-PAGE, insieme a un indicatore di peso molecolare appropriato. Far funzionare il gel per 30 minuti a 80 volt, quindi regolare la tensione a 120 volt e continuare a funzionare per una o due ore.
Verificare che la piccola molecola possa legarsi direttamente alle potenziali proteine bersaglio. In questo protocollo, l'incubazione con la piccola molecola ha confermato la protezione contro la proteolisi. Tre bande sono state trovate protette dall'incubazione con rapamicina sul controllo del veicolo.
L'assorbimento occidentale ha illustrato la presenza di proteine mTOR a basso rapporto pronasi/proteine e la sua riduzione e perdita con rapporti crescenti. La proteolisi di mTOR per pronasi era chiaramente inibita dalla presenza di rapamicina e l'aggiunta di rapamicina generò un evidente spostamento nella curva proteolitica. Rapamicina dose-dipendente ha migliorato il livello di mTOR, suggerendo la crescente stabilità di mTOR con trattamento con rapamicina.
La quantificazione delle intensità della banda proteica target ha suggerito che mTOR è la proteina bersaglio della rapamicina. Per ottenere il miglior effetto graduale, questo esperimento potrebbe essere necessario ripetuto più volte per ottenere una gamma adeguata di pronasi rispetto ai rapporti proteici.
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Panoramica
Questo studio migliora le capacità di analisi dei dati dell'esperimento DARTS monitorando i cambiamenti di stabilità proteica e stimando le affinità delle interazioni proteina-ligando. L'interazione mTOR-rapamicina serve come caso esemplare per questa analisi.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Farmacologia
Sfondo
- DARTS è un metodo per rilevare i bersagli proteici delle piccole molecole.
- Verifica le interazioni proteiche con molecole piccole note.
- DARTS può identificare potenziali bersagli proteici per prodotti naturali.
- Le interazioni proteina-ligando possono essere visualizzate attraverso curve specifiche.
Scopo dello studio
- Migliorare l'analisi dei dati negli esperimenti DARTS.
- Monitorare i cambiamenti nella stabilità proteica.
- Stimare le affinità delle interazioni proteina-ligando.
Metodi utilizzati
- Monitoraggio dei cambiamenti di stabilità proteica.
- Stima delle affinità delle interazioni proteina-ligando.
- Tracciamento delle interazioni su curve proteolitiche e di dose-dipendenza.
- Utilizzo di mTOR-rapamicina come caso di studio.
Risultati principali
- Analisi migliorata della stabilità proteica in DARTS.
- Stima riuscita delle affinità delle interazioni proteina-ligando.
- Visualizzazione delle interazioni attraverso curve specifiche.
- Dimostrazione del metodo utilizzando mTOR-rapamicina.
Conclusioni
- Lo studio migliora la metodologia DARTS per una migliore analisi.
- La stabilità proteica e le affinità di interazione possono essere efficacemente monitorate.
- I risultati possono aiutare nell'identificazione di nuovi bersagli proteici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The enhanced DARTS assay provides a label-free, native-state approach to validate small-molecule target engagement, supporting early-stage target de-risking. By quantifying binding affinity through proteolytic and dose-dependent curves, it enables mechanistic confidence in hit-to-lead progression. This method aids in prioritizing compounds with validated target interactions, reducing attrition due to false positives in downstream screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Confirms direct target engagement of small molecules like rapamycin with mTOR in native lysates.
- Operational Value: Uses unmodified compounds, avoiding artifacts from tags or labels that may alter binding.
- Predictive Value: Enables affinity estimation to triage hits based on target residence and stability shifts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative proteolytic and dose-response curves for hit confirmation.
- Reproducibility: Standardized workflow with defined pronase titration and inhibitor quench points.
- Scalability: Compatible with multi-well formats for testing compound libraries against purified or cellular targets.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated target engagement in cellular lysates supports extrapolation to intact systems.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes specific binding from nonspecific proteolysis inhibition via dose-dependent stabilization.
- Preclinical Alignment: Confirmed mTOR-rapamycin interaction provides a benchmark for pathway-targeted compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between primary hit confirmation and lead optimization, offering biophysical validation before cellular functional assays.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring ligand-induced stability shifts in native protein pools.
- Screening: Confirms target engagement of hits from biochemical or phenotypic screens using endogenous protein.
- Analytics: Provides affinity estimates from dose-dependence curves and stability changes from proteolytic profiles.
- Translational Research: Uses cellular lysates to maintain native protein complexes and post-translational states.
- Enterprise Reuse: Platform adaptable to diverse targets and ligands without reagent redesign.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Direct measurement of target stabilization enables objective assessment of ligand efficacy.
- Operational Value: Simple workflow using standard lysis, protease digestion, and Western blot infrastructure.
- Strategic Value: Reduces false advancement by confirming target binding early in the discovery cascade.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions based on quantitative target engagement metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Western blotting and quantitative band analysis.
- Dependent on access to pronase and protease inhibitor cocktails for controlled digestion.
- Needs standardization across labs for consistent pronase:protein ratios and incubation times.
- Adaptation to membrane or complex targets may require optimization of lysis conditions.
- Practical limitation: Semi-quantitative nature requires replicate runs for reliable affinity estimation.
